本发明涉及一种利用玉米蛋白制备具有高抗氧化活性玉米糖肽的方法。属于农产品深加工领域。
背景技术：
玉米是我国重要的农作物之一，种植历史早，种植面积大，年产量超过2.2亿吨。玉米曾是人类最重要的一种食物来源，随着人们生活水平的不断提高，玉米的主食地位已经逐渐被其它种类繁多的食品所取代，致使玉米的主要用途从食用转向了工业利用。
玉米黄粉（Corn Gluten Meal, CGM），是湿法玉米淀粉加工中产量最大、蛋白质含量最高的副产物。玉米黄粉中约含62-71%的蛋白质，其主要组分是玉米醇溶蛋白（65-68%）和谷蛋白（22-33%），还有少量的球蛋白（1.2%）和白蛋白。由于玉米蛋白具有氨基酸组成不平衡、水溶性差等特点，限制了其在食品工业中的应用。目前，主要作为饲料使用。如果能对玉米蛋白进行改性并应用于食品工业，则玉米蛋白的市场价值将大大提高。
近年来, 对玉米蛋白的研究工作主要集中在用蛋白酶切割释放其功能性和具有生理功能性肽段的分离与分析方面。
在用蛋白酶酶切玉米蛋白使其生理功能性有效释放方面，采用多种蛋白酶单独或协同酶切玉米蛋白, 使玉米蛋白溶解性显著增加、加工性能显著提高的同时, 玉米蛋白水解物表现出促进乙醇代谢、抗氧化、抗高血压等生物活性。具有抗氧化活性的玉米蛋白水解物，可以作为天然抗氧化剂应用于食品工业，防止食品发生氧化变质；也可以作为保健食品基料，显著降低机体内自由基的水平，在维持健康和预防疾病方面发挥重要作用。
但是，利用蛋白酶水解玉米蛋白提高其生理功能性的方法普遍存在的问题是：随着酶解反应的进行, 一些疏水性氨基酸基团暴露在肽段一端, 玉米蛋白水解物呈现一定苦味, 苦味值与肽段一端的疏水性氨基酸基团数呈正相关。如果降低蛋白水解程度, 其苦味显著降低, 但是又会带来反应转化率低、玉米蛋白生理功能的释放程度不够的问题。
技术实现要素：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种新型的、具有抗氧化活性的玉米糖肽，该产品不仅可以为玉米蛋白提供一条有效的利用途径，而且这种玉米糖肽还具有安全性高、抗氧化活性高、苦味值低等优点。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种该抗氧化活性玉米糖肽的制备方法。
本发明产品抗氧化活性玉米糖肽是先用蛋白酶水解玉米蛋白获得玉米肽混合物，再向反应体系中加入壳寡糖和转谷氨酰胺酶，利用转谷氨酰胺酶催化玉米肽与壳寡糖之间的糖基化反应，制备出具有高抗氧化活性的玉米糖肽。在浓度为2mg/mL时，玉米糖肽的还原力、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和Fe2+-螯合率分别为0.962、66.7%、19.37%和81.28%，分别比糖基化反应前的玉米肽高0.707、20.8%、16.45%和20.21%。另外，转谷氨酰胺酶催化多肽链中谷氨酰胺γ-酰胺基与氨基糖的共价交联反应，生成以谷氨酰胺-糖为基本单位的N-型糖肽，该类糖肽的基本结构与常见的N-型糖肽（天冬酰胺的侧链酰胺基与乙酰氨基葡萄糖通过一个β-N-糖苷键连接构成）和O-型糖肽（糖与肽链中的羟基氨基酸通过O-糖苷键相连）的基本结构均不同，与美拉德反应生成的Shiff碱式糖蛋白/糖肽（碳水化合物的醛基与蛋白质的氨基缩合反应）也不同，是一类新型的糖肽。
本发明所使用的蛋白酶具有高度的安全性，符合FAO/WHO/JECFA/FCC推荐的食品级酶制剂标准。微生物来源的转谷氨酰胺酶属于酰基转移酶，在食品工业中被广泛应用于乳制品及肉类加工中。这两种类型的酶在国内均已能工业化生产，价格便宜，适应本发明水解玉米蛋白和制备高抗氧化活性糖肽的要求。
本发明产品抗氧化活性玉米糖肽是先用蛋白酶水解玉米蛋白获得玉米肽混合物，再后向反应体系中加入壳寡糖和转谷氨酰胺酶，利用转谷氨酰胺酶催化玉米肽与壳寡糖之间的糖基化反应，制备出新型的、具有高抗氧化活性的玉米糖肽。
本发明产品制备的具体方法：
1、玉米肽的制备
蛋白酶在最适水解条件下或限制水解条件下水解玉米蛋白，制备玉米肽混合物。
2、玉米糖肽的制备
向制备好的玉米肽混合物中添加壳寡糖，保证反应体系中蛋白质酰基供体与壳寡糖酰基受体的摩尔比为1:1-1:5。搅拌使壳寡糖彻底溶解，用2mol/L NaOH调初始pH至7.0-8.0。按添加量为40-80U/g蛋白加入转谷氨酰胺酶，放入30-45℃恒温水浴振荡器中开始糖基化反应。糖基化反应5-10h后立即于85℃水浴中灭酶5min。冷却至室温，样品经离心分离获取上清液，上清液冷冻干燥后获得具有高抗氧化活性的玉米糖肽。
本发明的有益效果是：本发明将蛋白酶酶切法与酶法糖基化反应有机结合起来，在合理控制玉米蛋白水解物苦味的基础上，使反应产物的抗氧化活性得到更多的释放与提高。在浓度为2mg/mL时，新型玉米糖肽的还原力、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和Fe2+-螯合率分别为0.962、66.7%、19.37%和81.28%，分别比糖基化反应前的玉米肽高0.707、20.8%、16.45%和20.21%。因此，新型玉米糖肽具有预防疾病、抗衰老等功能，可以用作保健食品基料或食品、化妆品等添加剂使用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。以下具体实施方式仅用于说明本发明，并非用以限定本发明的范围，本发明的以下实施实例还可以做出各种变化。在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
图1是本发明的生产工艺流程图。
具体实施方式
实施例1：
1、玉米肽的制备
取3g玉米醇溶蛋白于150mL烧杯中，加入100mL蒸馏水，配制成底物浓度为3%（w/v）的悬浮液，加入大小合适的转子后将烧杯放入60℃水浴磁力搅拌器中央，将pH计电极插入悬浮液中，用移液枪少量多次加入0.5mol/L NaOH调pH至8.5，立即加入0.09g Alcalase碱性蛋白酶开始酶解反应。酶解过程中，通过不断滴加0.5mol/L NaOH使pH维持在8.5，酶解120min后取出立即放入沸水浴中灭酶10min。
2、玉米糖肽的制备
（1）向制备好的3%玉米肽混合物中添加壳寡糖（脱乙酰度＞90%，平均分子量1500Da），保证反应体系中蛋白质酰基供体与壳寡糖酰基受体的摩尔比为1:3。搅拌使壳寡糖彻底溶解，用2mol/L NaOH调初始pH至7.7。
（2）按添加量为60U/g蛋白称取转谷氨酰胺酶，放于离心管中，移取1mL蒸馏水，上下颠倒摇匀。将酶液加入到玉米肽混合物中，放入37℃恒温水浴振荡器中开始糖基化反应。
（3）糖基化反应8h后立即于85℃水浴中灭酶5min。
（4）冷却至室温，样品经4000r/min离心15min，取上清液放于超低温冰箱中冻结，冷冻干燥48h，获得新型玉米糖肽。
实施例2：
1、玉米肽的制备
取5g玉米黄粉于150mL烧杯中，加入100mL蒸馏水，配制成底物浓度为5%（w/v）的悬浮液，加入大小合适的转子后将烧杯放入60℃水浴磁力搅拌器中央，将pH计电极插入悬浮液中，用移液枪少量多次加入0.5mol/L NaOH调pH至8.5，按加酶量E/S=0.5%加入碱性蛋白酶Alcalase开始酶解反应。酶解过程中，通过不断滴加0.5mol/L NaOH使pH维持在8.5，当消耗的NaOH的体积为600μL时酶解反应结束，取出放入沸水浴中灭酶10min。
2、玉米糖肽的制备
（1）向制备好的5%玉米肽混合物添加壳寡糖（脱乙酰度75%，平均分子量1000Da），保证反应体系中蛋白质酰基供体与壳寡糖酰基受体摩尔比为1:4。搅拌使壳寡糖彻底溶解，用2mol/L NaOH调初始pH至7.5。
（2）按添加量为80U/g蛋白称取转谷氨酰胺酶，放于离心管中，移取2mL蒸馏水，上下颠倒摇匀。将酶液加入到玉米肽混合物中，放入37℃恒温水浴振荡器中开始糖基化反应。
（3）糖基化反应6h后立即于85℃水浴中灭酶5min。
（4）冷却至室温，样品经4000r/min离心15min，取上清液放于超低温冰箱中冻结，冷冻干燥48h，获得新型玉米糖肽。