本发明属于农产品精深加工及其副产品综合利用技术领域，具体涉及一种以玉米源抗氧化肽为原料制备的抗氧化滴丸及其制备方法。
背景技术：
玉米蛋白粉是玉米籽粒经湿磨法工艺生产玉米淀粉所产生的副产物，由于其水溶性差、利用率低、营养价值低等不足，限制了在食品工业中的应用，大多被用于饲料或作为废弃物排掉。玉米抗氧化肽的开发为玉米蛋白粉的利用提供了新的途径，极大地推动了玉米深加工产业发展。同时，随着国内外保健食品市场的不断扩展，开发新型玉米功能性肽类保健食品对提高人们的健康水平和促进功能性食品工业的发展具有重要的社会意义和经济效益。
玉米蛋白粉中的蛋白质主要为醇溶蛋白和谷物蛋白，另有少量的球蛋白和白蛋白。研究发现，玉米蛋白粉可用以制备高F值低聚肽、降血压肽和抗氧化肽等蛋白肽。代衍峰等研究报道(代衍峰，何志勇，陈洁，等.抗氧化性玉米肽的分离纯化及其性质[J].科研开发，2008，24(5):5–8.)，采用DPPH自由基清除率法可以测定经分离纯化后的玉米抗氧化肽活性。徐力(徐力，李相鲁，黄宜兵，等.小分子玉米肽Leu–ASp–Tyr–Glu保护线粒体抗氧化损伤的研究[J].高等学校化学学报，2004，25:1073–1075.)等报道了小分子玉米抗氧化肽Leu-Asp-Tyr-Glu可以作为一种新型抗氧化剂，能够有效清除自由基和抑制心肌线粒体损伤的作用。
凝胶色谱分离技术是通过相对分子质量和分子量的不同而获得目标产物，具有分离条件温和、重复性高、回收率高、设备简便经济等优点，是目前应用比较广泛的分离技术之一。肽经过凝胶色谱分离后，获得了不同抗氧化活性的肽段。本发明利用玉米抗氧化肽分离制备高活性因子，提供了一种具有抗氧化活性的玉米源肽的制备方法。
技术实现要素：
本发明所需要解决的技术问题是提供一种以玉米源蛋白肽为原料制备的抗氧化滴丸及其制备方法，其特征在于采用玉米源高抗氧化活性因子，获得外观形态优质(硬度强、圆整度饱满、无拖尾)、溶散时限短、丸重差异小的玉米源抗氧化肽滴丸。
本发明所述的玉米源抗氧化肽滴丸的制备方法，其包括利用SephadexG-25凝胶色谱分离处理、真空冷冻干燥、基质调配、冷凝剂调配、滴丸制备、冷却烘干等步骤，从而得到外观形态优质(硬度强(大力按压不变型)、圆整度饱满、无拖尾、溶散时限7min以下、丸重差异0.2g以下，在三维横径中，任意二维横径之差在0.2～0.5mm以内，具体步骤如下：
1)SephadexG-25凝胶色谱分离处理：首先将SephadexG-25凝胶与蒸馏水混合，体积比为1:3～1:5；然后于室温下溶胀2～5h，再于沸水下溶胀0.5h～2h；将得所凝胶在2℃～6℃条件下注入到SephadexG-25凝胶色谱仪的层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶5cm～10cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平；紫外检测器的波长为280nm，玉米源蛋白肽粉(学位论文：王可，玉米蛋白资源高效利用开发抗氧化肽的关键技术研究[D].吉林大学，2014)溶液在280nm吸收波长下有最大吸收值，紫外检测器用来追踪肽粉溶液的吸光度随时间的变化，直观的显示出经纯化后可以得到三个不同组分的玉米源抗氧化肽液；将玉米源蛋白肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL～60mg/mL，将所得肽粉溶液经0.45μm滤膜过滤；肽粉溶液的上样体积为0.5mL～5mL，控制流速1mL/min～3mL/min，收集3个不同组分的纯化后的玉米源抗氧化肽液；
2)真空冷冻干燥：将步骤1)得到的不同组分的纯化后的玉米源抗氧化肽液分装于冷冻盘中，厚度10～20mm，在-75～-80℃条件下预冻5～6h，然后在-30～-45℃条件下冻干10～24h，即得到不同组分的纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉，分别测定DPPH自由基清除率，收集DPPH自由基清除率最高的玉米源抗氧化肽冻干粉组分；
DPPH自由基清除率的测定：将不同组分的纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉分别用蒸馏水配制为质量浓度为10mg/mL的测试液，采用96孔板，依次加入100μL测试液、100μL甲醇及100μL、0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，将96孔板放在微量震荡器上震荡1min，使反应液混合均匀，在环境温度为25℃条件下避光反应30min，用酶标仪在515nm处测定其吸光度AS；相同条件下，用100μL甲醇代替测试液作为空白对照，测定其吸光度AB，DPPH清除率计算公式如下：式中：AB为200μL甲醇与100μL、0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液的吸光度；AS为100μL测试液、100μL甲醇与100μL、0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液的吸光度；分别测定每个组分的玉米源抗氧化肽粉的DPPH自由基清除率；
3)基质调配：将聚乙二醇4000与聚乙二醇6000以质量比2：3～1：1的比例混匀；
4)冷凝剂调配：将液体石蜡与二甲基硅油以体积比1：2～2：1的比例混匀；
5)滴丸制备：将步骤3)得到的基质水浴加热至熔融状态，保持温度为70～80℃，30～35min后将步骤2)得到的DPPH自由基清除率最高的玉米源抗氧化肽冻干粉组分加入熔融态的混合基质中，混匀，保持温度不变，DPPH自由基清除率最高的玉米源抗氧化肽冻干粉与混合基质的质量比为1：5～1：10；将以上熔融混合物置入滴丸机漏斗中，设置滴丸机参数，滴距5～10cm、滴速20～45滴/min，滴入2～8℃的冷凝剂中，获得滴丸；
6)脱去冷凝剂：将步骤5)得到的滴丸在功率0.70～1.0kw、离心转速2000～3000rpm的条件下离心，将滴丸外部的冷凝剂脱去，自然干燥，从而得到本发明所述的玉米源抗氧化肽滴丸。
前面内容中所述的玉米源蛋白肽粉的分子量在10kDa～30kDa之间，蛋白质含量为70～85％，水解度为40～50％。
本发明的技术优势主要体现在以下两个方面：
第一，申请的专利技术是以滴丸化制备技术为核心技术。特别强调的是，将滴丸化制备技术应用于玉米源蛋白肽的功能活性保护的研究中，其技术优势突出体现于：
(1)利用滴丸化技术制备玉米源功能活性肽滴丸，可获得溶散时限7min以下；丸重差异0.2g以下；形状类圆形，在三维横径中，任意二维横径之差在0.2～0.5mm；完全不产生拖尾现象且硬度强的滴丸产品。
(2)选用的滴丸基质、冷凝剂材料安全，更适合玉米天然、高附加值的产品开发主题。
(3)区别于以往食源性功能肽活性保护常见方法，滴丸化制备技术可实现连续工业化生产，操作简便，设备简单，工艺周期短，生产效率高，生产车间无粉尘，利于环境保护。
第二，申请的专利技术是以分子量在10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽为原料，具有来源广泛、原料成本低廉且易获取的特点。
第三，申请的专利技术采用SephadexG-25凝胶色谱分离处理技术，以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标，对分子量10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽进行分离纯化。
(1)本专利采用的SephadexG-25凝胶色谱分离技术是通过相对分子质量和分子量的不同而获得目标产物，分离条件温和、重复性高、回收率高、设备简便经济。SephadexG-25凝胶色谱分离技术处理获得的玉米源抗氧化活性肽，具有纯化度高的优点
(2)本专利采用以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标，经测定，组分Ⅲ为抗氧化高活性因子，所获得的DPPH自由基清除率为80％～85％左右。
综上所述，纵观国内外相关研究与技术报道，未见利用SephadexG-25凝胶色谱分离和滴丸化制备技术对分子量在10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽进行活性保护，获得外观形态优质(硬度强、圆整度饱满、无拖尾)、溶散时限为7min以下、丸重差异为0.2g以下的玉米源抗氧化活性滴丸。
附图说明
图1：为以分子量在10kDa～30kDa的玉米源蛋白肽为原料，进行SephadexG-25凝胶色谱分离技术得到的DPPH自由基清除率最高组分Ⅲ的凝胶色谱分离纯化图谱。结果显示，在280nm紫外检测波长检测下，得到3个分离组分，将其分别命名为组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ。其中Ⅲ的峰值最高，分离效果最明显。
具体实施方式
实施例1
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水混合，比例为1:3(v/v)，室温溶胀时间2h，沸水溶胀0.5h，将凝胶在2℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约5cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长为280nm，将分子量在10kDa～30kDa，蛋白质含量为80.2％，水解度为40.26％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL，将肽粉溶液经0.45μm滤膜过滤，上样体积为3mL，控制流速2mL/min，最终共收集到3个组分，进行真空冷冻干燥，将每个纯化后的玉米抗氧化肽液的组分分装于冷冻盘中，厚度10mm，在-75℃条件下预冻5h，然后在-45℃条件下冻干24h，即得到纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉。分别测定每个组分的DPPH自由基清除率，用蒸馏水将纯化后的玉米抗氧化肽冻干粉配制为质量浓度为10mg/mL的测试液，采用96孔板，依次加入100μL测试液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，将96孔板放在微量震荡器上震荡1min，使反应液混合均匀，在环境温度为25℃条件下避光反应30min，用酶标仪在515nm处测定其吸光度AS。相同条件下，用100μL甲醇代替测试液作为空白对照，测定其吸光度AB，DPPH清除率计算公式如下：式中：AB为200μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS为100μL测试液、100μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3个组分的DPPH自由基清除率分别为40.12％、48.57％、83.31％。收集DPPH自由基清除率最高的组分III，称量10g冻干粉备用。配制基质，称取PEG-4000 25g，PEG-6000 25g，混匀后备用。配制冷凝剂，称取液体石蜡1L，二甲基硅油1.5L，混匀后备用。将基质水浴加热至熔融状态，保持温度为80℃，30min后将DPPH自由基清除率最高的组分III加入熔融态的混合基质中，混匀，保持温度不变。将以上熔融混合物置入滴丸机漏斗中，设置滴丸机参数，滴距5cm、滴速45滴/min，滴入2℃的冷凝剂中，滴制成丸。将制备好的滴丸在功率0.75kw，离心转速为2000rpm条件下离心，将滴丸外部的二甲基硅油和液体石蜡脱去，保证滴丸干燥状态。按照《中国药典》规定，对滴丸进行测定。经测定，溶散时限为6.5min；丸重差异0.15g；形状类圆形，在三维横径中，任意二维横径之差在0.35mm；完全不产生拖尾现象且硬度强的玉米源抗氧化肽滴丸。
实施例2
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水混合，比例为1:4(v/v)，室温溶胀时间3h，沸水溶胀1h，将凝胶在3℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约7cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长为280nm，将分子量在10kDa～30kDa，蛋白质含量为83.5％，水解度为45.29％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL，将肽粉溶液经0.45μm滤膜过滤，上样体积为4mL，控制流速1mL/min，最终共收集到3个组分，进行真空冷冻干燥，将每个纯化后的玉米抗氧化肽液的组分分装于冷冻盘中，厚度15mm，在-76℃条件下预冻5.2h，然后在-40℃条件下冻干20h，即得到纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉。分别测定每个组分的DPPH自由基清除率，用蒸馏水将纯化后的玉米抗氧化肽冻干粉配制为质量浓度为10mg/mL的测试液，采用96孔板，依次加入100μL测试液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，将96孔板放在微量震荡器上震荡1min，使反应液混合均匀，在环境温度为25℃条件下避光反应30min，用酶标仪在515nm处测定其吸光度AS。相同条件下，用100μL甲醇代替测试液作为空白对照，测定其吸光度AB，DPPH清除率计算公式如下：式中：AB为200μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS为100μL测试液、100μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3个组分的DPPH自由基清除率分别为43.35％、49.43％、82.41％。收集DPPH自由基清除率最高的组分III，称量10g冻干粉备用。配制基质，称取PEG-400024g，PEG–600036g，混匀后备用。配制冷凝剂，称取液体石蜡1L，二甲基硅油1L，混匀后备用。将基质水浴加热至熔融状态，保持温度为75℃，31min后将玉米源蛋白肽粉末加入熔融态的混合基质中，混匀，保持温度不变。将以上熔融混合物置入滴丸机漏斗中，设置滴丸机参数，滴距6cm、滴速30滴/min，滴入5℃的冷凝剂中，滴制成丸。将制备好的滴丸在功率0.75kw，离心转速为2200rpm条件下离心，将滴丸外部的二甲基硅油和液体石蜡脱去，保证滴丸干燥状态。按照《中国药典》规定，对滴丸进行测定。经测定，溶散时限为6.8min；丸重差异0.16g；形状类圆形，在三维横径中，任意二维横径之差在0.5mm；完全不产生拖尾现象且硬度强的玉米源抗氧化肽滴丸。
实施例3
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水混合，比例为1:5(v/v)，室温溶胀时间4h，沸水溶胀1h，将凝胶在5℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约8cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长为280nm，将分子量在10kDa～30kDa，蛋白质含量为85.0％，水解度为41.38％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL，将肽粉溶液经0.45μm滤膜过滤，上样体积为3mL，控制流速2mL/min，最终共收集到3个组分，进行真空冷冻干燥，将每个纯化后的玉米抗氧化肽液的组分分装于冷冻盘中，厚度16mm，在-77℃条件下预冻5.5h，然后在-35℃条件下冻干18h，即得到纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉。分别测定每个组分的DPPH自由基清除率，用蒸馏水将纯化后的玉米抗氧化肽冻干粉配制为质量浓度为10mg/mL的测试液，采用96孔板，依次加入100μL测试液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，将96孔板放在微量震荡器上震荡1min，使反应液混合均匀，在环境温度为25℃条件下避光反应30min，用酶标仪在515nm处测定其吸光度AS。相同条件下，用100μL甲醇代替测试液作为空白对照，测定其吸光度AB，DPPH清除率计算公式如下：式中：AB为200μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS为100μL测试液、100μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3个组分的DPPH自由基清除率分别为42.28％、50.06％、83.54％。收集DPPH自由基清除率最高的组分III，称量10g冻干粉备用。配制基质，称取PEG-400030g，PEG–600040g，混匀后备用。配制冷凝剂，称取液体石蜡1L，二甲基硅油1.2L，混匀后备用。将基质水浴加热至熔融状态，保持温度为76℃，32min后将玉米源蛋白肽粉末加入熔融态的混合基质中，混匀，保持温度不变。将以上熔融混合物置入滴丸机漏斗中，设置滴丸机参数，滴距8cm、滴速35滴/min，滴入8℃的冷凝剂中，滴制成丸。将制备好的滴丸在功率0.75kw，离心转速为2500rpm条件下离心，将滴丸外部的二甲基硅油和液体石蜡脱去，保证滴丸干燥状态。按照《中国药典》规定，对滴丸进行测定。经测定，溶散时限为6.3min；丸重差异0.2g；形状类圆形，在三维横径中，任意二维横径之差在0.45mm；完全不产生拖尾现象且硬度强的玉米源抗氧化肽滴丸。
实施例4
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水混合，比例为1:5(v/v)，室温溶胀时间4.5h，沸水溶胀1.5h，将凝胶在4℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约6cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长为280nm，将分子量在10kDa～30kDa，蛋白质含量为82.2％，水解度为48.57％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL，将肽粉溶液经0.45μm滤膜过滤，上样体积为4mL，控制流速2.5mL/min，最终共收集到3个组分，进行真空冷冻干燥，将每个纯化后的玉米抗氧化肽液的组分分装于冷冻盘中，厚度17mm，在-78℃条件下预冻5.8h，然后在-38℃条件下冻干15h，即得到纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉。分别测定每个组分的DPPH自由基清除率，用蒸馏水将纯化后的玉米抗氧化肽冻干粉配制为质量浓度为10mg/mL的测试液，采用96孔板，依次加入100μL测试液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，将96孔板放在微量震荡器上震荡1min，使反应液混合均匀，在环境温度为25℃条件下避光反应30min，用酶标仪在515nm处测定其吸光度AS。相同条件下，用100μL甲醇代替测试液作为空白对照，测定其吸光度AB，DPPH清除率计算公式如下：式中：AB为200μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS为100μL测试液、100μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3个组分的DPPH自由基清除率分别为41.39％、50.05％、84.38％。收集DPPH自由基清除率最高的组分III，称量10g冻干粉备用。配制基质，称取PEG-400045g，PEG–600030g，混匀后备用。配制冷凝剂，称取液体石蜡1L，二甲基硅油1.3L，混匀后备用。将基质水浴加热至熔融状态，保持温度为78℃，34min后将玉米源蛋白肽粉末加入熔融态的混合基质中，混匀，保持温度不变。将以上熔融混合物置入滴丸机漏斗中，设置滴丸机参数，滴距9cm、滴速30滴/min，滴入7℃的冷凝剂中，滴制成丸。将制备好的滴丸在功率0.75kw，离心转速为2800rpm条件下离心，将滴丸外部的二甲基硅油和液体石蜡脱去，保证滴丸干燥状态。按照《中国药典》规定，对滴丸进行测定。经测定，溶散时限为7min；丸重差异0.12g；形状类圆形，在三维横径中，任意二维横径之差在0.38mm；完全不产生拖尾现象且硬度强的玉米源抗氧化肽滴丸。
实施例5
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水混合，比例为1:5(v/v)，室温溶胀时间5h，沸水溶胀2h，将凝胶在6℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约10cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长为280nm，将分子量在10kDa～30kDa，蛋白质含量为83.4％，水解度为42.85％的玉米源蛋白肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL，将肽粉溶液经0.45μm滤膜过滤，上样体积为5mL，控制流速3mL/min，最终共收集到3个组分，进行真空冷冻干燥，将每个纯化后的玉米抗氧化肽液的组分分装于冷冻盘中，厚度20mm，在-80℃条件下预冻6h，然后在-30℃条件下冻干10h，即得到纯化后的玉米源抗氧化肽冻干粉。分别测定每个组分的DPPH自由基清除率，用蒸馏水将纯化后的玉米抗氧化肽冻干粉配制为质量浓度为10mg/mL的测试液，采用96孔板，依次加入100μL测试液、100μL甲醇及100μL0.6mmol/L的DPPH甲醇溶液，将96孔板放在微量震荡器上震荡1min，使反应液混合均匀，在环境温度为25℃条件下避光反应30min，用酶标仪在515nm处测定其吸光度AS。相同条件下，用100μL甲醇代替测试液作为空白对照，测定其吸光度AB，DPPH清除率计算公式如下：式中：AB为200μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度；AS为100μL测试液、100μL甲醇与100μLDPPH甲醇溶液的吸光度。3个组分的DPPH自由基清除率分别为43.64％、44.65％、83.62％。收集DPPH自由基清除率最高的组分III，称量10g冻干粉备用。配制基质，称取PEG-400060g，PEG–600030g，混匀后备用。配制冷凝剂，称取液体石蜡1L，二甲基硅油1L，混匀后备用。将基质水浴加热至熔融状态，保持温度为70℃，35min后将玉米源蛋白肽粉末加入熔融态的混合基质中，混匀，保持温度不变。将以上熔融混合物置入滴丸机漏斗中，设置滴丸机参数，滴距10cm、滴速45滴/min，滴入8℃的冷凝剂中，滴制成丸。将制备好的滴丸在功率0.75kw，离心转速为3000rpm条件下离心，将滴丸外部的二甲基硅油和液体石蜡脱去，保证滴丸干燥状态。按照《中国药典》规定，对滴丸进行测定。经测定，溶散时限为6.9min；丸重差异0.18g；形状类圆形，在三维横径中，任意二维横径之差在0.26mm；完全不产生拖尾现象且硬度强的玉米源抗氧化肽滴丸。