玉米抗氧化活性肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及三个新的、高抗氧化活性的玉米肽及制备方法，属于食品生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 氧化反应在疾病产生过程中发挥重要作用，如癌症、衰老、动脉硬化、心血管疾病、 糖尿病、阿尔茨海默病等。这些负面健康状况的产生归因于细胞成分的氧化性损伤，如细胞 月吴、脂蛋白、酶和核酸等。在食品中，氧化反应也可以直接影响食品质量，通常与食品的风味 和质地的改变有关。氧化反应是自由基产生过量和/或内源性抗氧化成分消耗导致的。因 此，在机体和食品中抑制氧化反应和自由基的形成是非常重要的。适量摄入抗氧化剂可以 明显降低机体内的自由基水平，在保持身体健康和预防疾病发面发挥重要作用。同时，在食 品中掺入抗氧化剂可以保持食品的质量和营养。
[0003] 按照来源不同，抗氧化剂分为两种类型：合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。合成抗氧 化剂，如BHT、BHA、TBHQ等，被认为存在安全隐患，严重限制了其在食品工业的应用；而天然 抗氧化剂由于具有安全、高活性、易吸收、无副作用和分布广泛等优点而备受关注。目前，抗 氧化肽已经从许多食品蛋白中分离得到，如大豆蛋白、油菜籽蛋白、水稻胚乳蛋白、小麦胚 芽蛋白、大麦谷蛋白等。
[0004] 玉米黄粉（Corn Gluten Meal缩写CGM)为玉米湿法生产淀粉过程产量最大的副 产物，其内含约60%的蛋白质，由玉米醇溶蛋白（zein，68%)、谷蛋白（glutelin，22%)、球蛋 白（globulins，1. 2%)和白蛋白（albumin)组成。玉米黄粉虽然是一种资源丰富、成本低廉 的天然植物蛋白原料，但是由于其中赖氨酸和色氨酸的含量都不高，显然为一种非全营养 蛋白。另外，玉米黄粉所含的蛋白质难溶于水，组成又比较复杂，□感还十分粗糙，因此，无 论是在食品领域还是在饲料行业都很少有人问津。甚至有不少地方还将之与其它副产物一 起不加回收就白白地自然排放掉了，这不仅是对粮食资源的一种极大浪费，同时也对生态 环境造成了一定程度的污染。因此，如果能对玉米蛋白进行修饰并应用于食品工业，其市场 价值将大大增大。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供三个新的、高抗氧化活性的玉米肽，由于 该产品的生产原料是玉米黄粉，首先为这种长期被冷落、被遗弃的天然资源提供了一种有 效的利用途径，同时还开发出了三个具有防治疾病、抗衰老等功能，可以做为食品、医药、化 妆品等产品添加剂使用的抗氧化活性肽。本发明要解决的另一个技术问题是提供这三个新 的、高抗氧化活性玉米肽的制备方法。
[0006] 本发明产品新的、高抗氧化活性玉米肽是以经挤压膨化并去淀粉的玉米黄粉为原 料，加入一定比例的水配制底物浓度为10%的悬浊液，先接入碱性蛋白酶Alcalase酶解 75min，再接入风味蛋白酶Flavourzyme酶解50min，获得具有抗氧化活性的多肽混合物。 采用超滤、离子交换层析、凝胶层析和反相色谱法对该混合物进行分离，最后利用Q-T0F2测定抗氧化活性肽的氨基酸序列。化学合成后评估玉米肽的体外抗氧化活性，最终获得 三个新的、高抗氧化活性的玉米肽。玉米肽的氨基酸序列分别为：CSQAPLA、KSCAPLAS和 ADCGWPA。三者对DPPH自由基清除的IC5。值分别为0· 12 mg/mL、0· 13 mg/mL和0· 23mg/mL; 对超氧阴离子自由基清除的分别0. 39mg/mL、0. 41 mg/mL和0. 19mg/mL。
[0007] 本发明产品制备的具体方法： 1、玉米蛋白酶解液的制备 取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，加入一定比例的水配制底物浓度为10% (m/V)的悬浊液，先用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解条件为：加酶量2%，酶解温度 50°C，pH 7. 7,时间75 min;然后加入风味蛋白酶Flavourzyme进行协同酶解，酶解条件为： 加酶量5%，酶解温度53°C，pH 6. 4,时间50 min。酶解结束后酶解液在100°C条件下加热 10 min以钝化蛋白酶活力。酶解物在4000 r/min离心10 min弃沉淀，所得上清液为抗氧 化活性肽的混合物。
[0008]、玉米蛋白酶解液的超滤 采用截断分子量6kDa的超滤膜对玉米蛋白酶解液进行超滤处理，获得>6kDa截留 液和<6kDa透过液两种不同分子量的玉米肽组分。选择分子量<6kDa的透过液作为下 一步分离纯化的样品。
[0009] 、Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析 将超滤所得< 6kDa的透过液稀释10倍，10000r/min离心15min，取上清液过0. 22Mm的微孔滤膜，50mL滤液进行强阴离子交换层析（Φ1.6*30〇πι)。起始缓冲液：20mmol/LpH 8.5Tris-HCl，洗脱液：含lmolNaCl的 20mmol/LpH8.5Tris-HCl，梯度洗脱 15min，流 速：2mL/min，UV214nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活性，收集高活性部分备用。
[0010] 、Sephadex G-25凝胶过滤层析 将Q-Sepharose Fast Flow的高活力样品冷冻抽干后，用双蒸水溶解后进行凝胶层析 脱盐（Φ 1. 6*90 cm)，流速2. OmL/min，UV214nm处检测。同时进行分子量标定，标定用的标 准物质为杆菌肽(分子量1400Da)和还原型谷胱甘肽(分子量为600Da)。测定各管收集液的 抗氧化活性，收集分子量在600-1400 Da范围内且高活性部分备用。
[0011] 、反相色谱 ①半制备型反相色谱柱确定抗氧化肽的活性区域 称取20mgS印hadexG-25分离所得活性组分溶于1mL的2%乙腈水溶液中，用 0. 22μm微孔滤膜过滤，色谱柱的型号为ProntoSILC18(Φ10X250mm，10μm)，流速为 1. 5mL/min，流动相A为含0. 065%TFA的2%乙腈水溶液，流动相B为含0. 05%TFA的80% 乙腈水溶液，梯度洗脱60min。采用自动部分收集器收集开始出峰时的玉米肽组分，每管收 集3mL。测定每管样品的抗氧化活性，确定活性区域在8、11和13管。
[0012] ②分析型反相色谱柱分离抗氧化活性肽 将半制备反相色谱柱分离所得活性组分溶于2%乙腈水溶液中，进一步用分析柱进行 分离纯化，分析柱的柱型为XselectCSH(Φ4. 6X150mm，3. 5μπι)，检测波长为214nm， 流速为1mL/min，上样量为20μL。流动相A为含0. 065%TFA的2%乙腈水溶液，流动相 B为含0. 05%TFA的乙腈。
[0013] 管组分经过分析柱分离后，获得八个玉米肽，收集每个峰的峰尖部分进行抗氧化 活性测定，确定8-II、8-V和8-VE为主要抗氧化活性肽。
[0014] 管组分获得五个玉米肽，分别为11-1、11-11、11-111、11-IV和ll-ν?。收集每个 玉米肽的峰尖部分进行抗氧化活性的测定，确定ll-πι和11-VI为主要抗氧化活性肽。
[0015]管活性组分经分析柱分离获得九个峰，经与溶剂色谱图作比较，确定13-1、 13-111、13-VI、13-VE、13-VID为溶剂峰，13-II、13-IV、13-V、13-IX为 13管的玉米抗氧化 肽。通过测定四个玉米肽峰尖部分的抗氧化活性，确定13-V为主要玉米抗氧化肽。
[0016]、质谱测序： 将反相色谱分离出来的8-II、8-V、8-VE、11-111、11-VI和13-V进行质谱测序，结果 如表1所示。
[0017] 表1六种玉米抗氧化肽的氨基酸序列信息
7、玉米抗氧化肽体外抗氧化活性的测定 将获得的六个玉米抗氧化肽进行化学合成后，测定对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基 的清除活性和还原力，最终获得三个新的、高抗氧化活性的玉米肽。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明产品具有较高的抗氧化活性，经测定CSQAPLA、 KSCAPLAS和ADCGWPA三者对DPPH自由基清除的1C5。值分别为0· 12 mg/mL、0· 13 mg/mL和 0· 23mg/mL;对超氧阴离子自由基清除的1C5。值分别0· 39mg/mL、0. 41 mg/mL和0· 19mg/mL， 效果与抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽相当，可用作食品、医药、化妆品等产品添加剂使用。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明 图1是本发明的生产工艺流程图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1: 1、玉米蛋白酶解液的制备 取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，加入一定比例的水配制底物浓度为10% (m/V)的悬浊液，先用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解条件为：加酶量2%，酶解温度 50°C，pH 7. 7,时间75 min;然后加入风味蛋白酶Flavourzyme进行协同酶解，酶解条件为： 加酶量5%，酶解温度53°C，pH 6. 4,时间50 min。水解结束后酶解液在100°C条件下加热 10 min以钝化蛋白酶活力。酶解物在4000 r/min离心10 min弃沉淀，所得上清液为抗氧 化活性肽的混合物。
[0021] 、玉米蛋白酶解液的超滤 采用截断分子量6 kDa的超滤膜对玉米蛋白酶解液进行超滤处理，获得>6 kDa截留 液和<6 kDa透过液两种不同分子量的玉米肽组分。选择分子量<6 kDa的透过液作为下 一步分离纯化的样品。
[0022] 、Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析 将超滤所得< 6kDa的透过液稀释10倍，10000r/min离心15min，取上清液过0. 22Mm的微孔滤膜，滤液进行强阴离子交换层析（Φ1.6*30〇πι)。起始缓冲液：20mmol/LpH8. 5 Tris-HCl，洗脱液：含lmolNaCl的 20mmol/LpH8· 5