本发明涉及抗氧化钛制备技术领域，具体是一种雪蛤抗氧化肽的制备方法。
背景技术：
近年来大量的研究表明，从各种海洋生物蛋白水解液中分离得到的多肽，具有潜在的抗氧化能力。目前国内外报道已从乌贼、牡蛎、蓝贻贝、长尾鳕、竹荚鱼及鳕鱼等海洋动物中分离得到抗氧化活性肽。这些海洋生物抗氧化活性肽能有效地清除机体内的自由基和活性氧或者通过阻断脂质过氧化过程中的自由基链式反应来预防因氧化而造成的机体损伤。
目前海洋生物活性肽的提取方法主要有3 种：溶剂萃取、微生物发酵和酶水解。由于酶水解法没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为食品和制药工业的首选方法。
现有技术如授权公告号为CN103540638B的中国发明专利，公开了一种利用鲣鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，其方法是：将富含蛋白的头尾段等副产物与蒸煮液组合粉碎，然后经同步三相分离，获得可直接酶解的蛋白源后，添加风味蛋白酶，在pH=6.5，50℃条件下酶解4h，酶解液再经超滤、活性炭吸附、脱盐进行纯化，并经喷雾干燥制备肽粉，检测其多种抗氧化活性，通过上述工艺获得的肽粉对DPPH 自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基具有良好的清除率，其IC50 分别为3.55mg/ml、1.39mg/ml 和0.61mg/ml，是优异的抗氧化剂。该方法制备的肽粉为淡黄色、无苦味、微鱼腥味，分子量（>90.1%）可控制为≤ 10000Da，多肽总蛋白质（以干基计）为88.6%，灰分为7.2%。该方法制备的肽粉中含油脂等杂质，抗氧化肽纯度不理想，没有采取保护多肽活性的措施，有一部分多肽结构会被破坏，失去活性；授权公告号为CN103497985B的中国发明专利，公开了一种核桃粕抗氧化肽及其制备方法，该方法利用核桃粕蛋白，通过酶法水解，得到蛋白酶解液，再利用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到十四种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。该方法所制得的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都约为粗肽的4 倍，而且肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。该方法操作繁琐，制备成本高，不适合工厂化生产。
技术实现要素：
本发明提供一种提取率高，操作简单，提取的雪蛤抗氧化肽纯度高，多肽活性强，抗氧化性强的制备方法。
本发明为解决上述背景技术中提出的问题所采取的技术方案为：
1）预处理：将雪蛤用冰水清洗3~5次，将泥沙和雪蛤表面的污渍清洁干净，在烘箱中干燥，干燥温度为70~90℃，干燥时间为40~60min，再用粉碎机粉碎，过200~300目筛。将雪蛤粉碎成粉末增大了比表面积，可以使脱脂和酶解反应更充分，也可缩短反应时间；
2）脱脂：在雪蛤粉中按照固液比1:2~1:5加入石油醚，并且石油醚中含有2~4%的丙酮和1~5%仲辛基酚聚氧乙烯醚，脱脂温度为60~80℃，搅拌速率为300~400r/min，反应时间为20~40min，得到固液分离液，用布氏漏斗进行抽滤，得到脱脂后的雪蛤粉。如果不进行脱脂的话，雪蛤粉中的油脂会和抗氧化钛一起提取出来，影响抗氧化钛的纯度，降低产品的抗氧化性；石油醚只溶油脂不溶蛋白质，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，从而提高雪蛤粉的脱脂率；
3）酶解：在脱脂后的雪蛤粉中按固液比1:3~1:5加入蒸馏水，搅拌均匀后加入酶解剂和添加剂，水浴加热，酶解温度为40~50℃，pH为6.0~7.1，搅拌速率为300~400r/min，反应时间为1.5~3h。使用酶水解雪蛤蛋白具有温和性，专一性和高效性的特点，酶解剂酶解后得到的多肽，空间结构不会被破坏，具有明显的抗氧化性；添加剂能保护水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏；
4）灭酶：酶解结束后，对酶解液进行沸水浴加热灭酶，灭酶时间为10~15min，，自然冷却终止酶解反应，过滤；
5）抗氧化肽制备：经反向高效液相色谱得到多种雪蛤蛋白水解后的产物，通过清除DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子自由基实验，挑选出抗氧化性强的几种多肽，测定其分子量。根据测定的分量大小选择适合的超滤膜进行超滤。真空低温浓缩滤液后喷雾干燥成多肽粉末，液体浓缩温度为20~30℃，真空度为-5~5pa，反应时间为30~50min。得到的多肽粉末中抗氧化肽含量高，抗氧化性强，能有效地清除机体内的自由基和活性氧或者通过阻断脂质过氧化过程中的自由基链式反应来预防因氧化而造成的机体损伤，经济效益高。
酶解剂成份及其重量份为：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份风味蛋白酶，1~3份硫酸镁，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氢钙，0.5~1.5份维生素A、2~5份十二烷基磺酸钠和和0.001~0.05份鲸蜡硬脂醇异壬酸酯。上述酶解剂酶解雪蛤蛋白条件温和，不会破坏多肽活性；酶解效率高，缩短了制备时间。
添加剂成分及其重量份为2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯酰胺，0.5~2份脂肪醇硫酸钠和3~6份山梨酸。上述添加剂能保护酶水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏。
与现有技术相比，本发明的优点在于：将石油醚作为雪蛤粉的脱脂剂，石油醚只溶油脂不溶蛋白质，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，从而提高雪蛤粉的脱脂率；酶解剂成份及其重量份为：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份风味蛋白酶，1~3份硫酸镁，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氢钙，0.5~1.5份维生素A和2~5份十二烷基磺酸钠，上述酶解剂酶解雪蛤蛋白条件温和，不会破坏多肽活性；酶解效率高，缩短了制备时间；添加剂成分及其重量份为2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯酰胺，0.5~2份脂肪醇硫酸钠和3~6份山梨酸，上述添加剂能保护酶水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏。上述方法制备的雪蛤抗氧化肽提取率高，纯度高，多肽活性强，抗氧化性强，操作简单，适合工厂化生产。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种雪蛤抗氧化肽的制备方法，具体步骤为：
1）预处理：将雪蛤用冰水清洗3~5次，将泥沙和雪蛤表面的污渍清洁干净，在烘箱中干燥，干燥温度为70~90℃，干燥时间为40~60min，再用粉碎机粉碎，过200~300目筛。将雪蛤粉碎成粉末增大了比表面积，可以使脱脂和酶解反应更充分，也可缩短反应时间；
2）脱脂：在雪蛤粉中按照固液比1:2~1:5加入石油醚，并且石油醚中含有2~4%的丙酮和1~5%仲辛基酚聚氧乙烯醚，脱脂温度为60~80℃，搅拌速率为300~400r/min，反应时间为20~40min，得到固液分离液，用布氏漏斗进行抽滤，得到脱脂后的雪蛤粉。如果不进行脱脂的话，雪蛤粉中的油脂会和抗氧化钛一起提取出来，影响抗氧化钛的纯度，降低产品的抗氧化性；石油醚只溶油脂不溶蛋白质，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，从而提高雪蛤粉的脱脂率；
3） 酶解：在脱脂后的雪蛤粉中按固液比1:3~1:5加入蒸馏水，搅拌均匀后加入酶解剂和添加剂，水浴加热，酶解温度为40~50℃，pH为6.0~7.1，搅拌速率为300~400r/min，反应时间为1.5~3h。使用酶水解雪蛤蛋白具有温和性，专一性和高效性的特点，酶解剂酶解后得到的多肽，空间结构不会被破坏，具有明显的抗氧化性；添加剂能保护水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏；
4）灭酶：酶解结束后，对酶解液进行沸水浴加热灭酶，灭酶时间为10~15min，，自然冷却终止酶解反应，过滤；
5）抗氧化肽制备：经反向高效液相色谱得到多种雪蛤蛋白水解后的产物，通过清除DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子自由基实验，挑选出抗氧化性强的几种多肽，测定其分子量。根据测定的分量大小选择适合的超滤膜进行超滤，将滤液先用10000~15000Da 的膜超滤，其透过液再用1000~2000Da 的膜超滤，取滞留液。真空低温浓缩后喷雾干燥成多肽粉末，液体浓缩温度为20~30℃，真空度为-5~5pa，反应时间为30~50min。得到的多肽粉末中抗氧化肽含量高，抗氧化性强，能有效地清除机体内的自由基和活性氧或者通过阻断脂质过氧化过程中的自由基链式反应来预防因氧化而造成的机体损伤，经济效益高。
酶解剂成份及其重量份为：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份风味蛋白酶，1~3份硫酸镁，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氢钙，0.5~1.5份维生素A和2~5份十二烷基磺酸钠。上述酶解剂酶解雪蛤蛋白条件温和，不会破坏多肽活性；酶解效率高，缩短了制备时间。
添加剂成分及其重量份为2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯酰胺，0.5~2份脂肪醇硫酸钠和3~6份山梨酸。上述添加剂能保护酶水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏。
实施例2：
一种雪蛤抗氧化肽的制备方法，最优选步骤为：
1）预处理：将雪蛤用冰水清洗4次，将泥沙和雪蛤表面的污渍清洁干净，在烘箱中干燥，干燥温度为80℃，干燥时间为50min，再用粉碎机粉碎，过250目筛。将雪蛤粉碎成粉末增大了比表面积，可以使脱脂和酶解反应更充分，也可缩短反应时间；
2）脱脂：在雪蛤粉中按照固液比1:4加入石油醚，并且石油醚中含有3%的丙酮和4%仲辛基酚聚氧乙烯醚，脱脂温度为80℃，搅拌速率为300r/min，反应时间为30min，得到固液分离液，用布氏漏斗进行抽滤，得到脱脂后的雪蛤粉。如果不进行脱脂的话，雪蛤粉中的油脂会和抗氧化钛一起提取出来，影响抗氧化钛的纯度，降低产品的抗氧化性；石油醚只溶油脂不溶蛋白质，在石油醚中加入丙酮和仲辛基酚聚氧乙烯醚可提高雪蛤粉中的油脂在石油醚中的溶解度，从而提高雪蛤粉的脱脂率；
3）酶解：在脱脂后的雪蛤粉中按固液比1:3加入蒸馏水，搅拌均匀后加入酶解剂和添加剂，水浴加热，酶解温度为45℃，pH为6.5，搅拌速率为300r/min，反应时间为2h。使用酶水解雪蛤蛋白具有温和性，专一性和高效性的特点，酶解剂酶解后得到的多肽，空间结构不会被破坏，具有明显的抗氧化性；添加剂能保护水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏；
4）灭酶：酶解结束后，对酶解液进行沸水浴加热灭酶，灭酶时间为15min，，自然冷却终止酶解反应，过滤；
5）抗氧化肽制备：经反向高效液相色谱得到多种雪蛤蛋白水解后的产物，通过清除DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子自由基实验，挑选出抗氧化性强的几种多肽，测定其分子量。根据测定的分量大小选择适合的超滤膜进行超滤，将滤液先用13000Da 的膜超滤，其透过液再用1200Da 的膜超滤，取滞留液。真空低温浓缩后喷雾干燥成多肽粉末，液体浓缩温度为26℃，真空度为-2pa，反应时间为40min。得到的多肽粉末中抗氧化肽含量高，抗氧化性强，能有效地清除机体内的自由基和活性氧或者通过阻断脂质过氧化过程中的自由基链式反应来预防因氧化而造成的机体损伤，经济效益高。
酶解剂成份及其重量份为：5~10份木瓜蛋白酶，12~20份风味蛋白酶，1~3份硫酸镁，2~5份半胱氨酸，1~3份磷酸二氢钙，0.5~1.5份维生素A、2~5份十二烷基磺酸钠和0.001~0.05份鲸蜡硬脂醇异壬酸酯。上述酶解剂酶解雪蛤蛋白条件温和，不会破坏多肽活性；酶解效率高，缩短了制备时间，可能是鲸蜡硬脂醇异壬酸酯对上述成份的作用产生了耦合，提高了终产物的活性，其机理尚不明确。添加剂成分及其重量份为2~5份聚氧乙烯醚，1~3份聚丙烯酰胺，0.5~2份脂肪醇硫酸钠和3~6份山梨酸。上述添加剂能保护酶水解产生的多肽的活性，避免水溶液中微量的重金属离子对其结构造成破坏。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。