一种利用海蜇加工下脚料制备抗氧化肽的方法与流程

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种以海蜇加工下脚料为原料制备抗氧化肽的方法。

背景技术：

抗氧化肽是一类具有抗氧化活性或还原活性的肽类总称，其可以清除机体产生的多余自由基，降低机体中过氧化物的含量和自氧化速率，有效防止由自由基累积造成的机体损伤。虽然生物体本身含有少量的天然抗氧化肽，如谷胱甘肽、肌肽和鹅肌肽等，可以直接被分离利用，但是天然抗氧化多肽的提取远不能满足消费者对抗氧化剂的需求。

早期对机体内自由基的清除多采用一些合成类抗氧化剂，如丁羟甲苯和叔丁基羟基茴香醚。但是这些合成类抗氧化剂对人体具有很强的毒副作用，我国政府已经强制规定了对其的添加量。因此，利用低经济价值的蛋白质制备新型、高活性和无副作用的肽类抗氧化剂具有广阔的应用前景。

海蜇是一种暖水性大型食用水母，色鲜味美，兼具多种药用功效，是当前实现人工养殖的最低等海洋动物之一，具有重要的渔业经济价值。21世纪初期，海蜇产品的市场需求量日益增加，人工海蜇养殖的技术取得重大突破，海蜇养殖产业快速发展，海蜇的高值化利用也日益受到人们的关注。研究表明，海蜇皮的干基组分中84.33%是蛋白质，而在这些蛋白质中，大部分都是胶原蛋白，胶原蛋白含有的大量甘氨酸和疏水性氨基酸有关，具有较大的抗氧化潜力。因此，海蜇加工下脚料可以作为一个新型的抗氧化肽制备来源，有助于提高海蜇产品附加值，实现低值海蜇在食品保健和美容领域的高值化利用。

目前，抗氧化肽的制备方法主要有三类：从细菌、真菌或动植物体中直接提取获得活性肽；通过体外单酶或复合酶酶解蛋白质获得多肽片段；在已知目标活性肽氨基酸序列或基因序列的情况下，直接合成或利用基因重组技术表达目标活性肽。直接提取分离的方法虽然比较简单易行，但是一般生物体内天然活性肽含量少、活性低，其分离纯化步骤繁琐，可操作性不高，不适用于大规模生产；化学合成和基因重组法虽然目的性强，能够直接获得需要的多肽，但是受到成本高、仪器昂贵和技术难度大的限制，只适于合成已知序列的寡肽，不能够用于新型活性多肽的发现；而酶解法制备生物活性肽具有过程可控、条件温和、组分损失少、蛋白酶酶切位点种类多样和适于大规模生产等优势，是最适合的活性多肽制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用海蜇加工下脚料制备抗氧化肽的方法，其以海蜇加工下脚料为原料，采用风味蛋白酶和胰蛋白酶复合酶法，建立海蜇抗氧化肽的制备工艺，得到活性较高的海蜇抗氧化肽产品，其可有效提高海蜇产品的附加值，实现低值海蜇的高值化利用，为抗氧化肽的制备提供新来源。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用海蜇加工下脚料制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

1）以海蜇加工下脚料为制备原料，先将其用清水进行冲洗，再用蒸馏水浸泡1~2 d，并每隔2 h更换一次蒸馏水；

2）将步骤1）经充分除盐和去金属离子的海蜇加工下脚料沥干，置于搅拌机中搅碎至无明显颗粒，再用四层纱布过滤沥干；

3）在步骤2）所得海蜇匀浆中加入海蜇加工下脚料重量3.0-5.0%的风味蛋白酶，在40-50℃、pH 7.0-8.0和料液比0.40-0.80 g/mL条件下酶解4-6 h；然后加入海蜇加工下脚料重量2.0-4.0%的胰蛋白酶，在40-50℃、pH 8.0-9.0、料液比0.25-0.75 g/mL条件下继续酶解4-6 h；

4）将步骤3）所得酶解物依次采用截留分子量为10 kDa、3 kDa和1 kDa的超滤膜进行超滤分离，然后经真空浓缩、冷冻干燥，获得不同分子量的抗氧化肽产品。

优选地，步骤3）中风味蛋白酶的添加量为所用海蜇加工下脚料重量的4.0%，其酶解条件是在44.1℃、pH 7.39和料液比0.56 g/mL条件下酶解4 h；胰蛋白酶的添加量为所用海蜇加工下脚料重量的3.0%，其酶解条件是在43.5℃、pH 8.33、料液比0.50 g/mL条件下酶解4 h。

本发明的优点在于：本发明以海蜇加工下脚料为原料，采用风味蛋白酶和胰蛋白酶复合酶法制备抗氧化肽，与传统工艺相比，其操作简单、过程可控、成本低廉、提取率高，获得的抗氧化肽水解度高，可达到70%以上，且兼具分子量小、活性好和热稳定性强等优点，可应用于食品、保健和美容等领域，为海蜇高值化利用提供了理论基础，并为抗氧化肽的制备提供了新途径。

附图说明

图1为不同蛋白酶酶解效果的比较图。

图2为不同分子量海蜇抗氧化肽组分对超氧阴离子自由基的清除能力。其中JCP1：MW > 10 kDa；JCP2：MW 3-10 kDa；JCP3：MW 1-3 kDa；JCP4：MW <1 kDa。

图3为不同分子量海蜇抗氧化肽组分的还原力。其中JCP1：MW > 10 kDa；JCP2：MW 3-10 kDa；JCP3：MW 1-3 kDa；JCP4：MW <1 kDa。

图4为不同分子量海蜇抗氧化肽组分对羟自由基的清除能力。其中JCP1：MW > 10 kDa；JCP2：MW 3-10 kDa；JCP3：MW 1-3 kDa；JCP4：MW <1 kDa。

图5为不同分子量海蜇抗氧化肽组分对ABTS自由基的清除能力。其中JCP1：MW > 10 kDa；JCP2：MW 3-10 kDa；JCP3：MW 1-3 kDa；JCP4：MW <1 kDa。

图6为不同分子量海蜇抗氧化肽组分对DPPH自由基的清除能力。其中JCP1：MW > 10 kDa；JCP2：MW 3-10 kDa；JCP3：MW 1-3 kDa；JCP4：MW <1 kDa。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 海蜇加工下脚料的预处理

（1）除盐：将腌制用海蜇加工下脚料用清水冲洗几遍，再用蒸馏水浸泡1~2 d，并每隔2 h更换一次蒸馏水；

（2）匀浆：将除盐后的海蜇加工下脚料沥干，使其保持一定比例的水分，再置于搅拌机中搅碎至无明显颗粒，用四层纱布过滤沥干。

实施例2 海蜇抗氧化肽酶法制备的工艺优化

（1）蛋白酶的选择：以水解度（DH）和还原力（RP）为指标，在酶添加量100 U/g、料液比1:1 g/mL和酶解时间4 h条件下，比较六种不同蛋白酶在其最适酶解条件（见表1）下对海蜇蛋白的酶解效果（见图1），最终确定胰蛋白酶和风味蛋白酶为最适用酶。

表1 不同蛋白酶的最适酶解条件

（2）单酶酶解工艺优化：以水解度（DH）和还原力（RP）为指标，分析温度、pH值、料液比、酶添加量和酶解时间对抗氧化肽制备效果的影响。

取一定质量的海蜇下脚料匀浆，加入一定体积相应pH值的缓冲液至一定料液比，添加一定比例的蛋白酶，置于一定温度条件下酶解一定时间；待反应结束后，将酶解液置于沸水浴中加热10 min使蛋白酶失活，13000 g离心10 min，取上清多肽液进行DH值和RP值的测定。并在单因素实验基础上，进一步利用Box-Behnken中心组合实验进行实验设计，用Design-Expert 8.0软件进行响应面优化分析。

表2 胰蛋白酶酶解工艺响应面实验设计因素水平编码表

表3 胰蛋白酶酶解工艺响应面实验方案及结果

表4 风味蛋白酶酶解工艺响应面实验设计因素水平编码表

表5 风味蛋白酶酶解工艺响应面实验方案及结果

结果显示，胰蛋白酶的最优酶解工艺条件为：温度43.5℃、pH值8.33、料液比0.50 g/mL、酶添加量3.0%和酶解时间4 h；风味蛋白酶的最优酶解工艺条件为温度44.1℃、pH值7.39、料液比0.56 g/mL、酶添加量4.0%和酶解时间4 h。

（3）复合酶酶解工艺设计：在上述单酶酶解工艺优化的基础上，通过测定酶解液的DH值和RP值，比较不同蛋白酶组合方式（单酶酶解、混合酶解和先后酶解）对酶解效果的影响。

表6 不同蛋白酶组合方式对海蜇蛋白酶解效果的影响

由结果确定复合酶的最佳组合方式为：先添加风味蛋白酶4.0%，在温度44.1℃、pH值7.39和料液比0.56 g/mL条件下酶解4 h，再添加胰蛋白酶3.0%，在温度43.5℃、pH值8.33、料液比0.50 g/mL条件下继续酶解4 h，所获得水解液的水解度和还原力分别为71.56%和0.341。

实施例3 不同分子量海蜇多肽的体外抗氧化活性表征

（1）依次采用截留分子量为10 kDa、3 kDa和1 kDa的超滤膜对上述工艺制备的海蜇抗氧化肽混合液进行分离，得到分子量范围分别为>10 kDa（JCP1）、3-10 kDa（JCP2）、1-3 kDa（JCP3）和<1 kDa（JCP4）的4种抗氧化肽组分，然后将各组分旋转蒸发浓缩，冷冻干燥成粉，并置于常温干燥器中短期保藏；

（2）在体外抗氧化实验中，不同分子量海蜇抗氧化肽表现出不同的抗氧化能力。其中，JCP1具有最强的超氧阴离子自由基清除能力，其IC₅₀值为22.6 mg/mL（见图2）；JCP3具有最强的还原力、羟自由基清除能力和和ABTS自由基清除能力，其IC₅₀值分别为14.9、2.21和0.61 mg/mL（见图3-5）；JCP4具有最强的DPPH自由基清除能力，其IC₅₀值为28.3 mg/mL（见图6）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。