藻蓝蛋白多肽的制备方法与流程

本发明涉及蛋白质酶解技术领域，尤其涉及一种藻蓝蛋白多肽的制备方法。

背景技术：

藻蓝蛋白(Phycocyanin，又称PC)是一种存在于红藻和蓝藻细胞内的光合辅助色素，能高效捕获光能。近年来的研究发现藻蓝蛋白具有抗氧化、抗癌、抗炎和神经保护等多种生物活性，对它的研究已经成为研究天然海洋药物的热点。我国对藻蓝蛋白的研究始于20世纪70年代，经过了30多年来的研究开发，虽然有了较大的进展，但大都处于实验室水平。同时，以藻蓝蛋白为主的功能性食品不多，在药品的研究开发方面还是空白。酶水解可以提高蛋白质的功能特性，得到的肽具有一些蛋白质无法比拟的物理化学特性。如果采用酶解的方法将藻蓝蛋白降解为可溶性寡肽，则可大大提高其在食品中的理化性能，并可能获得其前体没有的生理活性。目前已有专利涉及到藻蓝蛋白的酶解。专利螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物及其应用(申请号200910178865.6)提供螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物、包括螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的功能食品、以及包含螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物和药学上可接受的载体的药物组合物。专利一种利用藻蓝蛋白制备Caspase-3激活的方法(申请号201110377690.6)公开了运用供一种从螺旋藻干粉中提取藻蓝蛋白，利用胰蛋白酶水解藻蓝蛋白，分离得到比藻蓝蛋白本身对Caspase-3酶活力的激活作用更有效，对正常细胞无毒活性的肽的方法。然而现有的藻蓝蛋白酶解方法，通常是采用单一的酶解技术对藻蓝蛋白进行酶解，存在蛋白水解效率低下的缺点。

技术实现要素：

鉴于此，有必要提供一种蛋白水解效率较高的藻蓝蛋白多肽的制备方法。

一种藻蓝蛋白多肽的制备方法，包括如下步骤：

将水加入藻蓝蛋白中，搅拌使其充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液；

向所述藻蓝蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，搅拌均匀后，超声处理30～50min，得到酶解产物；

将所述酶解产物升温至85℃～95℃并保温5～15min，灭酶后冷却至30℃～40℃，离心，取上清，即为酶解液；

将所述酶解液进行超滤处理，得到超滤液；

将所述超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥处理得到所述藻蓝蛋白多肽。

在其中一个实施例中，将水加入藻蓝蛋白中，搅拌使其充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液的操作中，藻蓝蛋白和水的料液比为1:10～1:50。

在其中一个实施例中，将水加入藻蓝蛋白中，搅拌使其充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液的操作中，采用恒温磁力搅拌，温度为50℃～55℃。

在其中一个实施例中，木瓜蛋白酶和藻蓝蛋白的质量比为1:100～1:20。

在其中一个实施例中，中性蛋白酶和藻蓝蛋白的质量比为1:30～1:20。

在其中一个实施例中，在加入木瓜蛋白酶之前，还包括将所述藻蓝蛋白溶液的pH调节至5.0～7.0的步骤。

在其中一个实施例中，在加入中性蛋白酶之前，还包括将所述藻蓝蛋白溶液的pH调节至6.0～7.0的步骤。

在其中一个实施例中，加入木瓜蛋白酶进行超声处理的过程中，反应温度为50℃～60℃。

在其中一个实施例中，加入中性蛋白酶进行超声处理的过程中，反应温度为45℃～55℃。

在其中一个实施例中，超声处理的操作中，超声功率为300～800W。

上述藻蓝蛋白多肽的制备方法，采用超声辅助酶解，超声波具有空化作用，产生的气泡经挤压破裂，可以瞬间产生极强的机械剪切力，使蛋白质降解或者改变蛋白质构象，促使其亲水基团更多地暴露出来，提高藻蓝蛋白在水中的溶解度，有利于酶和藻蓝蛋白底物结合，能够在较短时间内显著提高藻蓝蛋白的酶解效率。

附图说明

图1为一实施方式的藻蓝蛋白多肽的制备方法的流程图；

图2为实施例1制备得到的藻蓝蛋白多肽浓度对DPPH自由基的清除影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实例仅以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参考图1，一实施方式的藻蓝蛋白多肽的制备方法，包括如下步骤：

S10、将水加入藻蓝蛋白中，搅拌使其充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液。

其中，藻蓝蛋白的纯度A₆₂₀/A₂₈₀>2。藻蓝蛋白和水的料液比可以为1:10～1:50。

S10的操作中，采用恒温磁力搅拌使藻蓝蛋白溶解，温度可以为50℃～55℃。搅拌时间可以为20～40min。

S20、向藻蓝蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，搅拌均匀后，超声处理30～50min，得到酶解产物。

其中，超声处理可以在水浴超声装置中进行。

其中，木瓜蛋白酶的酶活力可以为5×10⁵～10×10⁵U/g。木瓜蛋白酶和藻蓝蛋白的质量比可以为1:100～1:20。加入木瓜蛋白酶进行超声处理的过程中，反应温度可以为50℃～60℃。超声功率可以为300～800W。在加入木瓜蛋白酶之前，还可以包括将藻蓝蛋白溶液的pH调节至5.0～7.0的步骤。进一步的，可以采用1M盐酸进行藻蓝蛋白溶液的pH调节。

其中，中性蛋白酶的酶活力为1×10⁵～3×10⁵U/g。中性蛋白酶和藻蓝蛋白的质量比可以为1:30～1:20。加入中性蛋白酶进行超声处理的过程中，反应温度可以为45℃～55℃。超声功率可以为300～800W。在加入中性蛋白酶之前，还可以包括将藻蓝蛋白溶液的pH调节至6.0～7.0的步骤。进一步的，可以采用1M盐酸进行藻蓝蛋白溶液的pH调节。

S30、将酶解产物升温至85℃～95℃并保温5～15min，灭酶后冷却，离心，取上清，即为酶解液。

其中，升温速率可以为20～30℃/min。

S30中，灭酶后，冷却至30℃～40℃后再离心。

离心操作中，可以采用10000r/min的转速离心10min。

S40、将酶解液进行超滤处理，得到超滤液。

其中，可以采用截留分子质量为1kD～10kD超滤膜进行超滤处理。

S50、将超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥处理得到藻蓝蛋白多肽。

上述藻蓝蛋白多肽的制备方法，采用超声辅助酶解，超声波具有空化作用，产生的气泡经挤压破裂，可以瞬间产生极强的机械剪切力，使蛋白质降解或者改变蛋白质构象，促使其亲水基团更多地暴露出来，提高藻蓝蛋白在水中的溶解度，有利于酶和藻蓝蛋白底物结合，能够在较短时间内显著提高藻蓝蛋白的酶解效率，所得到的多肽具有较强的抗氧化性。

下面为具体实施例部分。

实施例1

(1)称取5g藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入200mL蒸馏水，于恒温磁力搅拌器上搅拌30min，使其充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液；

(2)将步骤(1)所得的藻蓝蛋白溶液调节pH至6.0，然后加入1.5g木瓜蛋白酶(酶活力8×10⁵U/g)，搅拌均匀后，在水浴超声装置中超声处理，超声功率为600W，反应温度55℃，反应时间为50min，得到酶解产物；

(3)将酶解反应产物迅速升温至90℃保温10min，灭酶后冷却至30℃，10000r/min离心10min，取上清，即为酶解液，测得藻蓝蛋白的水解度为13.68％；

(4)采用截留分子质量为5kD超滤膜将步骤(3)所得酶解液进行超滤处理，得到超滤液；

(5)将步骤(4)所得超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥得到藻蓝蛋白多肽。不同浓度的藻蓝蛋白多肽对DPPH自由基清除能力如图1所示，图中的一条曲线为藻蓝蛋白多肽浓度和DPPH自由基的清除率的关系曲线，另一条曲线为VC的浓度和DPPH自由基的清除率的关系曲线。可见，藻蓝蛋白多肽对DPPH自由基的清除率和浓度有一定的关系，当藻蓝蛋白多肽的浓度达到5mg/mL时，DPPH自由基清除率达87.31％。

实施例2

(1)称取5g藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入50mL蒸馏水，于恒温磁力搅拌器上搅拌至充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液；

(2)将步骤(1)所得的藻蓝蛋白溶液调节pH至5.0，然后按藻蓝蛋白重量的5％加入木瓜蛋白酶(酶活力10×10⁵U/g)，搅拌均匀后，在水浴超声装置中超声处理，超声功率为300W，反应温度50℃，反应时间为30min，得到酶解产物；

(3)将酶解反应产物迅速升温至85℃保温15min，灭酶后冷却至30℃，10000r/min离心10min，取上清，即为酶解液，测得藻蓝蛋白的水解度为12.97％；

(4)采用截留分子质量为10kD超滤膜将步骤(3)所得酶解液进行超滤处理，得到超滤液；

(5)将步骤(4)所得超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥得到藻蓝蛋白多肽。所得藻蓝蛋白多肽对DPPH自由基的清除率和浓度有一定的关系，当藻蓝蛋白多肽的浓度达到5mg/mL时，DPPH自由基清除率达80.98％。

实施例3

(1)称取10g藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入500mL蒸馏水，于恒温磁力搅拌器上搅拌至充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液；

(2)将步骤(1)所得的藻蓝蛋白溶液调节pH至7.0，然后按藻蓝蛋白重量的1％加入木瓜蛋白酶(酶活力10×10⁵U/g)，搅拌均匀后，在水浴超声装置中超声处理，超声功率为800W，反应温度60℃，反应时间为50min，得到酶解产物；

(3)将酶解反应产物迅速升温至95℃保温5min，灭酶后冷却至30℃，10000r/min离心10min，取上清，即为酶解液，测得藻蓝蛋白的水解度为13.59％；

(4)采用截留分子质量为1kD超滤膜将步骤(3)所得酶解液进行超滤处理，得到超滤液；

(5)将步骤(4)所得超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥得到藻蓝蛋白多肽。所得藻蓝蛋白多肽对DPPH自由基的清除率和浓度有一定的关系，当藻蓝蛋白多肽的浓度达到5mg/mL时，DPPH自由基清除率达85.16％。

实施例4

(1)称取5g藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入200mL蒸馏水，于恒温磁力搅拌器上搅拌30min，使其充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液；

(2)将步骤(1)所得的藻蓝蛋白溶液调节pH至6.0，然后按藻蓝蛋白重量的3％加入中性蛋白酶(酶活力3×10⁵U/g)，搅拌均匀后，在水浴超声装置中超声处理，超声功率为600W，反应温度55℃，反应时间为50min，得到酶解产物；

(3)将酶解反应产物迅速升温至95℃保温5min，灭酶后冷却至30℃，10000r/min离心10min，取上清，即为酶解液，测得藻蓝蛋白的水解度为11.82％；

(4)采用截留分子质量为1kD超滤膜将步骤(3)所得酶解液进行超滤处理，得到超滤液；

(5)将步骤(4)所得超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥得到藻蓝蛋白多肽。所得藻蓝蛋白多肽对DPPH自由基的清除率和浓度有一定的关系，当藻蓝蛋白多肽的浓度达到6mg/mL时，DPPH自由基清除率达75.82％。

实施例5

(1)称取5g藻蓝蛋白(A₆₂₀/A₂₈₀>2)放入容器中，加入50mL蒸馏水，于恒温磁力搅拌器上搅拌至充分溶解，得到藻蓝蛋白溶液；

(2)将步骤(1)所得的藻蓝蛋白溶液调节pH至7.0，然后按藻蓝蛋白重量的5％加入中性蛋白酶(酶活力1×10⁵U/g)，搅拌均匀后，在水浴超声装置中超声处理，超声功率为800W，反应温度45℃，反应时间为30min，得到酶解产物；

(3)将酶解反应产物迅速升温至85℃保温15min，灭酶后冷却至40℃，10000r/min离心10min，取上清，即为酶解液，测得藻蓝蛋白的水解度为11.06％；

(4)采用截留分子质量为10kD超滤膜将步骤(3)所得酶解液进行超滤处理，得到超滤液；

(5)将步骤(4)所得超滤液进行真空浓缩，喷雾干燥得到藻蓝蛋白多肽。所得藻蓝蛋白多肽对DPPH自由基的清除率和浓度有一定的关系，当藻蓝蛋白多肽的浓度达到6mg/mL时，DPPH自由基清除率达70.03％。

以上所述仅是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为发明的保护范围。