一种从淡水珍珠蚌肉中提取胶原蛋白的工艺方法
【专利摘要】本发明公开了一种从淡水珍珠蚌肉中提取胶原蛋白的工艺方法，选取普通河流、湖泊中养殖的珍珠蚌为原料，去掉外壳、剪下斧足、冷干、切碎，经Tris-HCl、NaOH处理，用醋酸浸泡，加入胃蛋白酶，在不同功率的超声条件下提取48h，粗提取的胶原蛋白溶液用盐析纯化，冷干，提取率高达35%。此工艺操作简单，生产条件容易控制，安全可靠，生产效率高，成本低。提取的胶原蛋白用途广，可用于化妆品行业、食品行业、皮革制造业、造纸业、制药业、医学等行业，具有很高的利用价值和经济、社会效益。
【专利说明】ー种从淡水珍珠蚌肉中提取胶原蛋白的エ艺方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从淡水双贝壳类动物体中制取胶原蛋白的方法エ艺，尤其涉及从珍珠蛘斧足中提取胶原蛋白的エ艺方法。
技术背景
[0002]珍珠蛘是瓣鳃纲软体动物，其外壳长可达200mm，外形呈角突卵圆形，两壳膨胀，喜生活在淤泥底及水流缓慢、静止的水域中，常在湖泊、河流、水库、池塘内可见，肉可以吃，同常被用作禽类的天然饵料及饲料。
[0003]胶原蛋白是ー种生物性纤维类高分子蛋白，白色、不透明、无支链，在哺乳动物及水生动物的皮、骨、鱗片、软骨、韧带、肌腱等大量存在，大约有18-19种，根据其来源总共可分为四类胶原蛋白:I型、II型、III型、IV型。I型胶原是从皮肤和骨骼中提取得到的，II型胶原是从软骨组织中分离得到的，III型胶原是从胚胎中分离得到的，IV型胶原是从细胞底膜中分离提取得到的。
[0004]胶原蛋白是ー种结构性蛋白，由三股右手螺旋的多肽链盘绕折叠形成ー种右手螺旋结构，即由甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸、甘氨酸-脯氨酸-Y、甘氨酸-X-Y这些3肽的重复片段折叠形成。经过酸、碱、酶的处理后这些三螺旋结构就会松开，分成三条肽链，从而利于胶原蛋白的提取。胶原蛋白具有一般蛋白质的化学性质，能发生氨基反应、羧基反应、呱基反应、甲硫基反应、羟基反应、显色反应，与金属离子及表面活性剂作用等。
[0005]胶原蛋白是ー种功能性蛋白质，具有高度抗张能力，在动物细胞中起结缔组织的作用，在生物学功能方面，促进伤ロ愈合、止血、骨骼愈合，增强皮肤代谢等。当免疫蛋白与胶原蛋白结合时，可以显著提高人体的免疫机能。目前胶原蛋白的主要来源为陆生动物，如猪、牛、羊等，但随着胶原蛋白需求量的增加以及各种禽类疾病的爆发，人们对陆生动物胶原蛋白的使用安全问题产生了`怀疑，现有的胶原蛋白已不能满足现代人对胶原蛋白产量及质量的要求，所以寻找新的胶原蛋白来源，成为当今社会胶原蛋白行业普遍关注的问题，而我国水产资源丰富，从水生动物体内提取胶原蛋白成为胶原蛋白的主要来源。河蛘在平常水域中经常可见，特别是珍珠蛘养殖量大，取珠后的珍珠蛘经常随意丢弃或成为家禽的天然饲料，这样不仅造成了环境污染而且造成了极大的浪费，如果从蛘肉中提取胶原蛋白，不仅减少了环境污染还可以提高珍珠蛘的利用价值，因此从珍珠蛘中提取胶原蛋白是值得探索和有意义的。
【发明内容】
[0006]本发明涉及ー种从淡水珍珠蛘中提取胶原蛋白的エ艺方法，充分利用了蛘肉，提高了珍珠蛘的附加值。
[0007]本发明是这样来实现的，所述エ艺方法包括下述步骤:
ー种从淡水珍珠蛘肉中提取胶原蛋白的エ艺方法，所述エ艺方法包括以下步骤:
a、原材料制备:(I)将淡水珍珠蛘肉放在_80°C冰箱中冷冻24h ；(2)将冷冻后的蛘肉在冷冻干燥箱中冷冻干燥，直到去除表面水分为止；
b、原材料的预处理:(I)将冷干后的蛘肉切碎，在50倍体积的预处理液中去除脂肪及内源性胶原蛋白，维持恒定温度为4-8°C ；(2)用20mM Tris-HCl, pH 8.0的溶液浸泡24h,每8h更换一次浸泡液；(3)将Tris-HCl处理后的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更换一次浸泡液；(4)将经NaOH处理后的原材料经滤网过滤，然后用超纯水充分洗涤过滤后的蛘肉，然后过滤，直到滤液呈中性或微碱性为止，最后一次水洗后，用冷冻离心机离心，12000r/min, 20min, 4°C,去掉上清液,得到沉淀；
C、酶解-超声波破碎:将预处理后的蛘肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，按照胃蛋白酶与冷干的蛘肉的质量比3:100的配比，加入胃蛋白酶，在室温下，用超声波处理此溶液，采用处理30min，暂停30min的方式，连续处理2d;
d、分离:将得到的超声破碎液用冷冻离心机离心，得到上清液；
e、二次提取:将离心所得的沉淀再次用c步骤所述方法超声破碎提取，离心，取得上清液，将沉淀去掉；
f、合并:将两次离心所得上清液合并在一起；
g、提纯:向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最终浓度为0.9M，并在4°C冰箱中静置过夜；
h、二级分离:将上述溶液高速冷冻分离，所得沉淀即为初步纯化的胶原蛋白沉淀；
1、透析:将得到的沉淀溶解于0.5M醋酸溶液中，在4°C下用去离子水透析3天。
[0008]j、离心:将透析后的溶液高速冷冻离心，12，000r/min，30 min,所得沉淀为最后纯化的胶原蛋白。`
[0009]k、冷冻干燥:将取得的纯的胶原沉淀冷冻干燥处理，在_80°C的冰箱中保存。
[0010]步骤c中所述的胃蛋白酶为猪胃蛋白酶，所述的超声波的功率20W-52W，振幅20-40%o
[0011]本发明的技术效果是，本发明通过超声-酶解技木，使肌肉细胞破碎，使胶原蛋白在相同的时间内充分溶解至醋酸溶液中，从而得到的胶原蛋白产量更高，溶解度更高，同时提高了胶原蛋白的生产效率，为胶原蛋白的エ业化生产提高了效益。【具体实施方式】
实施例1
从淡水珍珠蛘肉中提取胶原蛋白的エ艺方法，所述エ艺方法包括以下步骤:
a、原材料制备:(I)将淡水珍珠蛘肉放在_80°C冰箱中冷冻24h；(2)将冷冻后的蛘肉在冷冻干燥箱中冷冻干燥，直到去除表面水分为止；
b、原材料的预处理:(I)取3g冷干的珍珠蛘肉，用剪刀剪成小片段，在50倍体积的预处理液中去除脂肪及内源性胶原蛋白，维持恒定温度为4-8°C ;(2)用20mM Tris-HCl, pH
8.0的溶液浸泡24h，每8h更换一次浸泡液；(3)将Tris-HCl处理后的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更换一次浸泡液，温度恒定在4-8°C ；
(4)将经NaOH处理后的原材料经滤网过滤，然后用超纯水充分洗涤过滤后的蛘肉，然后过滤，直到滤液呈中性或微碱性为止，最后一次水洗后，用冷冻离心机离心，12000r/min，20min, 4°C，去掉上清液，得到沉淀；
C、酶解-超声波破碎:将预处理后的蛘肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，体积质量比为50:1 (mL:g),用组织捣碎机充分绞碎,加入0.3g胃蛋白酶,在冰水浴条件下放在磁力搅拌器上搅拌，用超声破碎仪提取，超声功率为39W，振幅为30%，超声间隔为30min，提取时间为2d。
[0012]d、分离:将经过超声提取后的溶液用冷冻离心机离心分离，12000/min, 20min，4°C，取上清液，保留沉淀；
e、二次提取:将离心所得的沉淀再次按照c步骤和d步骤提取、离心，取得上清液，将沉淀去掉；
f、合并:将两次离心所得上清液合并在一起；
g、提纯:向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最终浓度为0.9M，并在4°C冰箱中静置过夜；
h、二级分离:将上述溶液高速冷冻分离，所得沉淀即为初步纯化的胶原蛋白沉淀；
1、透析:将得到的沉淀溶解于0.5M醋酸溶液中，在4°C下用去离子水透析3天；
j、离心:将透析后的溶液高速冷冻离心，12，000r/min，30 min,所得沉淀为最后纯化的月父原蛋白；
k、冷冻干燥:将取得的纯的胶原沉淀冷冻干燥处理，在-80°C的冰箱中保存；
1、冷干称重:将冷冻后的产品冷干，称重的最后得率为35.07%o
[0013]实施例2:
与实施例1基本相同，不同的是提取的超声功率为45.5W,振幅为35%,最后I父原蛋白的得率是23.33%。
[0014]实施例3:
与实施例1基本相同，提取功率不同，超声功率为52W，振幅为40%，胶原蛋白的得率为12.Tl。
[0015]实施例4:
与实施例1基本相同，提取功率不同，超声功率有所降低，超声功率为32.5W，振幅为25%，胶原蛋白的得率为14.84%。
[0016]实施例5:
与实施例1基本相同，超声功率继续降低，功率降为20W，振幅为20%，胶原蛋白的得率为 21%。
【权利要求】
1.ー种从淡水珍珠蛘肉中提取胶原蛋白的エ艺方法，其特点在于，所述エ艺方法包括以下步骤: a、原材料制备:(I)将淡水珍珠蛘肉放在_80°C冰箱中冷冻24h；(2)将冷冻后的蛘肉在冷冻干燥箱中冷冻干燥，直到去除表面水分为止； b、原材料的预处理:(I)将冷干后的蛘肉切碎，在50倍体积的预处理液中去除脂肪及内源性胶原蛋白，维持恒定温度为4-8°C ；(2)用20mM Tris-HCl, pH 8.0的溶液浸泡24h,每8h更换一次浸泡液；(3)将Tris-HCl处理后的原料用0.1M NaOH浸泡24h，每8h更换一次浸泡液；(4)将经NaOH处理后的原材料经滤网过滤，然后用超纯水充分洗涤过滤后的蛘肉，然后过滤，直到滤液呈中性或微碱性为止，最后一次水洗后，用冷冻离心机离心，12000r/min, 20min, 4°C,去掉上清液,得到沉淀； C、酶解-超声波破碎:将预处理后的蛘肉溶解在0.5M的醋酸溶液中，按照胃蛋白酶与冷干的蛘肉的质量比3:100的配比，加入胃蛋白酶，在室温下，用超声波处理此溶液，采用处理30min，暂停30min的方式，连续处理2d; d、分离:将得到的超声破碎液用冷冻离心机离心，得到上清液； e、二次提取:将离心所得的沉淀再次用c步骤所述方法超声破碎提取，离心，取得上清液，将沉淀去掉； f、合并:将两次离心所得上清液合并在一起； g、提纯:向上清液中加入2M的NaCl溶液，使上清液中NaCl的最终浓度为0.9M，并在4°C冰箱中静置过夜； h、二级分离:将上述溶液高速冷冻分离，所得沉淀即为初步纯化的胶原蛋白沉淀；` 1、透析:将得到的沉淀溶解于0.5M醋酸溶液中，在4°C下用去离子水透析3天； j、离心:将透析后的溶液高速冷冻离心，所得沉淀为最后纯化的胶原蛋白； k、冷冻干燥:将取得的纯的胶原沉淀冷冻干燥处理，在-80°C的冰箱中保存。
2.如权利要求1所述的ー种从淡水珍珠蛘肉中提取胶原蛋白的エ艺方法，其特征在于，步骤c中所述的胃蛋白酶为猪胃蛋白酶。
3.如权利要求1所述的ー种从淡水珍珠蛘肉中提取胶原蛋白的エ艺方法，其特征在于，步骤c中所述的超声波的功率20W-52W，振幅20-40%。
【文档编号】C07K1/14GK103554248SQ201310531420
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】陈素华, 王晓明, 邱贤华, 熊贞晟, 毕芊芊 申请人:南昌航空大学