一种酶法合成唾液酸类似物的方法及其应用与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及生物酶法合成唾液酸类似物及唾液酸类似物在作为神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抑制剂中的应用。

背景技术：

流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸道感染，是一个全球性的感染性疾病，每年流感引起的死亡人数达25-50万人。流感大爆发时死亡人数则更多。

目前，流感的预防和治疗措施主要是流感疫苗和药物。流感疫苗的有效性是建立在疫苗的毒株与防治的病毒毒株相似的基础上，而流感病毒抗原的高度变异性大大降低了人们预测流感爆发的准确性。针对病毒侵染、复制、释放的繁殖过程，已开发出多种抗流感病毒药物。目前美国食品和药物管理局(FDA)批准的针对甲型流感病毒的药物主要分为三类：M2蛋白抑制剂(金刚烷胺和金刚烷乙胺)，RNA聚合酶抑制剂(病毒唑)和NA抑制剂(如扎那米韦和奥司他韦)。据报道，流感病毒对M2蛋白抑制剂的耐药性从2002年的1.9％上升到2006年的91％，在不久的将来，烷胺类药物将难以用于流感的治疗和预防。而病毒唑由于疗效有限，对人体毒副作用较大，一般不使用。因此神经氨酸酶抑制剂是目前被许多国家广泛建议使用的抗流感药物。但近年来陆续也出现了对这两种药物的耐药病毒株，因此发现新型NA抑制剂的研究十分重要。NA是一种重要的病毒表面糖蛋白，它存在于病毒、细菌及哺乳动物细胞中，能水解唾液酸残基与邻近寡糖之间的糖苷键。在流感病毒感染呼吸道细胞初期，NA通过水解呼吸道黏膜蛋白中的唾液酸残基，降低粘液层粘度，使病毒顺利穿透呼吸道粘液层，到达易感细胞表面。血凝素(HA)是流感病毒的另一种表面蛋白，在病毒感染细胞的初始阶段，病毒通过HA结合于细胞表面的唾液酸受体，NA使两者解离，这种不断结合、解离的动态过程有利于病毒迅速找到合适的胞饮位点，帮助病毒侵染宿主细胞，提高感染效率。NA抑制剂可以与NA发生特异性结合从而抑制NA的活性，进而达到预防和治疗流感病毒的目的。

技术实现要素：

本发明利用唾液酸醛缩酶催化分别含有醛基和含有羰基的两种底物发生缩合反应，得到唾液酸类似物。从而达到合成潜在神经氨酸酶抑制剂的目的。所使用的唾液酸醛缩酶可以为市售的唾液酸醛缩酶或根据现有方法自制的唾液酸醛缩酶。

本发明的目的在于提供一种生物酶法合成唾液酸类似物的方法。

本发明的另一目的在于提供一种筛选神经氨酸酶抑制剂的方法。本发明合成的唾液酸类似物可以作为潜在的神经氨酸酶抑制剂或神经氨酸酶抑制剂的模板，为环境友好型方法合成神经氨酸酶抑制剂及潜在的神经氨酸酶抑制剂的合成提供新思路。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种酶法合成唾液酸类似物的方法，用唾液酸醛缩酶催化含有醛基的底物和含有羰基的底物发生缩合反应，得到唾液酸类似物。从而达到合成潜在神经氨酸酶抑制剂的目的。

所述含有醛基的底物为如结构通式I、II、III或IV所示的化合物：

其中，R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉各自独立的选自脂肪烃，芳香烃，卤素，卤代脂肪烃，卤代芳香烃，胺，叠氮基，巯基，胍基，羟基，羧基，醛基，硼酸盐，有机硼酸酯，磷酸盐，有机磷酸酯，有机金属，醚化物，硫醚，酯化物，氰化物，异氰酸酯，异硫氰酸酯，酮基，杂环，碳环，有机硅，酰胺，氨基甲酸盐和氢；其中I，II，III，IV中除1号碳位上碳氧双键以外的化学键的键型可以包括(R)型和(S)型，I，II，III，IV中除1号碳位上碳氧双键以外的化学键可以是单键，双键或三键，其中，含有醛基的底物不包括乙酰氨基甘露糖；

上述的含有醛基的底物如：葡萄糖及其衍生物或乙酰氨基葡萄糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物或乙酰氨基甘露糖衍生物、半乳糖及其衍生物或乙酰氨基半乳糖及其衍生物、核糖或核糖衍生物等；

所述的葡萄糖衍生物或乙酰氨基葡萄糖衍生物为葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖的羟基或乙酰基或羟代甲基取代衍生物，如：2-脱氧葡萄糖、3-脱氧葡萄糖、4-脱氧葡萄糖、5-脱氧葡萄糖、6-脱氧葡萄糖或氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧葡萄糖等；5-硫代葡萄糖、4-硫代葡萄糖、3-硫代葡萄糖、2-硫代葡萄糖或6-硫代葡萄糖等或丙酰氨基葡萄糖或丁酰氨基葡萄糖等；

所述的甘露糖衍生物或乙酰氨基甘露糖衍生物为甘露糖或乙酰氨基甘露糖的羟基或乙酰氨基或羟代甲基取代衍生物，如2-脱氧甘露糖、3-脱氧甘露糖、4-脱氧甘露糖、5-脱氧甘露糖、6-脱氧甘露糖或氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧甘露糖等；5-硫代甘露糖、4-硫代甘露糖、3-硫代甘露糖、2-硫代甘露糖或6-硫代甘露糖或丙酰氨基甘露糖或丁酰氨基甘露糖等；

所述的半乳糖衍生物或乙酰氨基半乳糖衍生物为半乳糖或乙酰氨基半乳糖的羟基或乙酰氨基或羟代甲基取代衍生物，如2-脱氧半乳糖、3-脱氧半乳糖、4-脱氧半乳糖、5-脱氧半乳糖、6-脱氧半乳糖或氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧半乳糖、6-脱氧氟(氯或溴或碘)代半乳糖、4-脱氧氟(氯或溴或碘)代半乳糖或4-氨基-4-脱氧半乳糖等或5-硫代半乳糖、4-硫代半乳糖、3-硫代半乳糖、2-硫代半乳糖或6-硫代半乳糖等或丙酰氨基半乳糖或丁酰氨基半乳糖等；

所述的核糖衍生物为脱氧核糖和核糖羟基或羟代甲基取代衍生物，如3-羟基四氢呋喃，甲基-2-脱氧-D-核糖等。

所述含有羰基的底物为如结构通式V所示的化合物：

其中，R₁、R₂各自独立的选自脂肪烃，芳香烃，卤素，卤代脂肪烃，卤代芳香烃，胺，叠氮基，巯基，胍基，羟基，羧基，醛基，硼酸盐，有机硼酸酯，磷酸盐，有机磷酸酯，有机金属，醚化物，硫醚，酯化物，氰化物，异氰酸酯，异硫氰酸酯，酮基，杂环，碳环，有机硅，酰胺，氨基甲酸盐和氢；如丙酮酸，草酰乙酸，α-酮戊二酸等。

醛缩酶催化的缩合反应示意如下：

本发明实施例中所使用的唾液酸醛缩酶为市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)，但不限于此。用上述唾液酸醛缩酶催化分别含有醛基和羰基的两种底物发生缩合反应，得到唾液酸类似物。该酶催化反应的条件为：将含有醛基的底物、含有羰基的底物和唾液酸醛缩酶溶于Tris-HCl(50mM,pH 8.0)缓冲液中进行缩合反应。所述缩合反应的温度为37℃。

上述方法合成的唾液酸类似物。

唾液酸醛缩酶在催化含醛基底物和含酮基底物合成唾液酸类似物中的应用。

上述的唾液酸类似物在制备神经氨酸酶抑制剂中的应用。

一种筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，是用上述方法制备的唾液酸类似物与神经氨酸酶特异性底物MUNANA竞争性地结合神经氨酸酶的活性位点，MUNANA在神经氨酸酶作用下产生的代谢产物在355nm照射激发下，可以产生460nm荧光，通过荧光强度的变化可以灵敏地检测神经氨酸酶的活性，从而得到神经氨酸酶抑制剂的作用效果。

本发明的有益效果：

本技术方案可以通过醛缩酶催化含有醛基的底物I或II或III或IV和含有羰基的底物V缩合得到唾液酸类似物，这些类似物以5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactonulosonic acid,Neu5Ac)或2-酮基-3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galactonononic acid，KDN)结构为基础或与其互为手性异构体，具备很好的作为神经氨酸酶抑制剂的潜能。

附图说明

图1为实施例1中分别以甘露糖和2-脱氧葡萄糖(含醛基的底物)与丙酮酸(含羰基的底物)反应，得到的产物经纯化后的NMR氢谱。

图2为实施例2中以鼠李糖(含醛基的底物)与丙酮酸(含羰基的底物)反应，得到的产物经纯化后的NMR氢谱。

图3为实施例3中分别以葡萄糖和半乳糖(含醛基的底物)与丙酮酸(含羰基的底物)反应，得到的产物经纯化后的NMR氢谱。

图4为实施例4中分别以阿拉伯糖和岩藻糖(含醛基的底物)与丙酮酸(含羰基的底物)反应，得到的产物经纯化后的NMR氢谱。

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实例。

实施例1酶法合成唾液酸类似物例1

以含醛基底物为甘露糖(Mannose)或2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose)为例说明。

合成方法：100mg甘露糖或2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose)，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法：

1.硅胶柱准备：230-400目柱层层析硅胶，洗脱剂为乙酸乙酯:冰醋酸:甲醇＝5:2.5:2.5(v:v:v)，层析柱规格(内径×长度)22mm×450mm，采用湿法装柱，将硅胶和适量的洗脱剂混匀，然后倾入层析柱中，用少量洗脱剂清洗层析柱内壁，适当加压，使填料紧实。最终柱高约200mm；

2.反应产物冻干后溶于700μL洗脱剂，小心转移至硅胶柱内，待其完全进入硅胶柱后，用700μL洗脱剂润洗冻干瓶，小心转移至硅胶柱内，待其完全进入硅胶柱，轻轻地沿层析柱内壁加洗脱剂，同时开始收集洗脱液，每管5mL收集洗脱液。

3.每管取10μL洗脱液，点样于TLC薄层析板(默克)上，以洗脱剂为展开剂进行展开，将地衣酚溶液(2mg/mL地衣酚溶于20％H₂SO₄)喷洒于样品展开后的TLC薄层析板上，加热至显色。R_f约0.3处为目标产物。合并仅含有目标产物的收集管，除去溶剂后即得到相应纯化的唾液酸类似物。

甘露糖与丙酮酸(pyruvate)缩合生成KDN，是唾液酸的核心结构之一，结构式如下：

2-脱氧葡萄糖与甘露糖的不同在于前者2号位上缺失了一个氧原子。2-deoxyglucose在与丙酮酸缩合后5号位上也缺失了一个氧原子，其结构式如下：

因而是以KDN为核心结构的衍生物。经过NMR验证，KDN的转化率为100％，其衍生物的转化率为35％，NMR氢谱图见图1。虽然醛缩酶对不同底物的转化率不同，但其底物的广谱性为开发出更多的唾液酸类似物提供了可行性。

实施例2酶法合成唾液酸类似物例2

以含醛基底物为鼠李糖(rhamnose)和核糖为例说明。

合成方法：100mg核糖或鼠李糖，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法同实施例1。

经过NMR验证，以鼠李糖为底物制备的KDN衍生物的转化率为5％，NMR氢谱图见图2。

实施例3酶法合成唾液酸类似物例3

以含醛基底物为葡萄糖(glucose)或半乳糖(galactose)为例说明。

合成方法：100mg葡萄糖或半乳糖，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法同实施例1。

经过NMR验证，分别以葡萄糖和半乳糖为底物制备的KDN衍生物的转化率分别为25％和40％，NMR氢谱图见图3。

实施例4酶法合成唾液酸类似物例4

以含醛基底物为阿拉伯糖(L-arabinose)或岩藻糖(L-Fucose)为例说明。

合成方法：100mg阿拉伯糖或海藻糖，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法同实施例1。

经过NMR验证，分别以葡萄糖和半乳糖为底物制备的KDN衍生物的转化率分别为15％和40％，NMR氢谱图见图4。

实施例5酶法合成唾液酸类似物例5

以含醛基底物为氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧葡萄糖或2-硫代葡萄糖为例说明。

合成方法：100mg氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧葡萄糖或2-硫代葡萄糖，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法同实施例1。

实施例6酶法合成唾液酸类似物例6

以含醛基底物为氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧半乳糖或6-脱氧氟(氯或溴或碘)代半乳糖为例说明。

合成方法：100mg氟[18F]-氟(氯或溴或碘)代脱氧半乳糖或6-脱氧氟(氯或溴或碘)代半乳糖，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法同实施例1。

实施例7酶法合成唾液酸类似物例7

以含醛基底物为5-脱氧葡萄糖或5-硫代葡萄糖为例说明。

合成方法：100mg5-脱氧葡萄糖或5-硫代葡萄糖，6倍物质的量的丙酮酸，2mg市售的唾液酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)溶于50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液，37℃反应12小时。

纯化方法同实施例1。

实施例8唾液酸类似物在筛选神经氨酸酶抑制剂上的应用

1)流感神经氨酸酶的制备：在长满犬肾细胞(MDCK)的培养瓶中加入含有一定甲或乙型流感病毒滴度的流感病毒培养液(含牛血清白蛋白1.2mg·mL^-1，胰酶5μg·mL^-1，其余同细胞培养液)继续孵育，待细胞完全被病毒感染病变后取培养液，离心，取上清，加入Nonidet P40(终浓度0.1％)作为原酶液，分装，-80℃冻存备用。

2)流感病毒神经氨酸酶的活性测定：酶促反应体系包含33mmol·L^-1MES(pH 3.5)，4mmol·L^-1CaCl₂,20μmol·L^-1MUNANA和一定量的酶溶液，终体积100μL，37℃孵育15min后加入150μL终止液(14mmol·L^-1NaOH，83％乙醇)终止反应，测定荧光强度值。设定参数：Ex：355nm，Em：460nm)。

3)高通量筛选神经氨酸酶抑制剂：向步骤2)的反应体系中加入筛选样品溶液10μL(样品浓度0.1mg·mL^-1)，加入33mmol·L^-1MES稀释的神经氨酸酶溶液30μL，混匀，37℃孵育，同时设置空白对照、酶活性对照、阳性对照扎那米韦。1h后按照优化的反应体系，加入各反应成分，其余操作步骤同神经氨酸酶活性测定。选择抑制效果好的抑制剂。

用实施例1～7制备的的唾液酸类似物与神经氨酸酶特异性底物MUNANA竞争性地结合神经氨酸酶的活性位点，MUNANA在神经氨酸酶作用下产生的代谢产物在355nm照射激发下，可以产生460nm荧光，通过荧光强度的变化可以灵敏地检测神经氨酸酶的活性。