本发明涉及一种利用生物酶转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的生产工艺，属于食品生物技术领域。
背景技术：
随着生活水平的日益提升，人们对食品安全也日渐重视，各种功能性食品和低热量甜味剂已进入市场，并受到消费者的高度关注。D-阿洛酮糖 (D-psicose/D-allulose)，是一种自然界中存在但含量极少的稀有糖类，为D-果糖C-3位的差向异构体；其甜度是蔗糖的70％，却仅提供相当于蔗糖0.3%的热量，是食品中蔗糖的最佳代替品。韩国希杰第一制糖株式会社和日本松谷集团分别于2011年和2013年向美国食品药品监督管理局 (FDA) 申请D-阿洛酮糖的“一般认为安全”(GRAS) 认定，都得到“没有问题”的答复。此外，阿洛酮糖在保健和医疗等领域也具有重要的应用价值。
D-阿洛酮糖主要有生物合成与化学合成两种途径。相较于化学合成，生物合成的方法更为环保，有利于后续产物的分离纯化，具有重大的经济效益和社会效益。韩国希杰第一制糖株式会社、日本松谷集团和英国泰莱公司是目前全球生产D-阿洛酮糖的三大厂家，他们均通过改良的重组菌株生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并利用该酶催化果糖生产D-阿洛酮糖，均已实现D-阿洛酮糖的商用化。与国外相比，国内对D-阿洛酮糖的研究相对落后。江南大学最先通过对鱼塘淤泥和水样筛选，得到一株能合成D-塔格糖3-差向异构酶的类球红细菌，其能催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，转化率最高达到6.54%。但是生物法也存在一定的弊端，目前酶法生产D-阿洛酮糖主要受制于所用酶的催化效率低、底物粘度大以及生产工艺繁琐等。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种酶法转化D-果糖高效制备D-阿洛酮糖的生产工艺，该法工艺简单，生产过程中不使用任何化学制剂且实现物料循环，是纯绿色制备D-阿洛酮糖的方法。
本发明的技术方案：通过研究酶液添加量、反应温度、底物起始浓度及反应时间四个因素对阿洛酮糖转化率的影响，确定酶法制备D-阿洛酮糖的最佳反应条件。在优化条件下利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶对D-果糖溶液进行转化，反应液经脱色、离交、浓缩、色谱分离、结晶等工艺制备液体或结晶阿洛酮糖，生产过程中物料可循环，色谱分离后的提余液、离心后母液进入循环进行酶转化，提高阿洛酮糖收率。阿洛酮糖含量或纯度利用高效液相色谱（HPLC）检测。
所涉及到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶由实验室自行发酵制备。
所涉及到的D-果糖为本公司产品，纯度达99%。
所述的D-阿洛酮糖含量或纯度的测定方法：
利用HPLC对生成的D-阿洛酮糖含量或纯度进行分析，根据保留时间定性，色谱峰面积归一化法定量。
所述的酶法制备反应条件的初步研究：
本发明中分别对影响阿洛酮糖酶法制备的4个因素 (酶液添加量、反应温度、底物起始浓度和反应时间) 进行单因素试验，每确定一因素将作为下一单因素实验的固定条件，最终获得的最佳条件用于D-阿洛酮糖的制备。
所述的酶法制备工艺主要包括酶转化、脱色、离子交换、浓缩、色谱分离、结晶工序。
本发明的有益效果：本发明提供了一种酶法转化D-果糖高效制备D-阿洛酮糖的生产工艺，该法工艺简单，生产过程中不使用任何化学制剂且实现物料循环，所用酶的催化活力较高，是纯绿色制备D-阿洛酮糖的方法，有较大的工业化生产和应用价值。
附图说明
图1：D-阿洛酮糖的酶法制备工艺图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
D-阿洛酮糖酶法制备条件的初步研究：
(1) 酶液添加量：以去离子水构建反应体系在50℃条件下，分别用不同的酶量 (10~50 μL×g-1 D-果糖) 将500 g×L-1的D-果糖溶液转化10 h，然后用HPLC测定反应体系中D-阿洛酮糖的含量。结果显示随着酶液添加量的增加，D-阿洛酮糖的含量逐渐增加，当酶液添加量达到30 μL×g-1 D-果糖时，最高含量为26.3%，然后逐渐降低。
(2) 反应温度：以去离子水构建反应体系在不同温度下 (50~60℃)，分别用30 μL×g-1 D-果糖的酶液添加量将500 g×L-1的D-果糖溶液转化10 h，然后用HPLC测定反应体系中D-阿洛酮糖的含量。结果显示D-阿洛酮糖的含量随温度升高而增加，当反应温度为55℃时，D-阿洛酮糖的含量最高可达26.8%；温度高于55℃时，酶转化能力下降。
(3) 底物起始浓度：以去离子水配制不同质量浓度的D-果糖溶液 (200~600 g×L-1)，分别用30 μL×g-1 D-果糖的酶液添加量在55℃下转化10 h，然后用HPLC测定反应体系中D-阿洛酮糖的含量。随着D-果糖溶液浓度的增加，D-阿洛酮糖的含量逐渐增加，在质量浓度为500 g×L-1时，D-阿洛酮糖的含量最高为28.1%，随后含量减少。
(4) 反应时间：以去离子水构建反应体系在55℃条件下，用30 μL×g-1 D-果糖的酶液添加量将500 g×L-1的D-果糖溶液转化不同的时间 (6~12 h)，然后用HPLC测定反应体系中D-阿洛酮糖的含量。结果显示随着反应时间的延长，D-阿洛酮糖的含量逐渐增加，当反应时间达到10 h时，D-阿洛酮糖的含量最高可达27.8%，然后有所减少。
实施例2
D-阿洛酮糖的酶法制备工艺流程
(1) 酶反应：以去离子水构建500 g×L-1的D-果糖溶液，酶液添加量为30 μL×g-1 D-果糖，反应温度55℃，反应时间10 h后升温至100℃灭酶。
(2) 脱色：加入料液干重0.1~5%活性炭，温度70~100℃保温30 min，采用陶瓷膜将活性炭脱除。
(3) 离交：料液经阳-阴-阳离子交换树脂除盐降低电导，要求糖浓30%时电导0~100 μs/cm。
工艺流程如图1所示，D-果糖经酶转化后得到D-阿洛酮糖含量达27-30%；反应液先经过活性炭脱色，后经离子交换树脂除盐再浓缩所得的阿洛酮糖糖浆1纯度达27-30%；将阿洛酮糖和果糖经过色谱分离，重新进行活性炭脱色、离交和浓缩所得的阿洛酮糖糖浆2纯度达98%以上；将糖浆2进行结晶，所得阿洛酮糖晶体纯度达99%以上。