TNFα的抗体及其用途的制作方法

专利名称：TNFα的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及TNFa (肿瘤坏死因子alpha)的抑制剂及其用途。具体而言，本发明 涉及TNFa的抗体的互补决定区、该抗体以及它们在制备治疗TNFa介导的疾病的药物中 的用途。
背景技术：
机体主要由单核细胞和巨噬细胞表达和分泌TNFa (肿瘤坏死因子alpha)，成熟 形式的TNFa是由单链分子量为17kD的多肽组成的三聚体。TNFa诱发炎症，导致组织损 伤。现研究表明TNFa介导了多种疾病，包括自体免疫性疾病、器官移植排斥、感染、脓毒血 症、肿瘤等。由于TNFa的各种伤害性的生理作用，筛选和鉴定TNF a的抑制剂可用于治疗 TNFa诱发的各种疾病，而单克隆抗体是目前非常理想的TNFa活性抑制剂。目前，市场上 已有三种TNFa的生物抑制剂在临床上用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关 节炎、克罗恩病(又称局限性肠炎或节段性肠炎)、银屑病、幼年特发性关节炎、溃疡性结肠 炎等多种免疫性疾病。这三种抑制剂分别是infiiximab、etanerc印t、adalimumab，其中 adalimumab是Abbott所开发的人源性抗体(US. PatentNo. 6090382)，该抗体是通过筛选和 鉴定一个巨大的人源抗体噬菌体显示文库所得。众所周知，单克隆抗体是由两条重链和两条轻链通过二硫键连接组成，而重链和 轻链分别由可变区和恒定区构成，其中可变区包括3个高变区和4框架区，高变区也就是 CDR区，(即互补决定区，complementarity-determining regions)，抗体的特异性由可变区 决定，抗体和抗原的亲合力也是由可变区所决定，尤其是CDR区影响抗体抗原的亲合力，而 抗体亲合力的大小直接决定了抗体的抑制效果。筛选和鉴定人源抗体噬菌体文库而获得治疗性单克隆抗体是一种常用的方法，但 是其缺陷是该方法鉴定的单克隆抗体的亲合力不够高，无法用于临床。并且全长的治疗性 单克隆抗体必须使用哺乳动物细胞表达，生产成本很高。因此存在降低生产成本，增加抗体 对TNFa的亲合力，提高治疗效果的需要。

发明内容
本发明通过抗体噬菌体显示技术通过模拟机体内CDR区氨基酸自然突变而提高 对抗体TNFa亲合力。本发明一方面提供一种TNFa的抗体或该抗体的抗原结合部分，包括轻链互补决 定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3，所述轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3 的氨基酸序列选自以下群组 SEQ ID NO :1-6、SEQ ID NO :7_12、SEQ ID NO : 13-18、SEQ ID NO : 19-24、SEQ ID NO :25_30、SEQ ID NO :31_36、SEQID NO :37_42、SEQ ID NO :43_48、SEQ ID NO 49-54,SEQ ID NO :55_60、或 SEQ IDN0 :61_66。具体而言，本发明提供的一种 TNF a 的抗体或该抗体的功能活性片段(例如CDR)的组合，该抗体包括6个特异性CDR区(即轻链 CDR1、CDR2、CDR3 和重链 CDR1、CDR2、CDR3)。另一方面，本发明还提供编码上述抗体或该抗体的抗原结合部分的多核苷酸。由 于密码子的简并性，本发明提供的多核苷酸可有多种并可根据表达需要根据宿主密码子偏 好性选择相应的序列。优选地，本发明中对应序列为SEQ ID N0:67-72、SEQ ID NO 73-78、 SEQ ID NO :79-84、SEQ ID NO :85_90、SEQ ID NO :91_96、SEQID NO :97_102、SEQ ID NO 103-108、SEQ ID NO : 109-114、SEQ ID NO :115_120、SEQ ID NO : 121-126 或 SEQ ID NO: 127-132。优选地，本发明的TNFa的抗体或该抗体的抗原结合部分的轻链互补决定区1、2、 3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列为SEQ ID NO :55_60。再一方面，本发明通过噬菌体显示技术突变adalimumab的⑶R区氨基酸，其中轻 链⑶R1、⑶R2、⑶R3和重链⑶R1、⑶R2、⑶R3中各有一个氨基酸被其他氨基酸取代，从而获 得了 11个比D2E7亲合力更高的克隆，所述11个克隆中轻链⑶R1、⑶R2、⑶R3和重链⑶R1、 CDR2、CDR3 的序列分别为 SEQ IDN0:1_6、SEQ ID N0:7_12、SEQ ID N0:13_18、SEQ ID NO: 19-24,SEQ ID N0:25-30、SEQ ID NO 31-36,SEQ ID NO 37-42,SEQ ID NO :43-48、SEQ ID NO :49-54、SEQID NO :55_60 和 SEQ ID NO :61_66。在抗体的CDR区确定后，本领域技术人员可根据现有技术构建含有本发明中CDR 区的抗体。例如，本发明提供轻链可变区序列为SEQ ID NO: 133，重链可变区序列为SEQ ID NO 134的TNFa的抗体，其包括序列为SEQ ID NO 55-60的CDR区(见图5)，也可使用本 发明其他组⑶R区替换上述序列中对应⑶R区而获得该组的全长抗体。此外，本领域技术 人员理解，本发明中的全长抗体中重链恒定区可以是gammaI、gamma2、gamma3或gamma4，轻 链的恒定区可以是kappa或lamda，而不影响其功能。本发明的抗体也包括这些保留本发明 所述CDR区而替换其他序列所获得的抗体。本发明也提供编码轻链可变区序列为SEQ ID NO :133，重链可变区序列为SEQID N0:134的TNFa的抗体的多核苷酸。由于密码子的简并性，本发明提供的多核苷酸可有多 种并可根据表达需要根据宿主密码子偏好性选择相应的序列。优选地，所述多核苷酸轻链 可变区序列为SEQ ID NO: 136，重链可变区序列为SEQ IDN0 :137。另一方面，本发明还提供上述抗体在制备治疗TNFa介导的疾病的药物中的用 途。TNFa介导的疾病包括炎症和组织损伤。具体地，所述疾病包括自体免疫性疾病、器官移植排斥、感染、脓毒血症和肿瘤等。所述的疾病也包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、克罗恩病、银屑 病、幼年特发性关节炎和溃疡性结肠炎等。本发明提供的TNFa的抗体或该抗体的抗原结合部分，增强了对TNF a的亲合力， 可以进一步提高抑制TNFa的能力，使用更低剂量的抗体即可达到相同的治疗效果，实现 治疗目的，大大减轻病人治疗费用，具有重要的经济价值和社会意义。


图1 根据D2E7的重链和轻链以及接头(linker)序列人工合成完整的核酸序列 的顺序图。
图2 :1B7号克隆噬菌体显示0D450nm吸光度值与野生型D2E7的比较。图3 1B7和D2E7中和TNF a活性的比较，显示波长570nm，参考波长630nm的0D值。图4 全长的1B7和D2E7抗体体内中和TNF a活性，显示小鼠存活率。图5 轻链可变区序列为SEQ ID NO :133 (图5A)，重链可变区序列为SEQ IDN0 134(图5B)的TNFa的抗体氨基酸序列结构图(氨基酸以单个字母表示)，其包括序列为 SEQ ID NO 55-60的⑶R区(方框内序列并加粗)，也可使用本发明其他组⑶R区替换上述 序列中对应CDR区而获得该组的全长抗体。
具体实施例方式术语说明除非另有说明，本发明中使用的术语具有本领域公知的含义。抗原是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物 在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性和反应原性。最常见的 抗原分子是大分子蛋白质，在本发明中，TNFa即作为抗原。抗体抗体是免疫系统用来鉴别和抑制外源物质的蛋白质复合体。抗体是具有4 条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对 分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构 成的单体分子。互补决定区(complementarity-determining region, CDR)整个抗体分子可分为 恒定区和可变区(v区)两部分。重链和轻链的v区分别称为Vj^nVp v区中，某些位置 的氨基酸的组成和排列顺序变化频率更高，这些区域称为高变区(hypervariable region, HVR)。VH和\各有三个高变区，VH和\的三个高变区共同组成抗原结合部位，该部位形成一 个与抗原决定簇互补的表面，故高变区又称为互补决定区(complementarity-determining region, CDR)，分别称为 CDR1、CDR2、CDR3。本发明中所有的氨基酸序列和多核苷酸序列可以通过本领域公知的方法人工合 成。实施例1材料和方法重组人肿瘤坏死因子 TNFa 购自 P印rotechAsia(Remcombinant HumanTNF- a , Cat 300-01A)。噬菌体显示试剂盒购自 Amersham Bioscience (Recombinant phage antibodysystem, Cat 27-9401-01)。D2E7 重链序列见 SEQ ID N0:151。D2E7 轻链序列见 SEQ ID NO :152。重链和轻链之间的接头序列(SEQ ID NO 138)5，-GGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGTTCA-3，，编码的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 135) :5，_ (Gly4Ser) 3_3，，共 15 个氨基酸。首先根据D2E7的重链和轻链以及接头(linker)序列，按照以下顺序人工合成完 整的核酸序列(Vh)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-接头序列 _ (Vj FR1-CDR1-FR2-CDR 2-FR3-CDR3-FR4 (D2E7scFv)，见图 1。
其次合成引物，通过PCR将⑶R区每个氨基酸的序列突变(突变的方法参照以 下文章1, John De Kruif, et al. J Mol Biol, 1995,248,97-105 ；2, Resi B. Gerstner, et al. J Mol Biol,2002,321,851-862 ；Felix F Fajdos, et al. J Mol Biol,2002，320， 415-428)。突变方法简单的说，就是合成多条突变引物，每条引物只突变一个CDR区内的任 意一个氨基酸，任何一个氨基酸突变均是随即突变(合成5条突变引物用于突变重链CDR1 区，合成17条突变引物用于突变重链⑶R2区，合成12条突变引物用于突变重链⑶R3区， 合成11条突变弓I物用于突变轻链CDR1区，合成7条突变弓|物用于突变轻链CDR2区，合成9 条突变引物用于突变轻链链CDR3区。)。所以使用该种突变方法，最终所得的全长序列中 将在每个CDR区突变一个氨基酸，和野生型D2E7序列相比，我们得到的每个完整的序列将 共突变6个氨基酸。突变CDR区以及筛选和鉴定高亲合力的突变克隆方法和步骤1，以D2E7 scFv为模板，在次基础上，5条用于突变重链⑶R1区的引物所构成的各 种突变组合得到重链突变⑶R1的文库(MHCDR1文库)。2，以MHCDR1文库为模板，在次基础上，17条用于突变重链⑶R2区的引物所构成的 各种突变组合得到重链突变的⑶R1⑶R2的文库(MHCDR1⑶R2文库)；3，以MHCDR1⑶R2文库为模板，在次基础上，12条用于突变重链⑶R3区的引物所构 成的各种突变组合得到重链突变的⑶R1⑶R2⑶R3的文库(MHCDR1⑶R2⑶R3文库)；4，将步骤3来源的PCR产物使用Sf i I和Not I酶切，回收酶切产物；5，将pCANTAB5E使用相同的Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；6，将步骤十和步骤i^一来源的核酸连接(T4DNA ligase，Promega产品)，16°C，过 夜连接；7，将连接过夜的产物通过电转方式，转染大肠杆菌TG1，得到MHCDR1⑶R2⑶R3细
菌文库；8，用M13K07辅助噬菌体感染MHCDR1CDR2CDR3细菌文库，30°C，扩增过夜，得到的 噬菌体上清用PEG沉淀，重悬后的噬菌体待用；9，以 TNFa 作为抗原，固定到 Maxisorp Star (Nunc 产品)，37°C，1 小时；10，制备的噬菌体结合固定的抗原TNF a，室温，结合1小时；11，结合的噬菌体用triethylamine洗脱，并重新感染TG1细菌，37°C，1小时，铺上 2YTAG平板；12，挑单个TG1菌落，再次用M13K07辅助噬菌体感染细菌，30°C，扩增过夜，得到的 噬菌体上清用于噬菌体Elisa(抗原为TNF a，检测用HRP偶链的抗M13噬菌体抗体检测， TMB过氧化合物作为底物，检测450nm吸光度)；13，以野生型D2E7的噬菌体作为对照，保留比野生型D2E7的噬菌体Elisa值更高 的克隆；14，抽提这些亲和力更高的克隆的质粒，混合在一起作为模板；15，以步骤14来源的质粒为模板，在次基础上，11条用于突变轻链⑶R1区的引物 所构成的各种突变组合得到轻链突变CDR1的文库(MLCDR1文库)。16，以MIXDR1文库为模板，在次基础上，7条用于突变轻链⑶R2区的引物所构成的各种突变组合得到轻链突变⑶R1⑶R2的文库(MIXDR1⑶R2文库)。17，以MIXDR1⑶R2文库为模板，在次基础上，9条用于突变轻链⑶R3区的引物所构 成的各种突变组合得到轻链突变⑶R1⑶R2⑶R3的文库(MIXDR1⑶R2⑶R3文库)。18，将步骤17来源的PCR产物使用Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；19，将pCANTAB5E使用相同的Sfi I和Not I酶切，回收酶切产物；20，将步骤三十和步骤三i^一来源的核酸连接(T4DNA ligase，Promega产品)， 16°C，过夜连接;21，将连接过夜的产物通过电转方式，转染大肠杆菌TG1，得到MIXDR1⑶R2⑶R3细
菌文库；22，用M13K07辅助噬菌体感染MLCDR1CDR2CDR3细菌文库，30°C，扩增过夜，得到的
噬菌体上清用PEG沉淀，重悬后的噬菌体待用；23，以 TNFa 作为抗原，固定到 Maxisorp Star (Nunc 产品)，37°C，1 小时；24，制备的噬菌体结合固定的抗原TNF a，室温，结合1小时；25，结合的噬菌体用triethylamine洗脱，并重新感染TG1细菌，37°C，1小时，铺上 2YTAG平板；26，挑单个TG1菌落，再次用M13K07辅助噬菌体感染细菌，30°C，扩增过夜，得到的 噬菌体上清用于噬菌体Elisa(抗原为TNF a，检测用HRP偶链的抗M13噬菌体抗体检测， TMB过氧化合物作为底物，检测450nm吸光度)；27，以野生型D2E7的噬菌体作为对照，保留比野生型D2E7的噬菌体Elisa值更高 的克隆；28，抽提亲和力更高的克隆的治疗并测序。测序结果根据上述突变的方法，位于重链和轻链的每个CDR区分别突变一个氨基酸，每个 克隆共突变6个氨基酸，而可变区内的框架区序列同D2E7序列完全一致，没有任何突变，采 用公知的测序方法测序，结果如下(野生型轻链CDR1、2、3、重链CDR1、2、3的氨基酸序列见 序列表SEQ ID NO :139-144，对应多核苷酸序列见SEQ ID NO :145_150 ；以下只列出CDR区 序列，而与D2E7相同的框架区序列没有列出，其中下面一行为其氨基酸序列，上面一行为 其多核苷酸序列)。共鉴定到11个比D2E7亲合力更高的克隆(每个克隆的IXDR1、2、3和HCDR1、2、3 为一组，共 11 组，其氨基酸序列为 SEQ ID NO 1-6,SEQ ID NO :7_12、SEQ ID NO :13_18、SEQ ID NO 19-24, SEQ ID NO :25-30、SEQ ID NO :31_36、SEQID NO :37-42、SEQ ID NO :43-48、 SEQ ID NO 49-54, SEQ ID NO :55-60 和 SEQ IDN0 :61_66。对应的多核苷酸序列为 SEQ ID N0:67-72、SEQ ID NO 73-78,SEQ IDN0 :79-84、SEQ ID NO 85-90,SEQ ID N0:91_96、SEQ ID NO :97-102,SEQ IDN0 103-108,SEQ ID NO 109-114,SEQ ID NO :115_120、SEQ ID NO: 121-126 或 SEQ ID NO 127-132) 1:4E6 轻链 CDR 序列LCDR1 :CGGGCAAGTCAGGGCAAGAGAAATTACTTAGCCRASQGKRNYLALCDR2 GCTGCATCCACTTGGCAATCA
7
AASTffQSLCDR3 CAAAGGTATAACCGTTCGCCGTATACTQRYNRSPYT4E6重链CDR序列
HCDRl :GATACGGCCATGCACDTAMHHCDR2 GCTATCACTTGGCATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCAITffHSGHIDYADSVEGHCDR3 :GTCTCGTACCTTAGCACCGATTCCTCCCTTGACTATVSYLSTDSSLDY2 :3C9 轻链 CDR 序列LCDRl :CGGGCAAGTAATGGCATCAGAAATTACTTAGCCRASNGIRNYLALCDR2 GCTGCATCCACTTTTCAATCAAASTFQSLCDR3 CAAAGGTATAACAAGGCACCGTATACTQRYNKAPYT3C9重链CDR序列HCDRl :GATCATGCCATGCACDHAMHHCDR2 GCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATTCGGACTCTGTGGAGGGCAITffNSGHIDYSDSVEGHCDR3 :GTCTCGTACCTTAGCACCGCGGAGTCCCTTGACTATVSYLSTAESLDY3 :2F10 轻链 CDR 序列LCDRl:CGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAAGTRASQGIRNYLSLCDR2 GCTGCATATACTTTGCAATCAAAYTLQSLCDR3 CAAAGGTATAACCGTGCACAGTATACTQRYNRAQYT2F10 重链 CDR 序列HCDRl :GATTATGCCTTTCACDYAFHHCDR2 :GCTATCACTTGGAATAGTGCGCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCAITffNSAHIDYADSVEGHCDR3 GTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTCAGTATVSYLSTASSLQY4:3D8 轻链 CDR 序列
LCDRlCGGGCAAGTCAGGGCCTGAGAAATTACTTAGCCR A S Q G L R N Y L ALCDR2 GCTGCATCCACTTTGCAACATAASTLQHLCDR3 CAAAGGTATAACCGTCCTCCGTATACTQ R Y N R P P Y T3D8重链CDR序列HCDRl :GATCATGCCATGCACDHAMHHCDR2 :GCTATCTCGTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCAISffNSGHIDYADSVEGHCDR3 :GTCCAGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATVQYLSTASSLDY5 :2C 11 轻链 CDR 序列LCDRl:CGGGCAAGTAATGGCATCAGAAATTACTTAGCCRASNGIRNYLALCDR2 GCTGCATCCACTTTGCAACATAASTLQHLCDR3 CAAAGGTATAACCGTACGCCGTATACTQRYNRTPYT2C11 重链 CDR 序列HCDRl :GATACTGCCATGCACDTAMHHCDR2 :GGTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCGITffNSGHIDYADSVEGHCDR3 :GTCAATTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATVNYLSTASSLDY6 :D2E7 轻链 CDR 序列LCDRl CGGACGAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAGCCRTSQGIRNYLALCDR2 GCTGCATCCACTTTGCGGTCAAASTLRSLCDR3 CAAAGGTATAACCGTGCACCGTATTCGQRYNRAPYSD2E7 重链 CDR 序列HCDRl :GATTATGCCATTCACDYAIHHCDR2 :GCTATCACTTGGAATAGTACGCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCAITffNSTHIDYADSVEG
HCDR3 :AATTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATNSYLSTASSLDY7 :3B 12 轻链 CDR 序列 LCDRl:CGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACATTGCCRASQGIRNYIALCDR2 GCTGCAAAGACTTTGCAATCAAAKTLQSLCDR3 CAAAGGTATAACCAGGCACCGTATACTQRYNQAPYT3B12 重链 CDR 序列HCDRl :GATCAGGCCATGCACDQAMHHCDR2 :GCTATCACTTGGAATAATGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCAITffNNGHIDYADSVEGHCDR3 :GTCTCGTACCTTAGCACCGGTTCCTCCCTTGACTATVSYLSTGSSLDY8:4A6 轻链 CDR 序列LCDRl:CGGGCAAGTCAGGGCATCAGACAGTACTTAGCCR A S Q G I R Q Y L ALCDR2 GCTGCAGAGACTTTGCAATCAAAETLQSLCDR3 CAAAGGTATGAGCGTGCACCGTATACTQ R Y E R A P Y T4A6重链CDR序列HCDRl :GATTATTCGATGCACDYSMHHCDR2 :GCTATCGCGTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCAIAffNSGHIDYADSVEGHCDR3 :GTCTCGTACAGGAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATVSYRSTASSLDY9 :4D10 轻链 CDR 序列LCDRl:CGGGCAAGTAAGGGCATCAGAAATTACTTAGCCRASKGIRNYLALCDR2 GCTGCATCCACTTCGCAATCAAASTSQSLCDR3 :ACGAGGTATAACCGTGCACCGTATACTTRYNRAPYT4D10 重链 CDR 序列HCDRl :GATTATCATATGCACHCDR2 GCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTTCTGAGGGC
AITWNSGHIDYADSSEG HCDR3 GTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCAAGCTTGACTAT VSYLSTASKLDY
10:1B7 序列 轻链CDR序列
LCDR1 CGGGCAAGTCAGGAGATCAGAAATTACTTAGCC
RASQEIRNYLA LCDR2 GCTGCATCCTCGTTGCAATCA
A A S S L Q S LCDR3 CAAAGGTATGATCGTGCACCGTATACT
QRYDRAPYT 重链⑶R序列 HCDR1 :CAGTATGCCATGCAC Q Y A M H
HCDR2 GCTATCACTTGGAATAGTGGTCACCATGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC
AITWNSGHHDYADSVEG HCDR3 GTCTCGTACCTTCCTACCGCGTCCTCCCTTGACTAT VSYLPTASSLDY
11:5F4轻链⑶R序列
LCDR1 CGGGCAAGTCAGGATATCAGAAATTACTTAGCC
RASQDIRNYLA LCDR2 GCTGCATCCACTTTTCAATCA
A A S T F Q S LCDR3 CAAAAGTATAACCGTGCACCGTATACT
QKYNRAPYT 5F4重链⑶R序列 HCDR1 :CATTATGCCATGCAC H Y A M H
HCDR2 GCTATCACTTATAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGC
AITYNSGHIDYADSVEG HCDR3 GTCTCGTACCTTAGCACCGCGGAGTCCCTTGACTAT
VSYLSTAESLDY 噬菌体Elisa结果表明以上11个克隆对TNFa的亲合力比野生型D2E7高，其中 编号为1B7的克隆其亲合力最高。 将含有D2E7和1B7表达质粒的TG1菌落在96孔板培养过夜，再用M13K07辅助噬 菌体感染细菌，30°C，扩增过夜，得到的噬菌体上清用于噬菌体Elisa (抗原为TNF a，检测 用HRP偶链的抗M13噬菌体抗体检测，TMB过氧化合物作为底物，检测450nm吸光度)。1B7号克隆噬菌体显示0D450nm吸光度值大约是野生型D2E7的2倍，见图2。实施例2以1B7为例，进一步深入研究了每一个突变氨基酸对其亲合力的影响。和野生型D2E7相比，1B7号克隆在重链和轻链的每一个CDR区均突变了一个氨基酸，共突变了 6个氨 基酸，将每个突变的氨基酸进行回复突变，即将其突变的氨基酸恢复为野生型的序列，噬菌 体Elisa结果表明，重链CDR2区的氨基酸回复(His突变为lie)突变并不影响抗体的亲合 力，但其他5个氨基酸回复突变会影响抗体的亲合力。换句话说，其余的5个氨基酸突变均 能提高D2E7的亲合力。突变方法和噬菌体Elisa方法如上所介绍。实施例3 全长抗体的表达和纯化材料和方法中国仓鼠卵巢细胞CHO购自ATCC，重组蛋白A rProtein A购自GEHealthcare Bio-Sciences AB (rProtein A Sepharose Fast Flow, Cat 17-1279-03),蛋白 G(Protein G)购自 GE Healthcare Bio-Sciences AB(rProtein A Sepharose 4 FastFlow, Cat 17-0618-06)。全长的抗体，包括重链的可变区和恒定区(人的gammal、gamma2, gamma3、gamma4 区)，轻链的可变区和恒定区(人的kappa或λ区)，通常需要在哺乳动物细胞表达才有治 疗活性。常用的的哺乳动物细胞包括CH0、NSO、COS、SP2、293等细胞。抗体的重链和轻链 可以在不同的载体分开表达，也可在同一个载体上表达。载体通常需要筛选标记基因，常用 的标记基因为 dihydrofolate reductase (DHFR)基因(筛选药物为 methotrexate)，neo 基 因(筛选药物为G418)。构建好的载体可以通过化学转染方法，也可通过电转方法，稳定转染哺乳动物细 胞，并在筛选药物的作用下扩增，提高细胞的表达量。全长的抗体可以通过Protein A或Protein G亲和层析从培养基获得，再经过离 子交换层析和分子筛等纯化步骤，抗体纯度可达到药用级别。实施例4 全长抗体的功能研究材料和方法小鼠成纤维细胞L929购自ATCC (ATCC number CRL-2148)，放线菌素 DActinomycin-D ^ g sigma (Actinomycin-D, Cat :A4262)，3_ (4，二 申■)_2， 5-二苯基溴化四唑 MTT 购自 sigma(hiazolyl Blue TetrazoliumBromide, Cat :M5655), C57BL/6 购自维通利华，氨基半乳糖 D-galactosamine 购自 sigma (D-galactosamine，Cat G-0500)。为验证1B7的功能，首先将其重链和轻链的可变区分别连接到哺乳动物细胞抗体 表达载体中(重链恒定区为gamma 1，轻链恒定区为kappa，其多核苷酸轻链序列为SEQ ID N0:136，重链序列为SEQ ID NO 137)，质粒电转到CHO细胞，筛选和鉴定到高表达细胞株， 在无血清培养基中大量培养后，分离和纯化用于功能研究。一，体外中和TNF α活性TNFa能诱导小鼠L929细胞凋亡，用以下试验来验证1Β7和D2E7中和TNFa活 性
操作流程1.将对数生长期的L929细胞50μ 1按50 X IO4个/孔接种于96孔板中，含4 μ g/ ml 的 Actinomycin-D (放线菌素 D)；2.将抗体1B7、野生型的D2E7，配制成浓度2 X 10_8M，按1/3倍比稀释；3.将稀释好的抗体100 μ 1与浓度2 X 103pg/ml rhTNF α (重组肿瘤坏死因 子)50 μ 1混勻37°C孵育30分钟；4.将孵育后的混合物150μ 1加入相对应的细胞孔中，将96孔板放入37°C，5%C02 孵箱中培养18小时；5.小心吸去 100 μ 1 上清，加入 50 μ 1/孔 MTT (3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二 苯基溴化四唑)将96孔板放入37°C，5% CO2孵箱中培养4小时；6.加入20% SDS 50 μ 1/孔将96孔板放入37°C ,5% CO2孵箱中培养16小时；
7.用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm分别测各孔OD值。试验结果图3所示。全长的1B7中和TNFa IC50(半抑制率)所需量大约是野生 型全长的D2E7的1/25，换句话说，1B7在体外中和TNF α的能力是D2E7的25倍。二，体内中和TNFa活性TNFa和致敏剂D-galactosamine可导致小鼠死亡，TNF α的中和试剂可保护小鼠 不致死，为验证1B7在体内中和TNFa活性的能力，按照以下方法测定1B7和D2E7的体内 中和TNF α能力。C57BL/6测抗体保护存活率1.购SPF级C57BL/6 (维通利华)6周龄30只，6只/组，分5组；2. IP (腹腔注射)0. 5ml/ 只，分别注射 PBS,5 μ gA3、15 μ gA3、5 μ gAO、15 μ gAO ；3. 30分钟后IP 0. 5ml/只，含有1 μ g rhTNF α (重组肿瘤坏死因子)和 20mgD-galactosamine (氛基半乳糖)；4. 24小时后观察死亡情况。试验结果如图4。全长的1B7和D2E7抗体体内中和TNF α活性，15 μ g的抗体均能 保护小鼠TNF α致死，但是使用5 μ g的抗体时，全长的1B7能使小鼠存活率大约达到70%， 而全长的D2E7能使小鼠存活率仍然是0。这一结果表明1B7体内中和TNFa的能力远远强 于 D2E7。序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>TNFa的抗体及其用途<130>890058CG<160>152<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>1
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14
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一种TNFα的抗体或该抗体的抗原结合部分，包括轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3，其特征在于，所述轻链互补决定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列选自以下群组SEQ ID NO1-6、SEQ ID NO7-12、SEQ ID NO13-18、SEQ ID NO19-24、SEQ ID NO25-30、SEQ ID NO31-36、SEQID NO37-42、SEQ ID NO43-48、SEQ ID NO49-54、SEQ ID NO55-60或SEQ IDNO61-66。
2.编码如权利要求1所述抗体或该抗体的抗原结合部分的多核苷酸，其序列选自以下 群组 SEQ ID N0:67-72、SEQ ID NO 73-78、SEQ ID NO : 79-84、SEQ IDNO :85_90、SEQ ID NO: 91-96,SEQ ID NO :97-102、SEQ ID NO :103_108、SEQ IDNO 109-114,SEQ ID N0:115_120、 SEQ ID NO : 121-126 或 SEQ ID NO :127_132。
3.根据权利要求1所述的抗体或该抗体的抗原结合部分，其特征在于，其轻链互补决 定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列为SEQ ID NO :55_60。
4.根据权利要求3所述的抗体或该抗体的抗原结合部分，其特征在于，其轻链互补决 定区1、2、3和重链互补决定区1、2、3的氨基酸序列中各有一个氨基酸被其他氨基酸取代。
5.根据权利要求1所述的抗体或该抗体的抗原结合部分，其特征在于其轻链可变区序 列为SEQ ID NO 133，重链可变区序列为SEQ ID NO :134。
6.编码如权利要求5所述的的抗体或该抗体的抗原结合部分的多核苷酸，其轻链可变 区序列为SEQ ID NO: 136，重链可变区序列为SEQ ID NO :137。
7.如权利要求1、3、4、5任意一项所述的的抗体或该抗体的抗原结合部分在制备治疗 TNFa介导的疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，所述的疾病包括炎症和组织损伤。
9.根据权利要求7所述的用途，所述的疾病包括自体免疫性疾病、器官移植排斥、感 染、脓毒血症和肿瘤。
10.根据权利要求7所述的用途，所述的疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑 病关节炎、克罗恩病、银屑病、幼年特发性关节炎和溃疡性结肠炎。
全文摘要
本发明涉及TNFα的抗体及其用途。通过对TNFα的抗体的互补决定区进行突变，发现了高亲和力的TNFα的抗体互补决定区及全长抗体。高亲和力的TNFα的抗体可用于制备治疗TNFα介导的疾病的药物。本发明抗体在5μg剂量水平时，小鼠的存活率在70％以上。
文档编号A61P29/00GK101875694SQ20091008320
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者左瑾, 常永生, 方福德, 董学雨 申请人:中国医学科学院基础医学研究所