专利名称：含有重组人α-2b干扰素的重组乳酸菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种含有重组人a-2b干扰素的重组乳酸 菌及其应用。
背景技术：
a-2b干扰素属于I型干扰素，是机体白细胞分泌的一种有广谱抗病毒、抗肿瘤 及免疫调节作用的细胞因子。自1987年Isaacs和Lindermann发现干扰素以来，人类 就一直试图将其应用于临床。而直到20世纪70年代后期，随着基因工程技术的出 现及发展，用这种方法生产的干扰素才进入了工业化生产，并且大量投放市场。 目前，经大肠杆菌和中国仓鼠卵细胞表达的重组人a-2b干扰素在临床上得到 广泛应用，主要用于治疗由病毒引起的白血病、乙型、丙型肝炎等。重组干扰 素蛋白需要连续注射高剂量药才能达到治疗效果，且在血液中易被降解易产生 副作用，还可能产生中和抗体。因此有必要研究开发新型的给药方式，以提高 干扰素在体内的作用，延长在体内的半衰期和降低免疫原性。
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)千百年来广泛应用于食品加工工业，
是公认的安全(GRAS)的食品级微生物。乳酸菌的主要作用包括改善食品风味、
防止食品腐败、增加养分、平衡消化道菌群、降低胆固醇、控制内毒素等。而 分子生物学技术的不断进步为探索其新的应用潜力提供了基础如利用基因工
程乳酸菌在生物反应器内发酵食品或直接在人和动物消化道内生产蛋白等，其 中最有前景的应用即是乳酸菌作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表 面，继而同时诱导黏膜免疫和系统免疫。
Wells等发现用表达破伤风毒素片段C(tetanus toxin， TTFC)的重组乳酸 乳球菌给小鼠口服免疫后，能使小鼠免受致死剂量的TTFC攻击(Wells JM， Wilson PW (1993) Lactococcus lactis: high-level expression of tetanus toxin fragment C and protection against lethal challenge. Mol Microbiol. 1993 8(6) :1155-62)。表达细胞因子的乳酸乳球菌也可以有效刺激黏膜免疫应 答。表达有IL-12的重组乳酸乳球菌与表达HPV16(人乳头状瘤病毒)E7抗原的 重组乳酸乳球菌共同免疫小鼠后，检测到Thl细胞因子、IL-2、 IFN-y的分泌水平均增加，能有效保护小鼠免受HPV-16诱导的肿瘤的攻击 (Bermudez-Humaran LG， Cortes-Perez NG， Lefevre F (2005) A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL—12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J" Immunol, 175， 7297-302)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人a -2b干扰素的重组乳酸菌及其应用。 本发明的重组人a-2b干扰素的编码基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序
列
1) 序列表中序列l所示的核苷酸序列；
2) 在高严谨条件下与序列表中序列l的核苷酸序列杂交且编码重组人a -2b干 扰素的核苷酸序列；
3) 与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码重组人 a-2b干扰素的核苷酸序列。
所述的高严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲 液，pH7.2， 7%SDS)中，65。C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.2， 7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65。C杂交12hr;弃杂 交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2， 5%SDS) ， 65。C洗膜2次，每 次30min;加入洗膜液II(20隨ol/L磷酸钠缓冲液，pH7. 2， 1%SDS) ， 65。C洗膜30min。
含有上述重组人a -2b干扰素的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系也在 本发明的保护范围内。
本发明的另一 目的在于提供一种重组乳酸菌，是将含有所述的重组人a -2b干 扰素的编码基因的DNA分子导入乳酸菌中，获得该重组乳酸菌。
为了便于重组乳酸菌分泌蛋白，所述重组人a-2b干扰素的编码基因的5'端连 有编码信号肽的DNA分子。
所述信号肽的氨基酸序列为序列表的序列2。
本发明的又一 目的在于提供所述的重组乳酸菌在制备重组人a -213干扰素中的 应用。
本发明的又一目的在于提供所述的重组乳酸菌在制备抗病毒、抗肿瘤药物中的 应用。本发明还提供一种抗病毒、抗肿瘤的药物，其活性成分为上述的重组乳酸菌。 将含有重组人a-2b干扰素的编码基因的乳酸菌作为载体，表达内源或外源蛋 白，可以不经表达后加工而直接服用或给药，在功能食品、医疗保健等方面具有非 常诱人的前景。已有的实验证实了乳酸乳球菌可有效提高黏膜免疫系统提呈抗 原及诱导特异性免疫应答的能力，具有成为新型口服疫苗诱导黏膜免疫应答的 潜力。
图1为重组人a-2b干扰素原核表达载体pNZ-ifnm的构建示意图2为重组人a-2b干扰素在乳酸菌中诱导表达产物的western-blot检测结
果；
图3为重组人a-2b干扰素在乳酸菌中诱导表达产物的具体定位的
western-blot结果；
图4为工程菌NZ(pNZ-ifnm)表达人干扰素的定量检测结果； 图5为工程菌NZ(pNZ-ifnm)表达人干扰素的活性测定结果。
具体实施例方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。 实施例1含有重组人a-2b干扰素的重组乳酸菌的制备及表达产物检测 一、含有重组人a-2b干扰素的重组乳酸菌的制备
1. 重组人a-2b干扰素基因的合成
根据乳酸菌偏爱密码子表，在不改变天然人干扰素a-2b的氨基酸序列的情况 下，将其基因序列替换为含乳酸菌偏爱密码子的序列，见序列表的序列1。合成的重 组人a-2b干扰素基因命名为i/)M7。
2. 构建重组表达载体 重组表达载体的构建流程见图1。
(1) 将基因ifnm通过5"scl和tT/mI位点连接到pUC57质粒上(Fermentas)， 所得到的含有上述重组人a-2b干扰素基因的重组载体命名为pUC57-ifnm，并经测 序验证其正确性。
(2) 将跨膜信号肽Usp45的编码序列连接到上述重组载体pUC57-ifnm中 根据乳酸菌信号肽Usp45的编码序列(Genbank号M60178)设计引物，并在引物序列的两端分别添加上限制性内切酶^coRI和5"scl的识别位点，引物序列如下
引物1 (上游引物)5' - CGCGGATCCATGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3'(带下划线碱 基为限制性内切酶^boRI的识别位点)
引物2(下游引物)5' - CGCTGAGCTCAGCGTAAACACCTGACAAC -3'(带下划线碱 基为限制性内切酶^cl的识别位点)
以乳酸乳球菌MG1363(Gasson MJ (1983) Plasmid complements of Streptococcus lactisNCD0 712 and other lactis streptococci after protoplast-induced curing. J Bacteriol 154:1-9)(中国科学院微生物研究所) 的基因组DNA为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增，扩增条件为94°C 15sec， 56 °C 15sec， 72°C 25sec，共30个循环。
反应结束后，PCR扩增产物用限制性内切酶fcoRI和5^cI进行双酶切，回收 100bp的酶切产物，纯化后与同样双酶切的载体pUC57-ifnm 16。C连接16小时，将连 接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含100ug/mL氨苄青霉素的LB 抗性平板筛选阳性转化子，提取阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶^coRI 和&cl进行酶切鉴定，经双酶切得到100bp片段的质粒为阳性克隆。再对阳性克隆 质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为引物1和引物2，对PCR产物进行测序， 测序结果表明乳酸菌信号肽Usp45的编码序列已插入pUC57-ifmn中且序列正确，信 号肽Usp45的编码序列是Genbank号M60178的5，末端第101位到181位，编码序列 表序列2的氨基酸。将此含乳酸菌信号肽Usp45编码序列及重组人a -25干扰素编码 序列的重组载体命名为pUC45-ifnm。 (3)乳酸菌表达载体的构建
以pUC45-ifnm为模板，设计使用P3, P4引物进行PCR扩增，扩增包含有Usp45 信号肽及重组人a-2b干扰素编码基因的融合片段。
P3: 5' -CATGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3'(带下划线碱基为限制性内切 酶Afca[的识别位点)
P4: 5' -CGCTGGTACCTTATTCTTTAGAACGTAAAG-3'(带下划线碱基为限制性内切 酶f/wl的识别位点)
扩增条件为94°C 30sec， 56°C 30sec， 72°C 90sec，共30个循环。
反应结束后，对PCR扩增产物用限制性内切酶7fca[和^OTl进行双酶切，再将 600bp的酶切产物纯化后与同样双酶切并经纯化的载体pNZ8048( Kuipers, 0. P.，P. G. G. A. d. Ruyter， M. Kleerebezem & W. M. d. Vos (1998) Quorum sensing—controlled gene expression in lactic acid bacteria. /j57ofec力/ cL/, 64:15-21)(中科院微生物研究所)在16。C下连接16小时，将连接产物用氯化钙法 转化大肠杆菌MC1061 (ATCC47035)感受态细胞，用含10ug/mL氯霉素的LB抗性平 板筛选阳性转化子，提取阳性转化子中的重组质粒，用限制性内切酶lot和^^1 进行酶切鉴定，经双酶切能得到600bp片段的质粒为阳性克隆。再对阳性克隆质粒 用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为P3和P4，对PCR产物进行测序，测序结 果表明乳酸菌信号肽Usp45及重组人a-2b干扰素的编码序列已插入pNZ8048中且 序列正确，得到干扰素的诱导型分泌载体，命名为pNZ-ifmn。 3.重组乳酸菌的制备
将干扰素乳酸菌诱导型分泌表达载体pNZ-ifnra转化乳酸乳球菌厶 NZ9000( Kuipers， 0. P. ， P. G. G. A. d. Ruyter， M. Kleerebezem & W. M. d. Vos (1998) Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. /A'"ec力加,64:15-21)(中科院微生物研究所)，用含5 u g/mL氯霉素的GM17 抗性平板(胰蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨0.5%，牛肉浸膏0.5%，酵母提取物0.25 %，葡萄糖0.5%，维生素C0.05X， 0-甘油磷酸钠1.9%，硫酸镁lmmol/L)筛 选阳性转化子，提取阳性转化子中的重组质粒，用引物P3和P4进行PCR扩增，PCR 扩增得到600bp目的片段的转化子为干扰素诱导型表达工程菌，命名为 NZ(pNZ-ifnm)。
二、 基因的表达
将pNZ8048载体转化乳酸菌，作为对照，命名为NZ (pNZ8048)。将NZ (pNZ-ifnm) 和NZ (pNZ8048)分别接种于含有5 w g/mL氯霉素的GM17液体培养基的试管中，30 。C静置培养12小时，再按2X接种量接种于新鲜的GM17液体培养基中，3(TC静置 培养3小时至0De。。值为0. 5-0.6，然后加入终浓度为lng/mL的乳酸链球菌素(Nisin) 进行诱导，在3(TC下静置诱导3小时。对照同样处理。
三、 表达产物的western-blot鉴定
取诱导型表达产物1. 35ml于4°C以4300g离心5分钟，分别收集得到上清液1 及细胞沉淀l。
在上清液1加入100%三氯乙酸(TCA)150ul混匀，使TCA终浓度为10。/。，冰浴 10分钟后，于4'C以11， 500g离心10min,得到的沉淀2，以lml冰冷的丙酮洗涤2次后晾干，并重悬于50ul 50mMNaOH中，所得液体为上清2。
将细胞沉淀1重悬于1/10体积的PBS中，超声破碎。待菌液清亮后，于4t:以 13200g离心IO分钟，弃掉含有未破碎细胞及细胞碎片的沉淀3，取上清，即为上 清3存放于-2(TC或4"C。
对重组人干扰素进行更详细的定位时，需将细胞壁与膜组分的进行进一步分 离，具体方法为将细胞沉淀1以TES(10mM Tris-HC1， pH8. 0， lmM EDTA， 25%蔗 糖)洗涤一次，并以1/10(体积百分比)的TES-LMR(TES中加入溶菌酶10mg/ml，Rnase 0. lmg/ml)重悬，37。C温育30分钟后，于4°C以2500g离心10分钟，获得上清4 和沉淀4，将上清4以10% TCA沉淀，重悬于50ul 50mMNaOH中，即为胞壁释放的 蛋白；沉淀4为原生质体，以TES洗涤后，重悬于500ul PBS (NaCl 137 mM, KC1 2. 7 raM， Na2HP04 10 mM， KH2P04 2 mM， pH 7. 4)中，随后冻融5次，于4。C以21000g离 心45分钟，获得上清5和沉淀5。上清5中含有胞质组分，以TCA沉淀后重悬于 50ulTE(10mMTris-Hcl， pH8. 0， lmMEDTA)中;沉淀5为膜组分，以50ul含有1%SDS 的TE溶解。
对细胞的不同组分进行Western-blot鉴定，具体方法如下
1) SDS-PAGE
采用Tris-甘氨酸电泳系统对收集的各细胞组分进行SDS-PAGE (分离胶浓度为 12%)，方法为取待测样品液15uL，加入6求样品缓冲液3wL (含100mmol/L Tris-HC1， pH6. 8， 200mmol/L DTT， 4%SDS， 0. 2%溴酚蓝，20%甘油)，水浴煮 沸5min，上样后用25mA稳流电泳，待溴酚兰进入分离胶后，改用35 mA电泳至玻 璃板底部。
2) 免疫杂交
SDS-PAGE电泳结束后，不对胶染色，进行Western-blot分析，具体方法为 将胶用蒸馏水冲洗并在电转移液(25mM Tris， 192mM甘氨酸，pH8. 3， 20%甲醇) 中浸润15分钟。裁好的PVDF膜先用甲醇润湿20秒后用蒸馏水洗2分钟，然后以 电转移液浸润5分钟。安装好电转装置后，在冰浴中以100mA电流转移1.5h;转有 蛋白的PVDF膜用蒸馏水漂洗后，以封闭液(含有0. 05% Tween20和5%脱脂奶粉的 pH7.4的PBS)于4。C封闭过夜。然后与一抗溶液(用封闭液以1:1000稀释的小鼠抗 人a -2b干扰素(mouse monoclonal antibody to interferon alpha 2b， Abcam， ab9386) 37。C保温lh，用PBST(含有0. 05% Tween的pH7. 4的PBS)洗膜三次，每次10min;与二抗溶液(用封闭液以1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG)37'C保温lh， 再以PBST洗膜三次，每次lOmin。以商业化的ECL试剂盒显色。参照试剂盒说明书， 将试剂盒中的A液与B液等体积混合，按照O. 125ml/cm2在膜上加上显色液，去掉 多余的显色液后，于暗室压片曝光。重组人干扰素在乳酸菌中诱导表达产物的 Western-blot检测结果如图2所示。表明重组乳酸菌经发酵后，菌体中产生能够与 干扰素的抗体特异性相互作用的蛋白，但是表达产物没有切除信号肽。图2中泳道 1为工程菌NZ (pNZ-ifnm)的发酵上清液(上清2)，泳道2为工程菌NZ (pNZ-ifnm)的 细胞(上清3)，泳道3为同样诱导的转化pNZ8048的乳酸乳球菌L hc^s NZ9000 作为阴性对照。蛋白分子量标准(170kDa、 130kDa、 95kDa、 72kDa、 55kDa、 43kDa、 34kDa、 26kDa、 17kDa、 llkDa)标注在右边。
为对重组乳酸菌中表达的干扰素进行更详细的定位，对细胞的各组分进行了分 离。图3为干扰素在乳酸菌中表达的定位图，表明重组乳酸菌表达的Usp45-IFN蛋 白大部分位于膜上，没有分泌到胞外。
图3中泳道1为诱导的NZ(pNZ8048)样品作为阴性对照，泳道2为诱导的 NZ (pNZ-ifnm)细胞内组分(上清5)，泳道3为诱导的重组乳酸菌膜组分(沉淀5)， 泳道4为诱导的重组乳酸菌细胞壁组分(上清4)。蛋白分子量标准(170kDa、 130kDa、 95kDa、 72kDa、 55kDa、 43kDa、 34kDa、 26kDa、 17kDa、 llkDa)。
实施例2含有重组人a-2b干扰素重组菌表达产物的含量测定 用商业化的重组人a-2b干扰素含量测定试剂盒，根据说明书进行实验。首先 将试剂盒中的标准品以200ul蒸馏水溶解，加入200ul样品稀释液稀释至终浓度为 2000pg/ml。然后依次做倍比稀释，使浓度分别为2000， 1000， 500， 250， 125， 62.5， 31.25pg/ml。将标准品加入到板条孔中，每孔100ul，并做复孔，留下两孔做空白 对照。在其余孔中分别加入100ul实施例1中的上清2和上清3， 37。C孵育1小时。 用20倍稀释的洗涤液洗涤4-6次，在吸水纸上拍干。然后加入酶标记的抗体100ul， 37"C孵育1小时。洗涤4-6次后，每孔加100ul显色液，于37。C避光显色15-30 分钟，然后加上50ul终止液，于酶标仪490nm处读数。根据标准品的含量数算出 样品中干扰素的含量。图4为重组乳酸菌表达干扰素的含量图。图4中，S代表上 清2， C代表上清3。经过3次独立的实验，菌体分泌到培养基即上清2中的干扰素 含量为41. 7pg/ml，菌体细胞即上清3中的干扰素含量为11. 6pg/ml。实施例3含有重组人a-2b干扰素重组菌表达产物的活性测定 生物学活性参照2005年《中华人民共和国药典》三部附录XC细胞病变抑制法 进行，依据人羊膜细胞(WISH)-水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV) 系统，采用CPE (细胞病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检 品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50%)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单 位。
具体方法为
取WISH细胞在96孔板中培养至全部贴壁生长后，去除培养液，分成两组，一 组将人a干扰素标准品(购自中国药品生物制品鉴定所)稀释成1000U/ml，每孔加 入100W，做4倍系列稀释，供8个稀释度，每个稀释度做2个复孔。另一组每孔 分别加入4倍系列稀释的实施例1中的上清1和上清3，用100TCID50剂量 的水泡性口炎病毒(VSV)进行攻毒，对照孔加无病毒的培养液，同时设立阴性对照 (只加经系列稀释的重组人a干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加 病毒)、空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察标准品1U/ral 的孔出现50%病变的时候判断结果。以结晶紫染色后在波长570nm处测定吸光度， 采用四参数回归计算法进行处理，并按下式计算干扰素生物学活性。 供试品生物学活性(IU / ml) =Pr X [ (Ds X Es) / (Dr X Er)] 式中Pr为干扰素标准品生物学活性，1U/ml; Ds为供试品预稀释倍数； Dr为干扰素标准品预稀释倍数； Es为供试品相当于干扰素标准品半效量的稀释倍数； Er为干扰素标准品半效稀释倍数。 干扰素生物学活性测定结果如图5所示，上清1即重组菌分泌到培养基中的干 扰素活性为105U/ml，而上清3即滞留在细胞内的干扰素活性为73. 2U/ml。 图5中，S代表上清l， C代表上清3。序列表
<110>中国科学院微生物所
〈120〉含有重组人a-2b干扰素的重组乳酸菌及其应用 <130〉 1 〈160〉 2
<210〉 1
<211> 498
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220> 〈230〉
〈400〉 1
tgtgatttaccacaaacacattctttaggttctcgtcgtacattaatgtt60
atgcgtcgtatttctttattttcttgtttaaaagatcgtc3tgattttggttttccacaa120
gaagaatttgtcaa^a3gcaga犯c犯1:tccagttttacatgsaMgatt180
caacaaat 11"ttaatttattt "t c t ac aaaagattcttcagcagcacgtga240
ttagata^atat tatat caaCgLdttd^tg3tttagaagc300
caaggtgttggtgttacsgaatgaaagaagattctattttagcagttcgt360
aaatattttcaacgtattaca^tatatttaaaagaaaaaaaatattctccatgtgcatgg420
gaagttgttcgtgcaga^ttatgcgttctttttctttatct^ca^tttaca^gaatct■
ttacgttcta498
〈210〉 2
〈211〉 27
<212〉 PRT <213>人工序列〈220〉
〈230〉 〈400> 2
Met Lys Lys Lys lie lie Ser Ala lie Leu Met Ser Thr Val lie Leu 1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Phe Ser Ala Val Tyr Ala 20 2权利要求
1、一种重组人α-2b干扰素的编码基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码重组人α2b干扰素的核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码重组人α-2b干扰素的核苷酸序列。
2、 含有权利要求l所述基因的重组表达载体。
3、 含有权利要求l所述基因的转基因细胞系。
4、 一种重组乳酸菌，是将含有权利要求l所述的重组人a-2b干扰素的编码基因的 DNA分子导入乳酸菌中，获得的重组乳酸菌。
5、 根据权利要求4所述重组乳酸菌，其特征在于，所述重组人a-2b干扰素的编码 基因的5'端连有编码信号肽的丽A分子。
6、 根据权利要求5所述重组乳酸菌，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列为序 列表的序列2。
7、 权利要求4-6任一所述的重组乳酸菌在制备重组人a-2b干扰素中的应用。
8、 权利要求4-6任一所述的重组乳酸菌在制备抗病毒、抗肿瘤药物中的应用。
9、 一种抗病毒、抗肿瘤的药物，其活性成分为权利要求4-6任一所述的重组乳酸菌。
全文摘要
本发明公开了一种重组人α-2b干扰素的编码基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码重组人α-2b干扰素的核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码重组人α-2b干扰素的核苷酸序列。本发明提供一种重组乳酸菌，是将上述的重组人α-2b干扰素的编码基因的DNA分子导入乳酸菌中，获得该重组乳酸菌。本发明还提供所述的重组乳酸菌在制备重组人α-2b干扰素中以及制备抗病毒、抗肿瘤药物中的应用本发明还提供一种抗病毒、抗肿瘤的药物，其活性成分为上述的重组乳酸菌。
文档编号A61K35/66GK101538572SQ20091008307
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者张秋香, 还连栋, 瑾 钟 申请人:中国科学院微生物研究所