专利名称：核酸适体及其衍生物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸适体及其衍生物的新用途。
背景技术：
传统的肿瘤化疗药物由于对肿瘤细胞的特异性不强，往往在杀死肿瘤细胞的同 时也杀伤正常细胞，导致强的毒副作用。肿瘤细胞靶向给药是提高肿瘤治疗效果减 少毒副作用的有效途径。将药物偶联于肿瘤细胞特异性配基是靶向给药的主要方 法。例如将药物共价结合于细胞表面肿瘤标志物的单克隆抗体上，这些偶联药物的 单抗能选择性结合肿瘤组织，从而提高抗肿瘤药物的效果，减少毒副作用。将多个 不同作用机理的耙向治疗药物合用可得到更好的治疗效果。很多这类药物在临床前 的试验中均取得了很好的效果，目前正在进行相关的临床实验(Carter, P.丄； Senter， P. D. Cancer J. 2008， 14， 154—169. Chari, R. V. J. Acc. Chem. Res. 2008， 41， 98-107.)。例如人源化的CD33抗体-加里刹霉素偶联物Mylotarg，已经 被批准用于急性骨髓系白血病(AMU的治疗。用于药物靶向输送的抗体来源于动 物或融合的单克隆细胞，是自然的产物，其制备繁琐、稳定性差、分子量大、易引 起免疫反应以及难以进行化学修饰和改造等，因此导致抗体偶联物稳定性差，成本 高，限制了其广泛应用。寻找新的特异性识别分子取代抗体是靶向药物治疗的一个
重要发展方向。
近年来一类新型的识别分子-核酸适体(Aptamer，适配体，适配子)以其优越 的识别特性逐渐得到人们的重视。核酸适体是一段单链核酸分子(包括DNA、 RNA、 修饰后的核酸分子)。它们通过分子内碱基堆积、疏水相互作用、氢键和静电相互 作用折叠形成独特的三维空间结构，从而与靶分子特异性结合(Breaker RR, Nature 2004, 432:838-845)。核酸适体与靶分子结合的亲和力与特异性与单克隆抗体相似， 甚至更强。与抗体相比，核酸适体具有较低的分子量(15-50 bases; 4-15kD)、 快速组织通透性、没有免疫源性和毒性。核酸适体一旦筛选出来，就可以通过自动 化的固相化学合成来制备，无需免疫动物或细胞培养的过程以及后续繁琐的分离纯 化过程，价格大大降低。核酸适体很容易进行结构改造并标记上各种分子，如放射 性元素、荧光染料等(NutiuR&Li Y, Angew Chem Int Ed Engl 2005， 44:1061-1065;
4Liu， J.W. & Lu， Y. Angew Chem Int Ed Engl 2006， 45:90-94)。核酸适体稳定
性高，可以可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。
发明内容
本发明的目的是提供核酸适体及其衍生物的新用途。 本发明提供了核酸适体和/或核酸适体衍生物在制备靶向药物中的应用。 所述核酸适体衍生物可为如下a)、 b)或c):
a) 将核酸适体的骨架部分或全部改造为硫代磷酸酯骨架或对部分或全部骨架 上的糖环进行2' -F和2， - ^2修饰等得到的核酸适体衍生物；
b) 将核酸适体部分或全部改造为肽核酸得到的核酸适体衍生物；
c) 将核酸适体中的一个以上核苷酸替换为锁核酸(Locked Nucleic Acid ， LNA) 和/或连接分子得到的核酸适体衍生物；所述连接分子为一个以上的六聚乙二醇-l-磷酸。
六聚乙二醇-1-磷酸的结构式如式(I ):
o=X-o 6-式(I)。
如式(I )所示，六聚乙二醇-1-磷酸的骨架为6个乙二醇的聚合物，骨架一
端的氧连接一个带负电的磷酸基团。用六聚乙二醇-1-磷酸替代核酸适体中的核苷 酸时，通过骨架两端的氧与两端的核苷酸连接。
所述核酸适体为可与疾病相关分子特异结合的一段单链核酸分子或经修饰的 核酸分子。
所述靶向药物可为治疗肿瘤的药物、治疗感染的药物或治疗炎症的药物。 所述治疗肿瘤的药物具体可为杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤细胞增殖的药物。
所述核酸适体可为含有核心序列的DNA。
所述核酸适体还可含有侧翼序列。所述侧翼序列可为5'端侧翼序列和/或3' 端侧翼序列。
所述肿瘤细胞具体可为白血病细胞。
当所述肿瘤细胞为白血病细胞时所述核心序列可为序列表中的序列1、序列 2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11 中任意十个以上连续核苷酸所示的DNA序列；所述5'端侧翼序列可为序列表中的 序列12中任意三个以上连续核苷酸所示的DNA序列；所述3'端侧翼序列可为序列 表中的序列13中任意三个以上连续核苷酸所示的DNA序列。
当所述肿瘤细胞为白血病细胞时所述核酸适体具体如下
5， -NTCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3，(序列表的序列14);
上述序列的5，末端为任意核苷酸，用于标记用，如A。当所述肿瘤细胞为白血病细胞时所述核酸适体衍生物具体如下
5 ' -NJLCJLAACTGCTGCGCCGCCGGGpegGTACGGTTALGLAL-3 ';
上述核酸适体衍生物是将序列表的序列14所示的核酸适体的5'端的4个核苷 酸和3，端的3个核苷酸替换为相应的锁核酸单元，将自5 '末端第23至30位核 苷酸替换为所述连接分子得到的。
所述连接分子具体可为2至5个六聚乙二醇-1-磷酸，具体可为两个六聚乙二 醇-l-磷酸。
所述肿瘤细胞具体可为淋巴瘤细胞。
当所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞时所述核心序列可为序列表中的序列15中任
意十个以上连续核苷酸所示的DNA序列。
当所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞时所述核酸适体具体如下
5' -CAC CGG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3' (序列表的序列15)。
本发明还保护一种药物靶向输送载体，它的活性成分为所述核酸适体和/或所 述核酸适体衍生物。
本发明还保护将药物和所述药物靶向输送载体偶联得到的靶向药物。 本发明还保护所述核酸适体和/或所述核酸适体衍生物在药物靶向输送中的应用。 所述药物可为治疗肿瘤的药物、治疗感染的药物或治疗炎症的药物。 所述治疗肿瘤的药物具体可为杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤细胞增殖的药物。 所述药物可为常规的治疗药物、放射性元素、毒素等。
所述白血病细胞具体可为CCRF-CEM细胞，淋巴瘤细胞具体可为Ramos细胞。 本发明首次将核酸适体及其衍生物应用于制备靶向药物。针对不同的目标细 胞，可以筛选不同的核酸适体。将特异性核酸适体与现有的抑制目标细胞的药物偶 联，可得到靶向药物，增加药物对目标细胞的特异性，提高药物疗效，降低药物毒 性，降低药物用量，从而避免毒副作用。
筛选核酸适体具体可采用如下方法以完整的疾病细胞为靶，通过与随机的核 酸文库结合，然后分离结合的核酸序列，再经酶放大后重复结合的过程，如此循环 多次后得到多种能与相应疾病细胞结合的核酸适体。通常重复筛选5-20轮，能得 到3-20个能识别细胞表面不同分子核酸适体，更换不同的细胞种类可得到识别不 同疾病细胞的核酸识别分子。为了抵抗核酸适体受到核酸酶的降解，延长其在生物 体或生物样本中的半衰期，在应用前可将核酸适体进行结构优化和/或修饰，得到 核酸适体的衍生物。
本发明的优点主要在于可以在预先不知道目标细胞表面与疾病相关的分子变 化的情况下筛选和制备特异性的核酸适体分子(或核酸适体衍生物)；可以同时获得多种细胞表面疾病相关分子的核酸适体(或核酸适体衍生物)；所得到的核酸适 体(或核酸适体衍生物)可以特异性与疾病细胞强力结合；核酸适体(或核酸适体 衍生物)可大规模化学合成、易于与药物分子连接，成本低；核酸适体(或核酸适 体衍生物)分子量相对较小，没有免疫活性和毒性；核酸适体(或核酸适体衍生物) 稳定性好，形成的靶向药物稳定。本发明的靶向药物可以特异性结合靶细胞，明显 降低药物毒副作用、提高治疗效果，具有很高的潜在应用价值。
图1为与疾病相关核酸适体的筛选过程。 图2为核酸适体与阿霉素偶联示意图 图3为经药物处理后的细胞活性分析结果。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊 说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
结合缓冲液含4. 5g/L葡萄糖、5mM MgCl2、 lmM CaCl2、 2. 67raMKCl、 1. 47raM 磷酸二氢钾、137. 93mM氯化钠、8. 06raM磷酸氢二钠、0. lmg/mL tRNA(Sigma)和lmg/mL 牛血清白蛋白(Fisher); pH 7.4。
实施例l、核酸适体I和核酸适体II的筛选、优化和改造
筛选过程如图1所示(cell A为靶细胞，cellB为反筛细胞，1表示随机的DNA 文库，2表示洗脱步骤，3表示PCR步骤，4表示富集的文库，5表示克隆和测序， 6表示进入下一轮筛选，7表示流式细胞分析步骤)，具体如下
一、白血病细胞CCRF-CEM核酸适体的筛选、优化和改造 (一)核酸适体的筛选
1、 随机核酸文库的设计与合成
设计合成两端包含18个核苷酸、中间包括52个核苷酸的随机核酸序列文库如 下5' -ATA CCA GCT TAT TCA ATT- 52-nt -AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3，。
2、 核酸适体的筛选
将白血病细胞CCRF-CEM作为靶细胞，淋巴瘤细胞Ramos作为反筛细胞。 (1)第一轮筛选
取5-lOnmol步骤l合成的随机核酸文库，溶于lmL结合缓冲液中，与lXl(f个白血病细胞CCRF-CEM (购于ATCC， CCL-119)在冰上孵育30分钟，离心去除上清液； 洗涤后将细胞悬浮于300 u L结合缓冲液中并加热洗脱结合于细胞表面的核酸序列； 离心除去细胞，将溶液脱盐，脱盐后的溶液中的序列经PCR放大(引物对荧光素 标记的5， -ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3，;生物素标记的5， -AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3，)后用链亲和素包被的琼脂糖微球(购于GE公司)吸附，经O. 15M的氢氧化 钠溶液洗脱得到单链核酸序列文库I，用于第二轮的筛选。
(2) 第二轮筛选
取200pmo1单链核酸序列文库I ，溶于200-300wL结合缓冲液中，与1X106 个白血病细胞CCRF-CEM在冰上孵育30分钟，离心去除上清液；洗涤后将细胞悬浮 于300u L结合缓冲液中并加热洗脱结合于细胞表面的核酸序列；离心除去细胞后 的溶液中再加入5 X 106个淋巴瘤细胞Ramos (购于ATCC， CRL-1596)于冰上孵育30分 钟以除去与细胞非特异性结合的序列；离心除去细胞，将溶液脱盐，脱盐后的溶液 中的序列经PCR放大(引物对同步骤(1))后用链亲和素包被的琼脂糖微球(购 于GE公司)吸附，经0. 15M的氢氧化钠溶液洗脱得到单链核酸序列文库II 。
(3) 重复筛选20轮，方法同步骤2，得到特异性结合于白血病细胞CCRF-CEM 的核酸文库。
3、核酸适体分子的表征
将特异性结合于白血病细胞CCRF-CEM的核酸文库进行克隆和测序。文库中的 各序列分别标记荧光分子制成分子探针，分别取0.5、 1、 2、 4、 10、 40、 200、 500nM 的分子探针溶液，与5X10S个白血病细胞CCRF-CEM于冰上孵育20分钟，用结合缓 冲液洗涤两遍后用流式细胞仪测定细胞表面荧光强度，如细胞能结合荧光标记的核 酸适体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式Y = BmaxX / (Kd + X)计算核酸适 体的平衡解离常数Kd。
最终选择的核酸适体序列如下
sgc3: 5' -ATACCAGCTTATTCAATTCCTGTGGGAAGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAAT
AAGATGGCGGACTMTGTGTMGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列1。 sgc6: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTCCTGTGGGMGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAAC
MGATGGTTGATCCGTAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列2。sgd3: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTAGGGGGAGCTTGCGCGCATCAAGGTGCTAAACGAAA GCCTCATGGCTTCTATAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列3。 sgc4: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGCGGATGCMACGCCAGACAGGGGGACAGGA
GATAAGMTAGCGTGATGAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列4。 sgc4a: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTCGAGTGCGGATGCAAACGCCAGACAGGGGGACAGG AGATAGTAAGTGCAATCT-3，；
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列5。 sgc5: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTACCGACGACGAACTATCTATCACTATCTTACACATC ATACCTCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3 ，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列6。 sgc7: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTACCGCAGCGACTATCTCGACTACATTACTAGCTTATA
CTCCGATCATCTCTAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列7。 sgc8: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTAGTCACACTTAGAGTTCTAACTGCTGCGCCGCCGGGA
AAATACTGTACGGTTAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列8。 sgal6: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTAGTCACACTTAGAGTTCTAGCTGCTGCGCCGCCGGG AAAATACTGTACGGATAGATAGTAAGTGCAATCT-3，;
其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列9。 Sgd2: 5， -ATACCAGCTTATTCAATTGAGTGMGCAAGGATGCAACCTCGGCTCCAACCCGT GAGAGTCGCGAAACTCAGATAGTAAGTGCAATCT-3，; 其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列10。 Sgd5: 5' -ATACCAGCTTATTCAATTATCGTGGGTCACAGCAGCGGTTGTGAGGAAGAMGGC GGATAACAGATMTAAGATAGTAAGTGCAATCT-3，; 其中加粗下划线标记的为核心序列，见序列表的序列11。 (二)核酸适体分子的优化和改造 步骤一得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸 序列，以流式细胞仪表征序列的特异性与亲和力(方法同步骤(一)的3)，挑选最优化的结合序列用于进一步的应用，优化后的序列的长度可减少至原序列的三分
之一。核酸适体sgc8经优化后的序列(sgc8c)(见序列表的序列14)如下5， -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3，；
其中加粗下划线标记的为核心序列。
sgc8c是从sgc8中选择结合力好的短片段，在其5'末端添加一个用于标记的A (也可为其它任意核苷酸)得到的。
将序列sgc8c的5，端的4个核苷酸和3，端的3个核苷酸替换为相应的LNA(锁核酸)单元(&、CuTV、GJ ，将其中序列AAAATACT替换为两个六聚乙二醇-1-磷酸连接分子(DNA合成用的单体为Spacer Phosphoramidite 18，18-0-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol, l-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropy1)]-phosphoramidite,10-1918-02， Glen Research) (peg)得修饰的序列AJ工JYAACTGCTGCGCCGCCGGGpegGTACGGTTA^Au将其命名为核酸适体A。修饰前的序列在血浆中的半衰期为1. 5小时，修饰后为8小时。
二、淋巴瘤细胞Ramos核酸适体的筛选、优化和改造
(一) 核酸适体的筛选
1、 随机核酸文库的设计与合成
设计合成两端包含20个核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机核酸序列文库如下5' - AAG GAG CAG CGT GGA GGA TA - N45 - TTA GGG TGT GTC GTC GTG GT -3'。
2、 核酸适体的筛选
将淋巴瘤细胞Ramos作为靶细胞，作白血病细胞CCRF-CEM为反筛细胞。其它同步骤一的(一)的2。
3、 核酸适体分子的表征同步骤一的(一)的3。
(二) 核酸适体分子的优化和改造同步骤一的(二)。最终得到的优化的核酸适体序列如下
TD05: 5' -CAC CGG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3'(见序列表的序列15)。
实施例2、靶向药物的制备和应用一、 靶向药物I的制备制备流程如图2所示。
1、 阿霉素6-马来酰亚胺己酰腙的制备
取盐酸阿霉素(5mg， 8.62 (imol)和EMCH (N-e-(Maleiraidocaproic acid)hydrazide， N-e-马来酰亚胺己酰肼)(Pierce Biotechnology) (10mg， 44. 4 pmol)溶于4 mL甲醇，加入3 pL三氟乙酸于室温避光反应24小时；然后室温减压浓縮至0.25 raL，加入2.5 mL乙腈于4 。C放置48小时重结晶；以甲醇-乙腈(1:10)混合液洗涤晶体，真空干燥得阿霉素6-马来酰亚胺己酰腙(2.9 mg, 3.85 ,ol)。
2、 核酸适体与药物的偶联
取300nmo1 5'端二硫键修饰的核酸适体A溶于PBS缓冲液(pH 7. 4)中，在室温下与TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羰基乙基)磷，20490，Thermo Fisher Scientific Inc.)反应2小时以还原二硫键。通过S印hadex G-25柱(織？"-5， Amersham Pharmacia Biotech)除去过量的TCEP后与2 ,1阿霉素6-马来酰亚胺己酰腙于50 DMF(富马酸二甲酯)于冰上反应12小时。反应产物用高效液相色谱纯化(140nmol)，即为靶向药物I 。靶向药物I中，核酸适体A与阿霉素的摩尔比为l: l。
二、 耙向药物II的制备
1、 阿霉素6-马来酰亚胺己酰腙的制备同步骤一的1
2、 核酸适体与药物的偶联
取300nmo15，端二硫键修饰的TD05序列，溶于PBS缓冲液(pH 7. 4)中，在室温下与TCEP反应2小时以还原二硫键。通过S印hadex G-25柱(NApTM-5， AmershamPharmacia Biotech)除去过量的TCEP后与2 pmol阿霉素6-马来酰亚胺己酰腙于50 DMF于冰上反应12小时。反应产物用高效液相色谱纯化(140nmol)，即为靶向药物II。靶向药物II中，TD05序列与阿霉素的摩尔比为1: 1。
三、 耙向药物对CCRF-CEM的细胞毒性分析
细胞毒性分析于96孔板中进行，2Xl(T个白血病细胞CCRF-CEM/孔。设置四组处理，每个处理设置三个重复
处理一加入阿霉素，每孔中阿霉素的量分别为0至2.5 nM;
处理二加入靶向药物I，每孔中阿霉素的量分别为0至2.5 ^M;处理三加入靶向药物II，每孔中阿霉素的量分别为0至2.5 ^lM;
处理四加入核酸适体A，每孔中核酸适体A的量分别为O至2.5 jjM。以未处理细胞作为对照。孵育两小时后以新鲜培养基置换75%的培养基后继续培养48小时。于每孔中加入20 )iL CellTiter试剂(Promega， Madison, WI)。孵育2小时后以酶标仪测定490 nm的吸收。以含未经处理细胞的孔中的吸收度值为100%，细胞活性-含不同处理细胞的孔的吸收度/含未经处理细胞的孔的吸收度X100%。
不同处理后细胞的活性分析结果如图3所示。
靶向药物II与核酸适体A未见明显细胞毒性，说明细胞毒性药物偶联核酸序列后，由于水溶液增大不能自由扩散进入细胞，因此偶联物的非特异性细胞毒活性大大降低。靶向药物I的细胞毒活性与阿霉素相似，说明核酸适体具有耙向运载药物的功能，靶向药物可以通过核酸适体与细胞结合后引起的相应的内化过程运载药物进入细胞。
四、耙向药物对Ramos的毒性分析
细胞毒性分析于96孔板中进行，2Xl(T个淋巴瘤细胞Ramos/孔。设置四组处理，每个处理设置三个重复
处理一加入阿霉素，每孔中阿霉素的量分别为0至2.5 )iM;
处理二加入靶向药物I，每孔中阿霉素的量分别为0至2.5 JlM;
处理三加入靶向药物II，每孔中阿霉素的量分别为0至2.5 [lM;
处理四加入核酸适体A，每孔中核酸适体A的量分别为O至2.5 (iM。
以未处理细胞作为对照。孵育两小时后以新鲜培养基置换75%的培养基后继续培养48小时。于每孔中加入20 CellTiter试剂(Promega， Madison， WI)。孵育2小时后以酶标仪测定490 nm的吸收。以含未经处理细胞的孔的吸收度值为100%，细胞活性^含不同处理细胞的孔的吸收度/含未经处理细胞的孔吸收度X100%。
结果表明核酸适体A、靶向药物I均未见明显细胞毒性，说明细胞毒性药物偶联核酸序列后，由于水溶液增大不能自由扩散进入细胞，因此偶联物的非特异性细胞毒活性大大降低。而阿霉素与靶向药物II有相似的细胞毒活性，因为耙向药物II中的核酸适体可特异性识别Ramos细胞，因此导致耙向细胞毒活性，充分说明核酸适体的靶向运载功能。
12序列表
〈110〉谭蔚泓
〈120〉核酸适体及其衍生物的新用途
〈130〉 CGGNAY92235
<160> 15
<210> 1
<211> 57
〈212〉 DNA<213〉人工序列
〈220〉
〈223>
<400〉 1
cctgtgggaa ggctatagag gggccagtct atgaata卿tggcggacta atgtgta 57
<210> 2
<211> 52
<212〉 DNA〈213>人工序列
〈220〉
〈223〉〈400> 2
cctgtgggaa ggctatagag gggccagtct atgaacaaga tggttgatcc gt 52
〈210〉 3
〈211〉 52
〈212〉 腿〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉
<400〉 3
agggggagct tgcgcgcatc Eiaggtgctaa acgaaagcct catggcttct at 52
〈210〉 4
<211> 54
<212〉 DNA〈213>人工序列
〈220〉
<223>
〈400〉 4
cgagtgcgga tgcaaacgcc agacaggggg acaggagata agaatagcgt gatg 54
〈210〉 5
〈211〉 35<212> DNA <213〉人工序列
〈220〉
<223>
<400> 5
cgagtgcgga tgcaaacgcc agacaggggg acagg 35
〈210〉 6
<211> 44
<212> DNA <213〉人工序列
〈220〉
〈223〉
〈400〉 6
accgacgacg aactatctat cactatctta cacatcatac ctcg 44
〈210〉 7
<211〉 51
<212> DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉
15<400〉 7
accgcagcga ctatctcgac tacattacta gcttatactc cgatcatctc t 51
<210〉 8
〈211〉 52
<212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223〉
〈400〉 8
agtcacactt agagttctaa ctgctgcgcc gccgggaaaa tactgtacgg tt 52
〈210〉 9
<211> 52
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220>
〈223〉
<400〉 9
agtcacactt agagttctag ctgctgcgcc gccgggaaaa tactgtacgg at 52
〈210〉 10
〈211〉 52<212> DNA
<213〉 人工序列
<220〉
〈223〉
<400〉 10
gagtgaagca aggatgcaac ctcggctcca acccgtgaga gtcgcgaaac tc 52
〈210〉 11
<211> 52
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉
<400〉 11
atcgtgggtc acagcagcgg ttgtgaggaa gaaaggcgga taacagat肌ta 52
<210〉 12
<211〉 18
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223〉
17<400> 12
ataccagctt attcaatt 18
<210> 13
〈211〉 18
<212> 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
<223>
〈400〉 13
agatagtaag tgcaatct 18
<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
<220> 〈221〉 <222> <223〉
14 41 DNA
人工序列
misc—feature (1)
n= 3或c或g或
〈400〉 14
ntctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41 <210〉 15<211〉 45
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
〈223>
〈400〉 15
caccgggagg由gttcggt ggctgttcag ggtctcctcc cggtg 4权利要求
1、核酸适体和/或核酸适体衍生物在制备靶向药物中的应用；所述核酸适体衍生物为如下a)、b)或c)a)将核酸适体的骨架部分或全部改造为硫代磷酸酯骨架或对部分或全部骨架上的糖环进行2’-F和2’-NH2修饰等得到的核酸适体衍生物；b)将核酸适体部分或全部改造为肽核酸得到的核酸适体衍生物；c)将核酸适体中的一个以上核苷酸替换为锁核酸和/或连接分子得到的核酸适体衍生物；所述连接分子为一个以上的六聚乙二醇-1-磷酸。
2、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述靶向药物为治疗肿瘤的药物、 治疗感染的药物或治疗炎症的药物；所述治疗肿瘤的药物为杀死肿瘤细胞和/或抑制 肿瘤细胞增殖的药物。
3、 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为白血病细胞；所述 核酸适体为含有核心序列的DNA;所述核心序列可为序列表中的序列1、序列2、序列 3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11中任意十个 以上连续核苷酸所示的DNA序列。
4、 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述核酸适体如序列表的序列14所 示；所述核酸适体衍生物为将序列表的序列14所示的核酸适体的5'端的4个核苷酸 和3'端的3个核苷酸替换为相应的锁核酸单元，将自5'末端第23至30位核苷酸 替换为所述连接分子得到的核酸适体衍生物；所述连接分子为两个六聚乙二醇-l-磷 酸。
5、 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞；所述 核酸适体为含有序列表的序列15的DNA。
6、 一种药物靶向输送载体，它的活性成分为核酸适体和/或核酸适体衍生物； 所述核酸适体衍生物为如下a)、 b)或c):a) 将核酸适体的骨架部分或全部改造为硫代磷酸酯骨架或对部分或全部骨架上 的糖环进行2' -F和2' -^12修饰等得到的核酸适体衍生物；b) 将核酸适体部分或全部改造为肽核酸得到的核酸适体衍生物；c) 将核酸适体中的一个以上核苷酸替换为锁核酸和/或连接分子得到的核酸适体 衍生物；所述连接分子为一个以上的六聚乙二醇-1-磷酸。
7、 如权利要求6所述的药物靶向输送载体，其特征在于所述药物为治疗肿瘤 的药物、治疗感染的药物或治疗炎症的药物；所述治疗肿瘤的药物为杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤细胞增殖的药物。
8、 如权利要求7所述的药物靶向输送载体，其特征在于为如下l)或2):1) 所述肿瘤细胞为白血病细胞；所述核酸适体衍生物为将序列表的序列14所示 的核酸适体的5'端的4个核苷酸和3'端的3个核苷酸替换为相应的锁核酸单元， 将自5 '末端第23至30位核苷酸替换为所述连接分子得到的核酸适体衍生物；所述 连接分子为两个六聚乙二醇-l-磷酸；2) 所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞；所述核酸适体为含有序列表的序列15的DNA。
9、 一种耙向药物，是将药物与权利要求6至8中任一所述的药物耙向输送载体 偶联得到的。
10、 核酸适体和/或核酸适体衍生物在药物靶向输送中的应用； 所述核酸适体衍生物为如下a)、 b)或c):a) 将核酸适体的骨架部分或全部改造为硫代磷酸酯骨架或对部分或全部骨架上 的糖环进行2' -F和2' ^^修饰等得到的核酸适体衍生物；b) 将核酸适体部分或全部改造为肽核酸得到的核酸适体衍生物；c) 将核酸适体中的一个以上核苷酸替换为锁核酸和/或连接分子得到的核酸适体 衍生物；所述连接分子为一个以上的六聚乙二醇-l-磷酸。
全文摘要
本发明公开了一种核酸适体及其衍生物的新用途。本发明提供的新用途是核酸适体及其衍生物在制备靶向药物中的应用。本发明还保护将药物与核酸适体或其衍生物偶联得到的靶向药物。本发明的优点在于可在不知道目标细胞表面与疾病相关的分子变化的情况下筛选和制备特异性的核酸适体或其衍生物；可同时获得多种细胞表面疾病相关分子的核酸适体或其衍生物；所得到的核酸适体或其衍生物特异性与疾病细胞强力结合；核酸适体或其衍生物可大规模化学合成、易于与药物分子连接，成本低；核酸适体或核酸适体衍生物分子量相对较小，没有免疫活性和毒性；核酸适体或其衍生物稳定性好，形成的靶向药物稳定。本发明的具有很高的应用价值。
文档编号A61P29/00GK101537189SQ200910083080
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者上官棣华, 谭蔚泓 申请人:谭蔚泓