专利名称：甾体皂苷化合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及留 体皂苷化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
据《全国中药汇编.上冊》、《实用中草药彩色图鉴》第二冊、《常用中药鉴定大全》 中记载，蒺藜，别名刺蒺藜，为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris Linn.的干燥果实。目 前关于蒺藜总皂苷的药理药效研究报道较多，但未见对其单一成分的药理研究。经文献调 研，蒺藜总皂苷主要有下列药理活性(中国野生植物资源Vol.22No.4Aug.2003)1.对心血管系统的作用蒺藜总皂苷对缺氧再给氧、缺血再灌注心肌有保护作用，认为与提高机体内源性 抗氧化能力、降低脂质的氧化有关。临床及实验药理学都证明蒺藜皂苷改善心功能、缩小心 肌梗塞面积、缓解心绞痛的症状、延长心绞痛的发作间期、减少心绞痛的发作次数，对陈旧 性心肌梗塞伴左室功能异常者亦能减轻其胸闷、气促、和心悸等症状，增加左室收缩功能和 排血量。2.对脑血管系统的作用蒺藜皂苷对脑动脉硬化症和脑血栓形成的后遗症有较好的疗效，研究显示其能增 加脑缺血部位的血供，起到改善脑循环、保护缺血脑组织的作用。环腺苷酸(cAMP)在各种 生理过程中担任很重要的第二信使的任务。抑制钙依赖性的磷酸二脂酶(PDE)而使cAMP 含量升高是脑血管、冠状动脉和外周血管扩张的一个重要机理。现国内外已将测定某化合 物对PDE是否有抑制作用作为寻找治疗心血管疾病的初筛实验。国内外研究表明从植物中 分离得到的许多留体皂苷对PDE有抑制活性。国内有人用蒺藜皂苷灌喂兔，结果发现能升 高血浆cGMP和cAMP的含量。但蒺藜皂苷是否通过抑制PDE活性而增加cAMP的含量，从而 达到防治心脑血管疾病的作用目前还没有系统的阐述。3.性强壮作用国内外学者研究发现，蒺藜总皂苷能促进精产生，增加性欲；促进雌性大鼠发情， 提高生殖能力；临床研究发现可增加男人的精子数及活力，治疗男性性功能低下，增加女人 卵巢的功能，并可预防更年期综合症。最近研究显示皂苷的上述作用可能与其能提高体内 性激素的含量有关。国外学者经临床研究发现从蒺藜中提取的单一成份皂苷——原薯蓣皂 甙(protodioscin)能增强性欲，提高性功能。原薯蓣皂苷可能是在体内通过代谢转化成脱 氢表雄酮(dehydro印iandrosterone)而起上述作用的。进一步研究发现，生活在不同环境 中的蒺藜，不一定都含有这一活性成分。4.强心及强壮作用刺蒺藜中的皂苷具有显著的强心作用。前苏联用蒺藜茎叶总皂苷制成制剂 “Tribusponin”，表明其具有较强的抗动脉硬化作用，其效果优于已知的抗动脉硬化药物。 其强壮作用机强度与人参皂苷颇为相似。蒺藜茎叶总皂苷还具有显著的抗心肌缺血，抗心 肌梗塞，抗血小板聚集，降低胆固醇，保肝，提高免疫功能等作用。
5.调节机体内某些微量元素的含量有报道显示蒺藜皂苷可调节机体内某些微 量元素的含量。6.抗衰老作用蒺藜总皂苷对d-半乳糖所致的小鼠亚急性衰老模型动物的体重减轻、脾脏及胸 腺萎缩有抑制作用，并降低其胆固醇及血糖水平，延长大鼠的游泳时间，增加幼年小鼠的肝 及胸腺的重量，对老年小鼠皮内色素颗粒的沉着和聚集呈明显的改善趋势；在临床上也发 现蒺藜皂苷增强肌体自然杀伤细胞活性，可用来防治老年人免疫功能降低。
7.调节血脂动物及临床实验均显示蒺藜皂苷有调节血脂的作用，可降低血清甘油三脂、胆固 醇、低密度脂蛋白胆固醇，提高HDL/LDL的比值，升高卵磷脂胆固醇的值，具有阻止动脉、心 脏、肝脏的脂质的沉着作用。8.蒺藜皂苷的抗菌、抑癌作用在研究中还发现蒺藜醇提物中的蒺藜总皂苷可显著抑制人乳腺髓样细胞 (Bcap-37)的增殖。最近国外学者从总皂苷中分离出7种单体皂苷，E*Be-dird等研究了 它们对4种人体肿瘤细胞(黑色素瘤细胞SK-MEL、口腔上皮细胞KB、乳腺癌细胞BT549、卵 巢癌细胞SK-0V-3)的作用。研究发现3种螺留醇皂苷(spirostanolsaponin)具有显著的 抑制癌作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有抑制肿瘤作用的留体皂苷化合物。本发明所提供的甾体皂苷化合物，具有如下I式或II式所示的结构 I式所示的化合物的分子式为C61HiqqO3 ，名称为3-0-{ β -D-xylopyranosyl-(1 — 3 )-[β -D~xy 1 opyranosy 1 (1 一2)] -β -D-glucopyranosyl (1 一4)-[ α -L-rhamnopyranosyl (1 — 2 )]-β -D-galactopyranosy}-26-0-β -D-glucopyranosyl-l-5a-furost-20(22) -en-(25R)-3 β，26-diol(l)。II式所示的化合物2的分子式为C62Hiq2O32,名称为3-0- { β -D-xylopyranosyl (1 一 3) - [ β -D-xylopyranosyl (1 一 2) ] - β -D-glucopy ranosyl (1 一 4) - [ α -L-rhamnopyranosy 1 (1 一 2) ] - β -D-galactopyranosy} -26-0- β -D-glucop yranosyl-5a-furost-12-one-(25R)-22-methoxy-3β，26-diol。本发明的另一个目的是提供一种制备上述留体皂苷化合物的方法。本发明所提供的制备上述留体皂苷化合物的方法，包括如下步骤用提取剂提取 刺蒺藜，得到提取液，再进行高效液相色谱分离，得到所述I式和/或II式所示的化合物； 所述高效液相色谱分离包括如下步骤用乙腈和水体积比为35 65的混合溶液作流动相， 流动相的流速为4ml/min ；收集保留时间为(9. 79810. 798)min的洗脱峰，得到I式所示化 合物；收集保留时间为(13. 423-14. 423)min的洗脱峰，得到II式所示化合物。所述高效液相色谱分离中所用的固相介质具体可为ODS(十八烷基硅烷键合硅胶 填料Octadecyl silyl)，孔径5um。所述提取剂可为60%-80% (体积百分含量)乙醇的 水溶液，优选为70%乙醇溶液。所述方法中，在所述得到提取液后、所述进行高效液相色谱分离前，还可包括用大 孔吸附树脂纯化的步骤，洗脱方式为依次用水与乙醇的体积比为(100 0)、(80 20)、 (70 30)、(50 50)、(90 10)、(95 5)、(0 100)的混合溶液作为洗脱缓冲液进行 梯度洗脱，收集水与乙醇的体积比80 20的洗脱缓冲液对应的洗脱液。所述方法中，在所述大孔吸附树脂纯化后、所述进行高效液相色谱分离前，还可包 括用葡聚糖凝胶纯化的步骤，所用的洗脱缓冲液为三氯甲烷与甲醇体积比为1 1的混合 液。所述葡聚糖凝胶具体可为S印hadex LH-20。所述方法中，在所述用葡聚糖凝胶纯化后、所述进行高效液相色谱分离前，包括用 十八烷基硅烷键合硅胶纯化的步骤，洗脱方式为依次用甲醇与水的体积比为(0 100)、 (80 20)、(50 50)、(100 0)的混合溶液作为洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集体积比 为50 50的洗脱缓冲液对应的洗脱液。
在所述用提取剂提取刺蒺藜的方法中，得到提取液后，还可包括将所述提取液减 压蒸馏的步骤；在所述用大孔吸附树脂纯化的方法中和/或所述用葡聚糖凝胶纯化方法中 和/或所述用十八烷基硅烷键合硅胶纯化的方法中，在洗脱后，还可包括对得到的洗脱液 减压蒸馏的步骤。本发明的另一个 目的是提供一种抗肿瘤药物。本发明所提供的抗肿瘤药物，其活性成份为上述留体皂苷化合物中的至少一种。所述肿瘤可为肝癌、肺癌或乳腺癌，具体可为NCI-H46细胞(肺癌细胞)、SF-268 细胞、MCF-7细胞、!fepG2细胞。I式和/或II式所示的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护 范围。同样，其中所述肿瘤可为肝癌、肺癌、乳腺癌，具体可为NCI-H46细胞、SF-268细胞、 MCF-7细胞、!fepG2细胞。实验证明，本发明的两种留体皂苷化合物抑制肿瘤的效果好，并且可抑制多种肿 瘤，I式所示化合物对NCI-H46细胞、SF-268细胞、MCF-7细胞、!fepG2细胞的半数抑制浓度 依次为9. 26,7. 53,6. 18、11. 3，II式所示化合物对NCI-H46细胞、SF-268细胞、MCF-7细胞、 HepG2细胞的半数抑制浓度依次为4. 31,3. 47,3. 98,6. 66。本发明的制备上述留体皂苷化 合物的方法，操作简单，成本低，产率高，实验证明，2. 5kg刺蒺藜可产生55. 8mg I式所示化 合物和18.4mgII式所示化合物。因此，本发明化合物在肿瘤的预防和/或治疗中将有广阔 的应用前景。
图1为化合物1的结构式图。图2为化合物2的结构式图。图3为高效液相色谱分离图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、甾体皂苷化合物的制备刺蒺藜购自广东省深圳中药研究中心，产品目录号为TT2002061211。一、制备1、取2. 5kg刺蒺藜并粉碎，用55L 70%乙醇进行提取(乙醇水=70 30，体积 比)。提取步骤如下25°C (室温)冷浸12小时，过滤，取上清为提取液I，收集残渣，计作 残渣I ；再将残渣I用55L 70%乙醇进行提取，提取条件同上，得到提取液II，残渣II。将 提取液I和提取液II合并，得到总提取液。将总提取液在40°C水温的条件下减压蒸馏，得到450. 6g初浸膏。2、将450. Ig初浸膏用水溶解，用DlOl大孔吸附树脂柱(6. 5 X 25cm)进行纯化，用 水乙醇=(100 0)、(80 20)、(70 30)、(50 50)、(90 10)、(95 5)、(0 100) (体积比)的洗脱缓冲液进行梯度洗脱；收集水与乙醇体积比为80 20的洗脱缓冲液对 应的洗脱液，再从洗脱液中取样点在同一块薄层板上，根据薄层板结果将相似结果的馏分减压蒸馏，得到馏分提取物I，共得到9. 68g馏分提取物I。3、将9. 68g馏分提取物I用20%乙醇溶液(水乙醇=80 20，体积比)溶解， 得到的溶液用Sephadex LH-20柱(Pharmacia Biochem. 3X 10cm)进行纯化，以三氯甲烷 甲醇=50 50 (体积比)的混合溶液作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，得到馏分提 取物II ；将上述全部馏分提取物II在40°C的水温下减压蒸馏浓缩，得到浓缩物3. 03g。4、将3. 03g浓缩物再用十八烷基硅烷键合硅胶
进行纯化，以甲醇水=(0 100)、(80 20)、(50 50)、(100 0)(体积 比)的洗脱缓冲液进行梯度洗脱。收集体积比为50 50的洗脱缓冲液对应的洗脱液，将 洗脱液在40°C水温的条件下减压蒸馏浓缩。得到浓缩物1. 21g。5、将1. 21g浓缩物用高效液相色谱分离。高压液相柱为Fluofix(INW 125、NE0S公司、10 X 250mm)；其中填充的固相介质是 0DS(十八烷基硅烷键合硅胶填料Octadecylsilyl)，孔径5um ；自动进样器进样，进样量lOOul ；梯度洗脱缓冲液为流动相的组成为乙腈与水的混合溶液(乙腈水=35 65， 体积比)；流速 4ml/min(25°C )；用示差HPLC监测。收集保持时间为9. 798-10. 798min (最高峰的保持时间为10. 298min)(图3中1) 的单峰溶液馏分，在40°C的温度下减压蒸馏，得到白色粉末状的化合物1 (55. 8mg)；收集保持时间为13. 423-14. 423min (最高峰的保持时间为13. 923min)(图3中2) 的单峰溶液馏分，在40°C的温度下减压蒸馏，得到无色针状结晶状的化合物2(18. 4mg)。二、检测将化合物1和化合物2依次分别进行如下检测1、溶点检测将样品结晶或者粉末放在展薄片上，然后将展薄片放到溶点仪上边 加热边观察温度变化，至样品溶化。2、比旋度的检测偏振光透过1dm且每1ml中含有旋光性物质lg的溶液。3、[HR-T0F-MS]是ESI测试时产生高分辨离子峰数据。可以找到与化合物的碎片 峰和与化合物结合的一些离子信号峰信息。4、质谱检测质谱检测化合物分子量，采用了电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)质谱检测。ESI的实验条件相对简单且在大气压环境下工作，分离条件 和分离化合物高效液相色谱(HPLC)条件一致。流动相的组成为乙腈与水的混合溶液(乙 腈水=35 65，体积比)；流速4ml/min。5、核磁共振检测以氘代吡啶为溶剂、已TMS为零点、测定的共振频率为400MHz。制备及检测的实验均设3次重复。结果如下化合物1 白色粉末，熔点[mp]215-217°C ；旋光[a]g5_38. 2° (H20，c 0. 68)； [HR-T0F-MS] 1335. 6185 [M+Na+H]+ ；ESI-MS 1311. 4 [M-H]1335. 3[M+Na]+ ；分子式 C61H100030 ；核磁数据见表1和2。化合物2 无色针状结晶，熔点[mp]220_222°C ；旋光[a]g5_25.2。(H20，c 0. 56) ； [HR-T0F-MS] 1381. 6250[M+Na]+ ；ESI-MS 1357. 6 [M-H]-, 1381. 6 [M+Na]+ ；分子式C62H102 032 ；核磁数据见表1和2。 表1、化合物1和化合物2的碳谱测定结果
表2、化合物1和化合物2的氢谱测定结果 综上实验结果表明，化合物1具有图1所示结构式，化合物2具有图2所示结构式c 化合物1的名称为
3-0- { β -D-xylopyranosyl- (1 — 3) - [ β -D~xylopyranosyl (1 — 2) ] - β -D-glucop yranosyl (1 — 4)-[ α -L-rhamnopyranosy 1(1 — 2)]-β -D-galactopyranosy}-26-0-β -D-g lucopyranosyl-l-5a-furost-20 (22) -en- (25R) -3 β，26_diol(l)。化合物 2 的名称为:3_ 0- {β _D_xyIopyranosyl (1 — 3) - [ β _D_xylopyranosyl (1 — 2) ] - β -D-glucopyranosyl (1 — 4)-[α -L-rhamnopyranosy 1 (1 — 2) ] - β -D-galactopyranosy} -26-0- β -D-glucopyranosyl-5a -furost-12-one-(25R)-22_methoxy-3 β，26-diol。实施例2、化合物1和化合物2的抗肿瘤活性检测 肺癌细胞(NCI-H460细胞)购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 38，乳腺 癌细胞(SF-268细胞)购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 49，乳腺癌细胞(MCF-7 细胞)购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 74，人肝癌细胞(人H印G2细胞)购自 中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 72。化合物对肿瘤细胞的抑制实验，采用文献(Mosmarm，Τ. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival!application to proliferation and cytoxicity assays. Journal of Immunological Methods,65,55-63) 中所述的MTT法(Mosmann，1983)检测。具体操作如下在96孔平面板内注入200 μ 1浓 度为1. OX IO4个cell/mL的肿瘤细胞液，然后加入各种测试浓度化合物溶液，放入二氧化 碳培养箱内培养 16 小时，再加入 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazol iumbromide (MTT)再培养4小时。除去上清液，添加DMSO避光保存10分钟，待生成的甲暨 (formazan)溶解后，在吸光度为570nm酶标仪上测出吸光度。对照组肿瘤细胞+DMS0。用于实验的肿瘤细胞分别为NCI-H460细胞、SF-268细胞、MCF-7细胞、人H印G2细 胞。抑制率(％ )=(对照组OD值-测试化合物组OD值)/对照组OD值X 100实验设3次重复，结果取平均数。结果如表3所示。表3、2个留体皂苷化合物对4种肿瘤细胞的抑制实验结果 以上结果表明，本发明的化合物1和化合物2均对以上4种细胞具有很好的抑制作用。
权利要求
一种甾体皂苷化合物，具有如下I式或II式所示的结构(I式)(II式)F2009100827723C0000011.tif,F2009100827723C0000012.tif
2.制备权利要求1中所述留体皂苷化合物的方法，包括如下步骤用提取剂提取刺蒺 藜，得到提取液，再进行高效液相色谱分离，得到权利要求1中所述I式和/或II式所示的 化合物；所述高效液相色谱分离包括如下步骤用乙腈和水体积比为35 65的混合溶液 作流动相，流动相的流速为4ml/min ；收集保留时间为9. 798-10. 798min的洗脱峰，得到I 式所示化合物；收集保留时间为13. 423-14. 423min的洗脱峰，得到II式所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱分离中所用的固相介 质为十八烷基硅烷键合硅胶；所述提取剂为60%-80% (体积百分含量)乙醇的水溶液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述得到提取液后、 所述进行高效液相色谱分离前，包括用大孔吸附树脂纯化的步骤，洗脱方式为依次用水与 乙醇的体积比为(100 0)、(80 20)、(70 30)、(50 50)、(90 10)、(95 5)、 (O 100)的混合溶液作为洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集水与乙醇的体积比80 20的洗 脱缓冲液对应的洗脱液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述大孔吸附树脂纯化 后、所述进行高效液相色谱分离前，包括用葡聚糖凝胶纯化的步骤，所用的洗脱缓冲液为三 氯甲烷与甲醇体积比为11的混合液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用葡聚糖凝胶纯化后、所述进行高效液相色谱分离前，包括用十八烷基硅烷键合硅胶纯化的步骤，洗脱方式为 依次用甲醇与水的体积比为(O 100)、(80 20)、(50 50)、(100 0)的混合溶液作 为洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集体积比为50 50的洗脱缓冲液对应的洗脱液。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于在所述用提取剂提取刺蒺藜的 方法中和/或所述用大孔吸附树脂纯化的方法中和/或所述用葡聚糖凝胶纯化方法中和/ 或所述用十八烷基硅烷键合硅胶纯化的方法中，包括减压蒸馏的步骤。
8.一种抗肿瘤药物，其活性成份为权利要求1中所述留体皂苷化合物中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述肿瘤为肝癌、肺癌或乳腺癌。
10.权利要求1中所述I式和/或II式所示的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了甾体皂苷化合物及其制备方法与应用。本发明的制备方法包括如下步骤用提取剂提取刺蒺藜，得到提取液，再进行高效液相色谱分离，得到权利要求1中所述I式和/或II式所示的化合物；所述高效液相色谱分离包括如下步骤用乙腈和水体积比为35∶65的混合溶液作流动相，流动相的流速为4ml/min；收集保留时间为9.798-10.798min的洗脱峰，得到I式所示化合物；收集保留时间为13.423-14.423min的洗脱峰，得到II式所示化合物。实验证明，本发明的两种甾体皂苷化合物抑制肿瘤的效果好，并且可抑制多种肿瘤。本发明的制备上述甾体皂苷化合物的方法，操作简单，成本低，产率高。因此，本发明化合物在肿瘤的预防和/或治疗中将有广阔的应用前景。
文档编号A61K31/7048GK101875686SQ20091008277
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者刘红霞, 王珏, 祖旭宇, 蒋宇扬, 谭春燕 申请人:清华大学深圳研究生院