一种星柳珊瑚甾体皂苷的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种星柳珊瑚甾体皂苷的制备方法，包括：星柳珊瑚总提取物经萃取、MCI柱层析分离获得星柳珊瑚总皂苷；再经硅胶、凝胶Sephadex?LH-20柱层析得到甾体皂苷dimorphoside?A。本发明的纯化工艺简单，成本低，可有效制备在生物医药领域具有潜在用途的纯化合物dimorphoside?A。
【专利说明】一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于留体皂苷领域，特别涉及一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法。
【背景技术】
[0002]柳珊瑚，属于腔肠动物门珊瑚纲八放珊瑚亚纲动物，在《本草纲目》中有详细记载，是中药宝库的重要组成部分。为了寻找有重要生物活性和药用前景的海洋天然产物，20世纪60年代，美国Weinheimer等从柳珊瑚中发现了具有独特结构和强烈生理活性的前列腺素前体，世界各国的科学工作者先后从不同海域的珊瑚中已先后提取分离了脂类、留体、生物碱以及多种骨架类型的萜类等成分，多数化合物的结构新颖独特，有较强的抗肿瘤、抗结核、抗炎等生物活性。其中，留体皂苷是一大类具有特殊生物活性的重要海洋天然产物。
[0003]海洋留体皂苷类成分的常规提取、制备方法一般包括以下过程:(1)海洋生物切片粉碎，或冻干个体粉碎，然后用有机溶剂或/和水提取制备得到总提取物，所用的有机溶剂可采用醇类，如乙醇，甲醇；将总提取物溶于水或甲醇水溶液后，以较高沸点烷烃(石油醚、正己烷、环己烷)，或乙酸乙酯等酯类、氯仿或二氯甲烷等卤代烃类溶剂萃取脱除脂溶性的中、低极性成分。(2)水相用不和水混溶的高极性溶剂萃取，回收溶剂后干燥即得到总皂苷，其中所用的高极性溶剂优选采用正丁醇或者不同比例的氯仿-甲醇混合溶液；萃取得到的总皂苷可以通过大孔树脂吸附、甲醇或者乙醇水溶液梯度洗脱，获得较为精制的皂苷混合物。水相也可以直接通过大孔树脂吸附、甲醇或者乙醇水溶液梯度洗脱获得较为精制的皂苷混合物。(3)皂 苷混合物通过正相、反相硅胶柱色谱等进行纯化获得纯留体皂苷化合物。
[0004]不同结构的海洋留体皂苷具体提取、制备方法具有特殊性。利用星柳珊瑚(Astrogorgia dumbea)提取、制备留体阜苷 dimorphoside A,以及 dimorphoside A 的体外抗肿瘤活性目前尚无文献公开报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，该方法纯化工艺简单，成本低，可有效制备在生物医药领域具有潜在用途的纯化合物dimorphosideA0
[0006]本发明的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，包括:
[0007]( I)采用甲醇提取星柳珊瑚，总提取物加水成混悬液，依次加石油醚、氯仿萃取，然后将水相浓缩，通过MCI柱层析分离，依次以60%、100%甲醇水溶液洗脱，取甲醇洗脱部分减压浓缩回收溶剂后干燥，得到星柳珊瑚总皂苷；
[0008](2)星柳珊瑚总皂苷用100~200目硅胶拌匀，经200~300目硅胶柱色谱分离，依次以体积比为12:1、8:1、6:1的氯仿-甲醇、体积比为50:10:1、40:10:1、30:10:1、14:6:1的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，薄层色谱(TLC)检测各馏分，相同组分合并浓缩，得到7个粗皂苷混合物；[0009](3)取硅胶柱色谱分离得到的第6个粗皂苷混合物溶解于无水乙醇中形成300-500mg/mL溶液,进行Sephadex LH-20凝胶柱分离，收集主要成分合并浓缩得到留体阜苷。
[0010]所述步骤(1)中的星柳珊瑚原料与水的质量体积比为Ikg: lL-5kg: 1L,优选3kg:1L0
[0011]所述步骤(1)中的星柳珊瑚原料与石油醚以及氯仿的质量体积比为8kg:1L-12kg: 1L，优选9kg: 1L，萃取次数为3-5次，优选4次。
[0012]所述步骤(1)中的MCI柱层析分离的上样水溶液的体积为每公斤星柳珊瑚原料60mL-100mL, MCI柱床体积为每公斤星柳珊瑚原料80mL_100mL，60%、100%甲醇水溶液的用量为每公斤星柳珊瑚原料300mL-500mL。
[0013]所述步骤(2)中的100~200目硅胶用量为星柳珊瑚总皂苷质量的1_1.5倍；200~300目硅胶的用量为星柳珊瑚总皂苷质量的10-15倍；每份氯仿-甲醇用量为星柳珊瑚总皂苷质量的40-60倍；每份氯仿-甲醇-水用量为星柳珊瑚总皂苷质量的25-40倍。
[0014]所述步骤(3)中的Sephadex LH-20凝胶柱分离具体为:按照每50_80mL柱床体积ImL样品溶液的比例上样，经无水乙醇洗脱，TLC检测各馏分，收集在体积比为40:10:1的氯仿-甲醇-水体系中Rf值为0.3的成分合并，减压浓缩回收无水乙醇，即可。
[0015]所述步骤(3)中得 到的甾体皂苷用于抗肿瘤药物的制备。
[0016]所述留体皂苷用于肝癌和早幼粒细胞白血病抗肿瘤药物的制备。
[0017]本发明中制备柳珊瑚留体阜苷dimorphoside A结构经核磁、质谱等波谱学方法以及与文献数据对照鉴定，产率大于等于0.03%。
[0018]本发明中留体阜苷dimorphoside A对肿瘤细胞株肝癌Bel-7402和早幼粒细胞白血病HL-60的半数抑制浓度IC5tl分别为31.6、31.6 μ M，显示一定的体外抗肿瘤活性。
_9] 有益.效果
[0020]文献表明该化合物本来是另一种柳珊瑚Anthoplexaura dimorpha的成分,具有良好的细胞分裂抑制作用；本发明纯化工艺简单，成本低；提供了 dimorphoside A新的制备方法，尤其是作为星柳珊瑚最主要成分并显示较好的体外抗肿瘤活性，表现出在生物医药领域的潜在用途。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0022]实施例1
[0023]星柳珊瑚(新鲜样品湿重2.25kg)剪碎，用甲醇1.0L渗漉提取4次，提取液经减压回收溶剂后加水至700mL混悬,依次加石油醚250ml萃取4次、氯仿250ml萃取4次,然后将水相浓缩至200mL，通过200mL柱体积的MCI (购自日本三菱化学公司)层析柱分离，依次以60%、100%甲醇水溶液800mL、1000mL洗脱，取甲醇洗脱部分，水浴(≤40°C)减压浓缩回收溶剂后干燥，得到褐色粉末10.Sg,即星柳珊瑚总皂苷；其提取率为0.48%。[0024]实施例2
[0025]星柳珊瑚总皂苷10.8g按1:1比例用硅胶(100~200目)拌匀，经样品与硅胶(200~300目，120g)的硅胶柱色谱分离，依次以氯仿-甲醇(12:1、8:1、6:1，每洗脱液500mL)、氯仿-甲醇-水(50:10:1、40:10:1、30:10:1、14:6:1，每洗脱液 300mL)梯度洗脱，薄层色谱(TLC)检测各馏分，相同组分合并浓缩，得到7个粗皂苷混合物。硅胶柱色谱分离得到的第6个粗皂苷混合物1.12g，溶解于3mL无水乙醇中形成浓溶液，进行凝胶柱Sephadex LH-20分离(柱体积200mL)，用无水乙醇溶液洗脱，TLC检测各馏分，收集主要成分合并浓缩得到化合物LAD-01 (810mg)，产率为0.036%。
[0026]实施例3
[0027]LAD-Ol为无色粉末，溶于甲醇；TLC检测在氯仿-甲醇-水(40:10:1)体系中Rf值0.3，紫外(254nm)下有弱吸收，用7%硫酸-乙醇浸润，加热显紫红色；ES 1-MS m/z:749.2[M+Na]+,725.4[M-H]- ; 1H-?3C-匪R 数据见表 I ;以上数据与文献(Nobuhiro F，KenjiY，Shigeki M，et al.Dimorphosides A and B,novel steroid glycosides from thegorgonian Anthoplexaura dimorpha[J].Tetrahedron Lett.，1987，28 (11):1187-1190.)对照，与化合物dimorphoside A波谱数据基本一致，故将此化合物LAD-Ol鉴定为dimorphoside A,结构如下:
[0028]
【权利要求】
1.一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，包括: (1)采用甲醇提取星柳珊瑚，总提取物加水成混悬液，依次加石油醚、氯仿萃取，然后将水相浓缩，通过MCI柱层析分离，依次以60%、100%甲醇水溶液洗脱，取甲醇洗脱部分减压浓缩回收溶剂后干燥，得到星柳珊瑚总皂苷； (2)星柳珊瑚总皂苷用100~200目硅胶拌匀，经200~300目硅胶柱色谱分离，依次以体积比为12:1,8:1,6:1的氯仿-甲醇、体积比为50:10:1,40:10:1,30:10:1,14:6:1的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，薄层色谱检测各馏分，相同组分合并浓缩，得到7个粗皂苷混合物； (3)取硅胶柱色谱分离得到的第6个粗皂苷混合物溶解于无水乙醇中形成300-500mg/mL溶液，进行Sephadex LH-20凝胶柱分离，收集主要成分合并浓缩得到甾体皂苷。
2.根据权利要求1所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述步骤(O中的星柳珊瑚原料与水的质量体积比为lkg:lL-5kg:lL。
3.根据权利要求1所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述步骤(O中的星柳珊瑚原料与石油醚以及氯仿的质量体积比为8kg:lL-12kg:lL，萃取次数为3-5 次。
4.根据权利要求1所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中的MCI柱层析分离的上样水溶液的体积为每公斤星柳珊瑚原料60mL-100mL，MCI柱床体积为每公斤星柳珊瑚 原料80mL-100mL，60%、100%甲醇水溶液的用量为每公斤星柳珊瑚原料 300mL-500mL。
5.根据权利要求1所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的100~200目硅胶用量为星柳珊瑚总皂苷质量的1-1.5倍；200~300目硅胶的用量为星柳珊瑚总皂苷质量的10-15倍；每份氯仿-甲醇用量为星柳珊瑚总皂苷质量的40-60倍；每份氯仿-甲醇-水用量为星柳珊瑚总皂苷质量的25-40倍。
6.根据权利要求1所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中的S印hadexLH-20凝胶柱分离具体为:按照每50_80mL柱床体积ImL样品溶液的比例上样，经无水乙醇洗脱，TLC检测各馏分，收集在体积比为40:10:1的氯仿-甲醇-水体系中Rf值为0.3的成分合并，减压浓缩回收无水乙醇，即可。
7.根据权利要求1所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中得到的留体皂苷用于抗肿瘤药物的制备。
8.根据权利要求7所述的一种星柳珊瑚留体皂苷的制备方法，其特征在于:所述甾体皂苷用于肝癌和早幼粒细胞白血病抗肿瘤药物的制备。
【文档编号】A61P35/00GK103936810SQ201410069695
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】陆亚男, 樊成奇, 田晓清, 杨桥, 崔萍 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所