一种虎舌红三萜皂苷对照品的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，设及一种中药有效成分化学对照品的制备，具体设及 一种虎舌红=祗皂巧对照品的制备方法。
【背景技术】
[0002] 虎舌红为紫金牛科紫金牛属植物虎舌红ArdisiamamillataHance的干燥全草， 既是著名的观赏植物，又是我国民间常用草药，具有清热利湿、平肝解郁、活血化渺的功效， 其药用价值早在《本草纲目》中就有记载，对治疗肝炎、风湿、小儿巧积等有奇效。其主要有 效成分是其中的一种S祗皂巧一一西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2)-P-D-葡萄化 喃糖-(1 一 4) -[ 0 -D-葡萄化喃糖-(1 一 2) -] -aA-阿拉伯化喃糖巧（简称虎舌红素B)， 运是存在于紫金牛科紫金牛属植物虎舌红（ArdisiamamillataHance)、朱砂根（Ardisia brevicaulisDiels)、百两金（ArdisiaCrispa(Humt). )A.DC.)等多种植物中的有效成分， 现代药理研究表明该活性成分具有细胞毒活性和抗肿瘤、抗炎等药理作用。在深入研究开 发该活性成分的过程中，需要进行制剂工艺、内在质量、稳定性等一系列药学研究工作，都 需要相应对照品进行支撑。但目前未见虎舌红素B对照品的制备方法，为深入探讨本品的 成药性及药理活性，我们从虎舌红中提取分离得到运种虎舌红=祗皂巧单体，并按照对照 品研究技术指导原则进行了纯化及结构鉴定。为深入研究上述含虎舌红素B活性成分药材 及制剂的内在质量提供对照物质，也为进一步的新药开发提供参考。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种西克拉敏A 3-0-a -鼠李化喃 糖-(1一2) - 0 -D-葡萄化喃糖-(1一4) -[0 -D-葡萄化喃糖-(1一2)-]- a A-阿拉伯化 喃糖巧对照品的制备方法。
[0004] 本案发明人通过对虎舌红化学成分进行文献查阅和实验研究，发明了虎舌红药材 回流提取、大孔吸附树脂和硅胶柱层析分离纯化，高效液相色谱制备西克拉敏A3-0-a-鼠 李化喃糖-(1一2) - 0 -D-葡萄化喃糖-(1一4) -[0 -D-葡萄化喃糖-(1一2)-]- a A-阿 拉伯化喃糖巧对照品的方法，经薄层色谱多个展开及显色系统分离均显示一个斑点，采用 HPLC-ELSD峰面积归一化法计算，其质量浓度大于98%，符合中药定量分析用化学对照品 纯度的质量要求，因而完成了本发明。
[0005] 本发明提供了一种西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2)-e-D-葡萄化喃 糖-(1 一 4) - [ 0-D-葡萄化喃糖-(1 一。-aA-阿拉伯化喃糖巧对照品的制备方法，主 要包括W下步骤：
[0006] 1)取虎舌红药材，粉碎过10目筛，加50%~90%的乙醇回流提取，滤过，提取液减 压回收醇得提取液；
[0007] 2)将提取液上大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30%乙醇 洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80 %乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压浓 缩干燥得浸膏；
[0008] 3)将2)的浸膏与等量硅胶拌样，干燥、研细后均匀倒入装好的硅胶柱上端，缓缓 加入流动相，W适宜的流速进行洗脱，收集富含虎舌红素B的流份，浓缩，甲醇重结晶，即得 虎舌红素B提取物。
[0009] 4)将3)得到的虎舌红素B提取物用制备高效液相色谱分离纯化。色谱条件： W十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水或乙腊-水为流动相，检测波长205nm， 收集目标峰并浓缩干燥得西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2)-0-D-葡萄化喃 糖-(1 一 4)-[0 -D-葡萄化喃糖-(1 一 2)-]-aA-阿拉伯化喃糖巧。
[0010] 根据前述的制备方法，其中，所述的回流提取溶剂浓度为60%乙醇。
[0011] 根据前述的制备方法，其中，所述的大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树 月旨，经过0101、0141、0140^种型号的比较，优选为0141。
[0012] 根据前述的制备方法，其中，所述的硅胶柱洗脱剂为乙酸乙醋：甲醇化：4~ 8 : 2)和氯仿：甲醇：水（10 : 5 : 0.5)，考虑安全性，优选为前者。
[0013] 根据前述的制备方法，其中，所述的HPLC的流动相中甲醇与水的体积比为 62 : 38~72 : 28;乙腊与水的体积比为30 : 70~40 : 60,优选甲醇-水的体积比为 60 : 40,乙腊-水的体积比为35 : 65,考虑安全性，优选甲醇-水系统为HPLC制备用流动 相。
[0014] 本发明制备的虎舌红素B经高分辨质谱（HR-FAB-M巧给出精确分子量为1074， 其碳、氨核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为 西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2)-P-D-葡萄化喃糖-(1 一 4)-[P-D-葡萄化喃 糖-(1 一 2)-]-aA-阿拉伯化喃糖巧。
[0015] 本发明制备的虎舌红素B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)纯度 检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，WHPLC-ELSD峰面积归一化法测定， 其质量分数均大于98%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。
[0016] 而且本发明药材提取完全，所需有机溶剂少，溶剂无毒无污染。
【附图说明】
[0017] 图1为西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一-D-葡萄化喃 糖-(1 一 4)-[ 0 -D-葡萄化喃糖-(1 一 2)-]-aA-阿拉伯化喃糖巧的HPLC-UV制备色谱 图 阳0化]图2为西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一-D-葡萄化喃 糖-(1 一 4)-[ 0 -D-葡萄化喃糖-(1 一 2)-]-aA-阿拉伯化喃糖巧的HPLC-ELSD纯度检 测色谱图
【具体实施方式】
[0019] W下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明，依据现有技术，本 发明的实施方式并不限于具体实施例。
[0020] 仪器、试药与样品
[0021] 高效液相色谱仪（美国安捷伦1100系列），包括在线真空脱气机（G1322A)， 四元梯度累（G1311A)，自动进样器（G1313A)，柱溫箱（G1316A)，DAD检测器（G1314A)， 化emstation色谱工作站；AlltechELSD2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色 谱仪（美国贝克曼库尔特邸CHMAN125P型），包含SYSTEMGOLD125PSolventModule 和 16化Detector等；MiIIi-Q超纯水器（美国Milipore公司）！Microfuge18 台式 离屯、机（美国贝克曼库尔特有限公司）；KQ-500DE超声清洗机（昆山市超声仪器有 限公司，功率300W，频率40曲Z)巧P-210D型电子分析天平（德国赛多利斯，十万分之 一）；过滤装置（Autoscience)及微孔滤膜化45Jim)。分析色谱柱：WatersSymmetiT Cis(150mmX4. 5mm，5ym)；PhenomenexGeminiQs(150mmX4. 5mm，5ym)；AlltechAltimma Cis(250mmX4. 5mm，5]im);制备色谱柱：BECKMANULTRAPREPC18(21.ImmX150mm，10ym); 保护挂袖enomnexCis。 阳0巧实施例I
[0023] I.对照品的制备
[0024] 1)取虎舌红药材，粉碎过10目筛，加10倍量的80%的乙醇回流提取2小时，重复 提取3次，滤过，合并滤液并减压回收乙醇得虎舌红提取物；
[00对。将提取液上D141大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用30% 乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80 %乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减 压浓缩干燥得虎舌红浸膏；
[00%] 3)将2)的浸膏与等量硅胶拌样，干燥、研细后均匀倒入装好的硅胶柱上端，缓缓 加入流动相乙酸乙醋：甲醇（7 : 3)，W适宜的流速进行洗脱，收集富含虎舌红素B的流份， 浓缩，甲醇重结晶，即得虎舌红素B粗品。
[0027] 4)将3)得到的虎舌红素B粗品用制备高效液相色谱分离纯化。色谱条件： W十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水（70 : 30)为流动相，检测波长205nm， 收集目标峰并浓缩干燥得西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2)-0-D-葡萄化喃 糖-(1 一 4)-[e-D-葡萄化喃糖-(1 一 2)-]-〇寸-阿拉伯化喃糖巧（产率1.64% )。
[0028] 2.对照品的结构鉴定
[0029] 上述虎舌红素B为白色粉末，烙点：263-265°C。[a]%=-23. 5(Me0H，0. 24)。
[0030] 虎舌红素B的高分辨质谱（HR-FAB-M巧给出精确分子量:m/z1097. 5432 [M+Na]， 对应分子式为：CwHse〇22Na(分子量计算值为：1097. 5509)。
[0031] 虎舌红素B的"C-NMR谱给出53个碳信号，其中30个信号为巧元碳信号，23个信 号为糖残基碳信号。30个巧元信号中有6个为角甲基碳信号值EPT谱信号）：5 16. 1(C， 25-C)，16. 2 (C，24-C)，18. 0 (C，26-C)，19. 3 (C，27-C)，24. 0 (C，29-C)和 27. 7 (C，23-C) ; 1 个 醒基碳信号：5 207. 9(C，30-C) ;1个环酸亚甲基碳信号：5 75. 8(邸2,28-〇。Ih-NMR谱也显 示了 6 个角甲基氨信号：5 0. 72 (3H，S)，0. 80 (3H，S)，1. 06 (3H，S)，1. 17 (3H，S)，0. 91 (3H，S) 和0. 94 (3H，S);1个醒基氨信号：5 9. 75 (1H，S)。上述1扎"C-NMR谱数据为该化合物巧元的 特征信号；将虎舌红素B的iH-，"C-NMR谱数据与文献对照，并结合虎舌红素B的个gCOSY， HMQC，HMBC，N0ESY等二维核磁共振谱分析，最终确定其巧元为西克拉敏A(cyclamine A); 阳03引虎舌红素B的中，"C-NMR谱还显示了 4个糖残基的端基碳、氨信号：S 100. 1 (鼠 李糖，C-1)，101. 9 (葡萄糖-1，C-1)，103. 0 (阿拉伯糖，C-1)，103. 6 (葡萄糖-2, C-1)和 5 5. 09 (1H，br.S，鼠李糖，H-1)，4. 4