一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法
【专利摘要】本发明提供一种从山楂叶中同时制备总三萜皂苷提取物和总黄酮提取物的方法。将山楂叶原料粉碎，用乙醇水混合溶液提取，提取物通过大孔树脂和聚酰胺柱色谱进行分离纯化，得到总三萜皂苷提取物及总黄酮提取物。本发明方法具有工艺简单，操作方便，实用性强，成本低，污染少，并可同时得到高纯度的总三萜皂苷和总黄酮等优点。
【专利说明】一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药制药领域，尤其涉及从山楂叶中同时制备总三萜皂苷和总黄酮的制备方法。
【背景技术】
[0002]山 楂叶为蔷微科山楂属植物山里红(Crataeguspinnatif ida Bge.var.majorN.E.Br)或山楂(C.pinnatif ida Bge.)的干燥叶，具有消食健胃，活血化瘀止痒，敛疮，降血压的功效。临床上用于防治心脑血管疾病如高血压，高血脂，冠心病，心绞痛，脑供血不足等症。研究表明山楂叶中的三萜类成分和总黄酮成分均为山楂叶的活性成分。黄酮类成分具有扩张血管，改善冠状动脉供血，抗凝血等作用。三萜类成分除具有降血压，降血脂，改善心肌缺血等的作用外，还具有抗炎，抗癌，抗病毒等作用。
[0003]目前，关于单一提取山楂叶中的总黄酮的专利较多，如专利CN1436785A提供了一种用大孔树脂提取山楂叶中总黄酮的方法，得到含量为90%的总黄酮提取物；专利CN1839957A提供了一种用聚酰胺从山楂叶中提取注射用总黄酮的方法，提取物中总黄酮的含量为80%等。此外，还有关于从山楂叶中提取总黄酮和总酚酸的总提物的专利，如专利CN1565464A提供一种通过两次大孔树脂柱层析纯化后得到含有总黄酮和总酚酸的提取物的方法，其中总酚酸的含量为50%~90%，总黄酮的含量为10%~40%。专利CN102755405A提供了一种用水提取的方法从山楂叶中获得含有总黄酮、多糖和有机酸三种成分的总提物的方法。
[0004]上述方法多以获得山楂叶中的总黄酮为主，有些还可同时获得酚酸，多糖和有机酸，但却没有从山楂叶中获得总三萜皂苷的方法，造成了三萜类有效成分的流失。本发明提供了一种从山楂叶中同时制备总黄酮和总三萜皂苷的新方法，不仅保留了黄酮类有效成分还使三萜类有效成分得以保存，该方法简便易行，分离效果好，避免有效成分损失浪费，适于工业化生产。
[0005]酶标仪是酶联检测的反应仪器，近年来，也广泛用于物质的含量测定。酶标仪在物质的含量测定方面有与紫外分光光度计相同的理论基础，都遵循朗伯比尔定律。酶标仪的样品池如96孔板多是由聚苯乙烯制成，在400nm下有较强的紫外吸收，会对样品测定产生干扰，因此酶标仪的检测波长通常在400nm以上。与紫外分光光度法相比，用酶标仪进行含量测定其优点在于:可多孔重复，准确性高，测试间隔短，时效性好，样品独立测试不用一个比色杯重复使用避免不同样品相互干扰。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从山楂叶中同时制备总三萜皂苷和总黄酮的方法。此发明目的可通过以下说明实现。
[0007](I)将山楂叶原料粉碎，用乙醇水混合溶液(30%~80%)提取，合并提取液减压浓缩至无醇味；[0008](2)将步骤(1)的浓缩物用水混悬，用大孔树脂吸附后，用30%~80%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；
[0009](3)将步骤(2)的浓缩物用水稀释至浓度为20%~30%，静置，过滤沉淀；
[0010](4)取上清液进行80~400目的聚酰胺柱色谱，先用20%~50%乙醇洗脱I~3个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷提取物干燥粉末；
[0011](5)再用50%_90%乙醇洗脱I~5个保留体积，收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末；
[0012](6)用酶标仪测定总三萜皂苷提取物中皂苷类成分的含量，以熊果酸为对照品，5%香草醒一冰醋酸和高氯酸为显色剂，检测波长为548nm，测得总皂苷含量为80%以上；
[0013](7)用酶标仪测定总黄酮提取物中总黄酮类成分的含量，以芦丁为对照品，硝酸铝为显色剂，检测波长为510nm，测得总黄酮含量为90%以上。
[0014]步骤(1)中的乙醇水混合溶液的用量是原料的8-10倍，浓度优选50%~80%，更优选70%~80%。提取2-3次。所述提取方法为超声提取，微波辅助提取或闪式提取。
[0015]步骤(2)中大孔树脂类型选自DM301、NKA-9 型、AB-8、D101、DM130、DM_18、D312 型弱极性或中极性大孔树脂。
[0016]步骤(2)中洗脱浓度优选为40~60%，优选50%。
[0017]步骤(3)中优选稀释浓度为30%。
[0018]步骤(4)中乙醇浓度优选20%~25%，聚酰胺柱色谱为80~400目，优选200~
400 目。
[0019]步骤(5 )中乙醇浓度优选50%~70%，优选60%。
[0020]本发明的优点是:
[0021](1)采用超声提取、微波辅助提取、闪式提取等提取方法使提取更完全，更快速，同时避免了有效成分的受热分解。
[0022](2)同时得到了总三萜皂苷提取物和总黄酮提取物，并且提高了皂苷和黄酮的含量，使苷类成分含量在80%以上，黄酮类成分含量在90%以上。
[0023](3)制备工艺简单易行，实用性强；大孔树脂和聚酰胺价格便宜，可再生和反复利用，成本低；用乙醇-水作为溶剂污染少，也避免了用正丁醇等溶剂萃取时的溶剂残留。
[0024](4)用酶标仪进行含量测定，速度快，省时简便，消耗试剂少。
【具体实施方式】
[0025]本发明结合具体实施例作进一步的说明。
[0026]实施例1
[0027]将300g山楂叶原料粉碎，用10倍量的80%乙醇，微波辅助提取2次，每次15min，功率为600W，合并提取液减压浓缩至无醇味。用AB-8大孔树脂吸附后，用80%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400聚酰胺柱色谱，先用50%乙醇洗脱I个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末2.34g ;收率为0.78%，再用80%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末 24.15g ;收率为 8.05%。[0028]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为83%。
[0029]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为93%。
[0030]实施例2
[0031]将300g山楂叶原料粉碎，用8倍量的30%乙醇，微波辅助提取2次，每次15min，功率为600W，合并提取液减压浓缩至无醇味。用AB-8大孔树脂吸附后，用30%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400聚酰胺柱色谱，先用20%乙醇洗脱I个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末2.1Og ;收率为0.7%，再用50%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末 23.25g ;收率为 7.75%。
[0032]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为81%。
[0033]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为90%。·
[0034]实施例3
[0035]将Ikg山楂叶原料粉碎，用10倍量的70%乙醇，超声提取3次，每次20min，合并提取液减压浓缩至无醇味。用DlOl大孔树脂吸附后，用80%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400目聚酰胺柱色谱，先用20%乙醇洗脱I个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末9.2g ;收率为0.92%，再用60%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末89.5g ;收率为8.95%。
[0036]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为81%。
[0037]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为90%。
[0038]实施例4
[0039]将Ikg山楂叶原料粉碎，用8倍量的30%乙醇，超声提取3次，每次20min，合并提取液减压浓缩至无醇味。用DlOl大孔树脂吸附后，用30%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400目聚酰胺柱色谱，先用20%乙醇洗脱I个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末9.5g ;收率为0.95%，再用80%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末89.Sg ;收率为8.98%。
[0040]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为80.2%。
[0041]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为89.3%ο
[0042]实施例5
[0043]将5kg山楂叶原料粉碎，用10倍量的75%乙醇，闪式提取2次，每次20min，合并提取液减压浓缩至无醇味。将提取物用AB-8大孔树脂吸附后，用80%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400目聚酰胺柱色谱，先用20%乙醇洗脱2个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末47.5g ;收率为0.95%，再用60%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末456g ;收率为9.12%。
[0044]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为85%。
[0045]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为91%。
[0046]实施例6
[0047]将5kg山楂叶原料粉碎，用8倍量的40%乙醇，闪式提取2次，每次20min，合并提取液减压浓缩至无醇味。将提取物用AB-8大孔树脂吸附后，用30%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400目聚酰胺柱色谱，先用50%乙醇洗脱2个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末48.5g ;收率为0.97%，再用80%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末460g;收率为9.2%ο
[0048]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为83%。
[0049]取总黄酮提取物 适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为90%。
[0050] 对比例I
[0051 ] 将Ikg山楂叶原料粉碎，用10倍量的80%乙醇，回流提取3次，每次3h，合并提取液减压浓缩至无醇味。用DlOl大孔树脂吸附后，用80%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400目聚酰胺柱色谱，先用20%乙醇洗脱I个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末9.7g ;收率为0.97%，再用60%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末120.3g ;收率为12.03%。
[0052]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为68%。
[0053]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为75%。
[0054]对比例2
[0055]将Ikg山楂叶原料粉碎，用8倍量的30%乙醇，回流提取3次，每次3h，合并提取液减压浓缩至无醇味。用DlOl大孔树脂吸附后，用30%的乙醇洗脱，减压回收乙醇至无醇味；将浓缩物用水稀释至浓度为30%，静置，过滤沉淀；取上清液进行200~400目聚酰胺柱色谱，先用50%乙醇洗脱I个保留·体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷类成分提取物干燥粉末9.7g ;收率为0.97%，再用70%乙醇洗脱4个保留体积，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末122.3g ;收率为12.23%。
[0056]取总三萜皂苷提取物适量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷却后加冰醋酸5.0ml，摇匀，以相应的溶液为空白。在548nm处用酶标仪测定吸光度，测得皂苷含量为69%。
[0057]取总黄酮提取物适量，精密加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min ;精密加4%氢氧化钠溶液2ml，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应的溶液为空白。在510nm波长处用酶标仪测定吸光度，测得黄酮含量为76%。
【权利要求】
1.一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是，通过以下步骤实现: (O取山楂叶原料，用30%~80%乙醇水混合溶液提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味； (2)将步骤(1)浓缩物，经过大孔吸附树脂柱色谱，用30%~80%乙醇进行洗脱，减压浓缩洗脱液至无醇味； (3)将步骤(2)的浓缩物用水稀释至浓度为20%~30%，静置，过滤沉淀； (4)取上清液进行80~400目的聚酰胺柱色谱，先用20%~50%乙醇洗脱I~3个保留体积，收集洗脱液，减压浓缩至膏状，喷雾干燥得总三萜皂苷提取物干燥粉末； (5)再用50%-90%乙醇洗脱I~5个保留体积，收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇至膏状，喷雾干燥得到总黄酮提取物干燥粉末。
2.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:步骤(1)中所述提取方法为超声提取，微波辅助提取或闪式提取。
3.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:步骤(2)中大孔树脂类型选自DM301、NKA-9型、AB-8、D101、DM130、DM_18、D312型弱极性或中极性大孔树脂。
4.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:步骤(1)中的乙醇水混合溶液浓度为50%~80%。
5.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:步骤(2)中洗脱浓度为40~60%。
6.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:步骤(4)中乙醇浓度为20%~25%。
7.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:步骤(5)中乙醇浓度优选50%~70%。
8.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:聚酰胺柱色谱为200~400目。
9.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中制备总三萜皂苷和总黄酮的方法，其特征是:用酶标仪测定总三萜皂苷提取物中皂苷类成分的含量为80%以上，黄酮含量为90%以上。
【文档编号】A61K36/734GK103735667SQ201410049110
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2014年2月12日
【发明者】刘春婷, 李玲芝, 宋少江, 彭缨, 黄肖霄, 刘庆博 申请人:沈阳药科大学