专利名称：一种乙脑疫苗生产用/jev抗体阴性新生牛血清生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,具体地，涉及一种新生牛血清的生产工艺。
背景技术：
新生牛血清含有丰富的蛋白、细胞因子、酶、激素、有机和无机离子 等物质，可作为一种营养成分和抗体保护剂，被广泛地用于疫苗生产、诊断试剂 生产、科学研究实验等领域。目前，国内乙脑疫苗生产厂家使用的新生牛血清基 本依靠进口，原因在于国内的新生牛血清中含有乙型脑炎病毒(Japanese Enc印haiitisVirus,正V)抗体，在乙脑疫苗生产过程中，血清中的抗体会中和部 分疫苗抗原，导致疫苗效价下降，产量降低。因此，生产成本过高的现状急于需 要国产同类产品进行替代。另外，血清生产厂家多为小型作坊式生产，条件相对 简陋，难以保证血清的高质量、均一性和稳定性。
本发明采用空斑减少法对新生牛原料血进行乙型脑炎病毒抗体的大规模筛 査，收集合格的血清进行低温混合、加压分级过滤，得到乙型脑炎病毒抗体阴性 的新生牛血清。该方法工作效率高、结果可靠、低成本、适用于工业化生产，提 高了乙脑疫苗的质量、效价和保护率，降低了乙脑疫苗的生产成本
发明内容
本发明的目的就是提供一种能简便、有效地进行乙型脑炎病毒抗体筛 査的方法和快速的无菌新生牛血清生产工艺。该发明保证了新生牛血清不含有乙 型脑炎病毒抗体，保证了无菌状态，适用于工业化生产，可降低乙脑疫苗的生产 成本。
本发明的内容主要由三部分组成，参见说明书附图l。 1、筛选乙型脑炎病毒抗体合格的原料血。
收集14小时内出生的新生牛血清。将乙型脑炎病毒减毒活疫苗稀释成适当 浓度，使每0.2mL含80个 100个PFU，与不同稀释度的待检血清等量混合， 置37'C作用1.5小时，接种于BHK-21细胞，分别测定PFU，达到抑制50%空 斑形成的血清为抗乙脑病毒抗体阳性血清，判为不合格；抑制率未达到50%的血 清为抗乙脑病毒抗体阴性血清，判为合格。
根据《中国药典(2005年)》附录XIII D小牛血清检测要求，对其它相关 指标，如牛腹泻病毒、血红蛋白、蛋白含量、噬菌体、内毒素等进行检测，达到标准的可以作为合格的原料血进行生产。
2、 规模化低温混匀。
在万级洁净级别的生产车间将原料血倒入最大容积为1500升、具有双层夹 套的混合罐中，以25-35转/分钟的转速搅拌血清，使其均匀混合。同时混合罐 的夹套中用乙二醇进行循环制冷，温度控制在6°C至12°C之间。
3、 加压分级过滤除菌。
混合罐下游依次连接着三个装有不同孔径过滤介质的过滤器。混合罐上有氮 气通入口，进行加压，使血清依次通过1.0|am/0.5|im、 0.5|am/0.2|im、 0.1|am的过 滤介质。前两种介质除去细菌等大分子杂质，后一种介质除去支原体。过滤好的 血清被导入储存罐，通过分装机在局部百级洁净级别的超净工作台进行分装。
具体实施方式
滴定乙脑减毒活疫苗，根据滴定结果，选择一定稀释度(例10"4) 的病毒(使其病毒含量为50PFU/mL)与等体积的新生牛血清样品进行混合，37。C 孵育1.5小时。同时用乙型脑炎病毒阴阳性血清国家参考品设置阴阳性对照。然 后将血清-病毒混和液均匀接种于六孔板的单层BHK-21细胞，于37。C、 5%C02 孵育1.5小时。孵育后，加入以MEM培养液、甲基纤维素、3%谷氨酰胺、7.5% NaHC03及不含有乙脑病毒抗体的胎牛血清组成的营养覆盖物，置于37。C、 5% C02孵育5天，用P/。结晶紫染色，进行空斑计数。重复测三次。计算抑制率， 达到抑制50%空斑形成的血清为抗乙脑病毒抗体阳性血清，判为不合格；抑制 率未达到50%的血清为抗乙脑病毒抗体阴性血清，判为合格。阳性对照应完全无 空斑形成，阴性对照空斑数应在50个/孔左右。实施结果如附图2。
同时新生牛血清样品进行牛腹泻病毒、血红蛋白、蛋白含量、噬菌体、内毒 素等指标的检测，检测方法和标准参见《中国药典(2005年)》附录XIIID小
牛血清检测要求。
在万级洁净级别的生产车间将合格的原料血1200升，倒入混合罐中，以 25-35转/分钟的转速全程搅拌血清，使其均匀混合。同时混合罐的夹套中用乙二 醇进行循环制冷，温度控制在6。C至12。C之间。均匀搅拌半小时后，开启氮气 进入阀、三个过滤器的上游阀门和储液罐的上下游阀门，使初始血清缓慢通过过滤器，将其中残留的消毒水压出，收集l万mL血清，该部分血清不分装，可用 于下批血清的生产。然后开启储液罐与分装机相连的阀门，实现过滤和分装同时 进行。生产过程中，三个过滤器的压差控制在0.15-0.2 MPa之间，分装速度控 制在每分钟5L血清左右。
图1为新生牛血清生产流程示意图。所标结构依次为1—混合罐；2、 —装有孔径为1.0|im/0.5|jm过滤介质的过滤器；3—装有孔径为0.5pm/0.2nm过 滤介质的过滤器、4一装有孔径为0.1pm过滤介质的过滤器；5—储液罐；6—分
装机；7—血清原料进口； 8—氮气加压通气口； 9—搅拌器；10—夹套；ll一阀门。
图2为空斑减少法试验示例。经过3次重复试验，8批血清中的第2批、第4批 血清的空斑减少率达到50%以上，检测结果判为阳性，说明其中含有乙型脑炎病 毒抗体。其余的六批血清空斑减少率未达到50%，为合格血清。阳性对照无空斑 形成。阴性对照的空斑数在50个左右。
权利要求
1.一种乙脑疫苗生产用/乙型脑炎病毒抗体阴性新生牛血清生产工艺，其特征在于(1)用空斑减少法(PRNT)筛选乙型脑炎病毒抗体阴性的新生牛血清。(2)低温大规模混合血清。(3)加压分级过滤。
2. 如权利要求书1 (2)所述，其特征在于运用空斑减少法(PRNT)进行乙型 脑炎病毒抗体筛选。
3. 如权利要求书1 (3)所述，其特征在于在最大容积为1500升的具有双层夹 套的混合罐中进行大规模血清混合。
4. 如权利要求书l (3)所述，其特征在于混合罐中有搅拌器进行搅拌，搅拌速 度在25-35转/分钟之间，
5. 如权利要求书l (3)所述，其特征在于该罐夹套中用冷媒进行低温制冷，温 度控制在6。C至12。C之I'曰J。
6. 如权利要求书l (4)所述，其特征在于混合罐上端有氮气加压通气口，在过 滤中施加压力。
7. 如权利要求书l (4)所述，其特征在于进行三级过滤，采用的过滤材料介质 孔径分别为1.0)am/0.5(^m、 0.5|^m/0.2)am、 0.1|im。
全文摘要
本发明涉及一种新生牛血清生产工艺，具体地说，涉及一种乙脑疫苗生产用/乙型脑炎病毒抗体阴性新生牛血清生产工艺。本发明生产工艺，其工艺流程包括乙型脑炎病毒抗体阴性原料血清筛选、大规模混合、加压分级过滤和分装。本发明的优点是采用空斑减少法筛选出乙型脑炎病毒抗体阴性的粗制血清进行加工生产，工作效率高、结果可靠、低成本、适用于工业化生产，提高了乙脑疫苗的质量、效价和保护率，降低了乙脑疫苗的生产成本。
文档编号C07K1/34GK101525372SQ20081003427
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月6日 优先权日2008年3月6日
发明者严正龙, 军 唐, 勇 沈, 华 王, 醇 邵, 陈继东 申请人:上海九诺生物科技有限公司