专利名称：使用肠杆菌科细菌生产l-氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物产业，特别涉及使用肠杆菌科的细菌生产L-氨基酸方法，所述细菌具有来源于属于泛菌属(Pantoea)的细菌的蛋白质，且所述蛋白质能够赋予对半胱氨酸的抗性。
背景技术：
常规上，L-氨基酸是通过利用从天然来源获得的微生物菌株，或其突变体的发酵方法进行工业生产的。通常，对所述微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产量。已经报道了许多提高L-氨基酸产量的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利号4，278，765)。其它提高产量的技术包括增加参与氨基酸生物合成的酶的活性和/ 或使所述目标酶对由所得的L-氨基酸导致的反馈抑制脱敏(desensitize)(美国专利号 4，346，170,5, 661，012 和 6，040，160)。公开了一种新的微生物菌株，其适于发酵生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰基-丝氨酸(其是从0-乙酰基-L-丝氨酸通过非酶法转化生产的)，和/或噻唑烷 (thiazolidine)衍生物。该新菌株过表达至少一种编码介导抗生素或其它对所述微生物有毒的物质的细胞清除的蛋白质的基因(EP 0885982)。已经在基因库(gene bank)中鉴定了一种来自大肠杆菌(Escherichia coli)的染色体片段，其能够在工业生产菌株中增加半胱氨酸的产量。亚克隆和遗传分析显示其原因是编码299个氨基酸的产物的开放阅读框，称为0rf299。在T7聚合酶/启动子系统中合成了该0rf299，其显示了膜内在蛋白质的特性。这些结果进一步表明0RF299编码负责排出半胱氨酸途径的不同代谢物的输出泵(export pump) (Dassler Τ.等，Mol. Microbiol.； 36(5) :1101-12^000)。发现ORF yfiK基因当在一种工业大肠杆菌生产菌株中过表达时，能够增加半胱氨酸的生产。yfiK基因产物为膜内在蛋白质，具有约六个预测的跨膜螺旋，且其属于输出蛋白 (export protein)的IihtB家族。从质粒过度产生YfiK导致0-乙酰基-L-丝氨酸和半胱氨酸强烈(drastic)并平行(parallel)地分泌到培养基中，但仅当所述生物具有对由半胱氨酸导致的反馈抑制不敏感的丝氨酸转乙酰酶时方如此。当将过量的0-乙酰基-L-丝氨酸添加至培养基中时，在携带yfiK的转化体以及在野生型菌株中，这种对于半胱氨酸分泌过程中存在反馈非敏感性丝氨酸转乙酰酶的需要均被消除。AyfiK突变体并不显示任何表型，且当用携带ydeD(之前已表征的另一种0-乙酰基-L-丝氨酸/半胱氨酸输出蛋白)的质粒转化时，能够输出0-乙酰基-L-丝氨酸和半胱氨酸。因为ydeD-yfiK双重突变体显示相同的表现模式(pattern)，看来YfiK和YdeD独立地起作用。细胞需要藉由输出蛋白的合成来调节0-乙酰基-L-丝氨酸内部储备池(internal pool)大小可能与该化合物(当外源供应时)可抑制生长的事实有关。ydeD或yfiK的过表达可减轻该抑制，并增加对0-乙酰基-L-丝氨酸的类似物重氮丝氨酸(azaserine)的抗性(Franke I等，J Bacteriol.； 185(4) :1161-6(2003)) ο
大肠杆菌细胞色素bd及周质(periplasmic)细胞色素的组装需要ATP-结合盒转运蛋白(cassette transporter) CydDC，其底物未知。对来自野生型和cydD突变体菌株的周质的二维SDS-PAGE比较显示，后者有数种周质转运结合蛋白缺陷，尽管cydD周质中并未缺少任一种主要的蛋白质。相反，CydDC将氨基酸半胱氨酸从细胞质输出到周质，这可使用反转的膜囊来进一步示明这些膜囊将放射性标记的半胱氨酸以依赖ATP、不依赖解耦合 (uncoupled)的方式向内转运。报道了新的多效cydD表型，包括具有对苄青霉素和二硫苏糖醇敏感性的表型，和丧失活动力(motility)的表型。这两种表型均与二硫键形成的周质缺陷一致。在cydD和野生型菌株中外源半胱氨酸的存在能够反转(reverse)这些表型，并影响周质C-型细胞色素的水平，但并不恢复细胞色素d。与CydDC是半胱氨酸输出蛋白相一致，cydD突变体生长对高半胱氨酸浓度高度敏感，并产生更高的细胞质半胱氨酸水平，一种0RM99(其编码主要易化蛋白超家族(major facilitator superfamily)的输出蛋白) 有缺陷的突变体也是如此。cydD 0RM99双重突变体对于半胱氨酸极其敏感，并具有更高的细胞质半胱氨酸水平，而CydDC过表达赋予对高胞外半胱氨酸浓度的抗性。很可能CydDC负责半胱氨酸的输出，半胱氨酸的输出对于周质中的氧化还原的稳态是至关重要的(Pittman M. S.等，J Biol Chem. ；277 (51) :49841-9 (2002)) 除了 YdeD和YfiK(它们先前已作为大肠杆菌中的L-半胱氨酸输出蛋白被报道) 之外，分析了大肠杆菌中33个推定的药物转运蛋白基因对L-半胱氨酸输出和过度产生的作用。acrD、acrEF、bcr、cusA、emrAB、emrKY、yb_]TZ 和 yojIH 的过表达反转了 L-半胱氨酸对tnaA被破坏的大肠杆菌细胞的生长抑制。tnaA基因是主要的半胱氨酸脱巯基酶基因。 发现这八个基因的过表达可减少在L-半胱氨酸的存在下培养之后的胞内L-半胱氨酸水平。氨基酸转运测定显示Bcr过表达，其赋予对双环霉素和四环素的抗性，尤其促进了由质子梯度产生的能量所驱动的L-半胱氨酸输出。当用携带bcr基因的质粒转化tnaA被破坏的、表达被改变的cysE基因的大肠杆菌菌株时，转化体与仅携带所述载体的细胞相比产生更多的L-半胱氨酸。报道基因测定表明所述bcr基因以显著的水平组成性表达。这些结果表明主要易化蛋白家族中的多种药物转运蛋白Bcr参与遗传工程改造的大肠杆菌细胞中L-半胱氨酸的输出和过度产生(Yamada S.等，Appl Environ Microbiol. ；72 (7) 4735-42(2006))ο然而目前，并无使用具有如下蛋白质的细菌以供生产L-氨基酸的目的的报道所述蛋白质来源于属于泛菌属的细菌、且能够赋予针对由细菌中的L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性。
发明内容
本发明公开的主题的方面可包括提高L-氨基酸生产菌株的生产能力，并提供使用这些菌株生产非芳族或芳族L-氨基酸的方法。通过发现赋予细菌对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质活性可导致 L-氨基酸(如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、 L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸)的产量提高而实现了上述方面。
本发明提供了肠杆菌科的细菌，其具有增加的生产氨基酸(如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸)的能力。本发明的一个方面是提供生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养肠杆菌科的细菌，并从所述培养基收集所述L-氨基酸，其中所述细菌能够生产L-氨基酸，且经修饰而增加了能够赋予细菌对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质的活性，其中所述蛋白质选自下组(A)SEQ ID NO 2的蛋白质或其变体，和(B)SEQ ID NO 4的蛋白质或其变体。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中在所述细菌中编码所述蛋白质的 DNA表达增强。本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌用编码所述蛋白质的 DNA转化。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述DNA选自cOOll和d0663基因。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌经修饰以至少增加了蛋白质(B)或其变体的活性，并进一步经修饰以增加编码SEQ ID NO :6的蛋白质或其变体的 DNA的表达。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述DNA是C09478基因。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属 (Escherichia)0本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌是Pantoea ananatis。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述芳族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述非芳族L-氨基酸选L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、 L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和0-乙酰基-L-丝氨酸。本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自下组L_半胱氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、 L-组氨酸和0-乙酰基-L-丝氨酸。本发明如下详细描述。附图简述
图1显示携带质粒pSTV-cOOllPF和pSTV-PA36ccd的菌株在含有半胱氨酸的培养基中的生长曲线。
具体实施例方式1.细菌所述细菌可为肠杆菌科的L-氨基酸生产菌，其中所述细菌具有来源于属于泛菌属的细菌的蛋白质，且所述蛋白质能够赋予对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性。短语“L-氨基酸生产菌”可意指当在培养基中培养时，具有生产L-氨基酸并将 L-氨基酸排入该培养基中的能力的细菌。短语“L-氨基酸生产菌”还可意指能够生产L-氨基酸，并导致L-氨基酸在培养基中以大于野生型或亲本大肠杆菌菌株(如大肠杆菌K-12)的量积累的细菌，优选可意指所述微生物能够导致目标L-氨基酸在培养基中的积累量不少于0. 5g/L，并在另一个实施方案中不少于1. Og/L。术语“L-氨基酸”可包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、 L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和0-乙酰基L-丝氨酸。术语“芳族L-氨基酸”可包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。术语“非芳族L-氨基酸”可包括L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸和半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、 L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、 L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和0-乙酰基L-丝氨酸。其它实施方案是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和0-乙酰基L-丝氨酸。—些由细菌生产的L-半胱氨酸可在培养基中通过形成二硫键而变为L-胱氨酸。培养基中存在的L-半胱氨酸和硫代硫酸反应可生成S-磺基半胱氨酸(kczepkowski Τ. W. ,Nature, vol. 182(1958))。当培养基中生产S-磺基半胱氨酸时，可通过用还原剂(如二硫苏糖醇)还原来将其转化为L-半胱氨酸。此外，在所述细菌细胞中生成的L-半胱氨酸可与同样存在于所述细胞中的酮、醛，或(例如)丙酮酸缩合，以通过中间产物半缩硫酮 (hemithioketal)生产噻唑烷衍生物(参见日本专利号四92010)。所述噻唑烷衍生物和半缩硫酮可作为平衡的混合物存在。当在培养基中生产了 L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物时，可通过下述方法生产L-半胱氨酸从培养基收集所述噻唑烷衍生物以打破噻唑烷衍生物与 L-半胱氨酸之间的反应平衡，从而使得L-半胱氨酸过量产生。因此，所述L-半胱氨酸生产能力并不仅限于在培养基或细胞中积累L-半胱氨酸的能力，还包括在培养基中积累L-胱氨酸或其衍生物如S-磺基胱氨酸、噻唑烷衍生物、半缩硫酮或其混合物的能力。一些L-半胱氨酸衍生物，如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、 甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，可从作为重要起始材料的半胱氨酸来生物合成。所述L-半胱氨酸衍生物还可包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羰基半胱氨酸(carbocysteine)、磺基半胱氨酸(sulfocysteine)、乙酰基半胱氨酸(acetylcysteine)等。如上所述获得的L-半胱氨酸可用于产生这些L-半胱氨酸衍生物。这些化合物的发酵生产可通过使用相应的生产微生物作为宿主菌株，结合过量产生半胱氨酸的能力来实现。因此，所述L-半胱氨酸生产能力包括上述化合物，如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，这些化合物产生半胱氨酸作为重要的中间产物。为了赋予生产由半胱氨酸生物合成的化合物(如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、 胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸)的能力，可使用在培育棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌中常规使用的方法(参见“Amino Acid Fermentation",Gakkai Shuppan Center (Ltd.)，第一版，1986年5月30日出版，pp. 77-100)。上述方法包括生产具有营养缺陷性突变体、类似物抗性菌株、或代谢调节突变体的特性的微生物，或构建重组菌株使得其过表达相应的生物合成酶。减少催化从主途径分支的反应和/或参与降解相应的化合物或其中间产物的酶的活性，也可有效地增加所述产物。在此，在每种生产细菌的培育中，可赋予上述特性中的一种或多种。相应的生物合成酶的表达可单独增强或以两种或更多种的组合增强。而且，赋予特性(如营养缺陷性突变、类似物抗性或代谢调节突变)可与增强生物合成酶的方法相组合。短语“具有对由L-半胱氨酸导致的生长抑制抗性的细菌”可意指这样的细菌，其来源于作为亲本菌株的细菌菌株，且具有使其能够在含有L-半胱氨酸的培养基中生长的遗传特性。可使用固体培养基。在含有L-半胱氨酸的培养基中培养时，对由L-半胱氨酸导致的生长抑制有抗性的细菌与亲本菌株相比，显示更有利(favorable)生长。例如，可在34°C在具有含50 μ M或更多(或在另一个实例中，200 μ Μ) L-半胱氨酸的Μ9基本培养基的板上培养20小时内形成菌落的细菌，可对L-半胱氨酸有抗性。携带上述基因的菌株在含有50 μ Μ(或在另一个实例中，200 μ Μ) L_半胱氨酸的培养基中与对照菌株相比较可更快地生长，表明该基因或基因位点(gene locus)可赋予半胱氨酸抗性。肠杆菌科包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(E rwinia) > K^M (Klebsiella)(Pantoea) ^jtff ^M (Photorhab-dus) ^ 1 罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属Gerratia)、志贺氏菌属(Shigella)、摩根氏菌属(Morganella)、耶尔森氏菌属(Ye rsinia)等。具体而言，可使用那些根据 NCBI (National Center for Biotechno logy ^formation)数据库 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/ww wtax. cgi ？ id = 91347)使用的分类法归类为肠杆菌科的那些。短语“属于埃希氏菌属的细菌”可意指所述细菌根据微生物学领域技术人员所知的分类法归类于埃希氏菌属。属于埃希氏菌属的细菌的实例包括但不仅限于大肠杆菌 (E. coli) ο埃希氏菌属所属的细菌并无特别限制，但例如，可使用由Neidhardt， F. C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C.，1208，表 1)描述的细菌。短语“属于泛菌属的细菌”可意指所述细菌根据微生物学领域技术人员所知的分类法归类于泛菌属。最近，一些成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的菌种基于对 16S rRNA的核苷酸序列分析等被重新归类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis> Jff 1 lif (Pantoea stewartii)等(International Journal of SystematicBacteriology, July 1989，39 (3). p. 337-345)。而且，一些属于欧文氏菌属的细菌被 S Τ β ^ Pantoea ananatis KS lif (International Journal of Systematic Bacteriology, Jan. 1993，43 (1)，pp. 162-173)。通常的泛菌属细菌的菌株包括但不仅限于， Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成团泛菌和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体实例包括下述菌株Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614，欧洲专利
发明者埃卡特里纳·A·萨夫拉索娃, 宅见和浩, 山崎俊介, 纳塔利亚·V·斯托伊诺娃, 野中源 申请人:味之素株式会社