专利名称:使用肠杆菌科细菌产生l-氨基酸的方法
使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法[0001]本申请是申请日为2007年7月12日，申请号为“200780027157.1”(国际申请号为“？07见2007/064304”)，名称为“使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法”的发明专利申请的分案申请。技术领域：
[0002]本发明涉及微生物工业，具体涉及通过使用具有增强的醇脱氢酶活性的细菌进行发酵来产生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。
背景技术：
[0003]常规而言，在工业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其变体的发酵方法产生L-氨基酸。通常对微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产率(production yield)。[0004]已经报道过许多提高L-氨基酸产率的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利N0.4，278，765)。用于提高产率的其它技术包括增加氨基酸生物合成中涉及的酶的活性和/或使目标酶对产生的L-氨基酸的反馈抑制脱敏(美国专利Nos.4，346，170,5,661,012和 6，040，160)。[0005]通过优化期望的化合物的主要生物合成途径，能够实现对产生L-氨基酸的菌株的进一步改进。通常这通过为细菌补充越来越大量的碳源(如糖，例如葡萄糖)来实现。无论通过PTS的葡萄糖转运的效率为何,但是在高产菌株中对碳源的获取(access)却仍可能不足。另一种增加产生L-氨基酸的菌株的生产力和降低目标L-氨基酸成本的方法是使用替代性(alternative)的碳源,如醇,例如乙醇。[0006]大肠杆菌的醇脱氢酶(乙醇氧化还原酶，AdhE)是一种多功能酶，其通过两个连续的NADH-依赖性乙酰辅酶A还原反应，以及使将丙酮酸切割成乙酰辅酶A和甲酸的丙酮酸甲酸裂合酶来催化乙醇的发酵生产。[0007]AdhE在葡萄糖存在下在厌氧生长的过程中大量合成(约3xl04拷贝每细胞)，并形成称为螺旋体(spirosome)的螺旋结构，这些螺旋结构大约0.22 μ m长，含有 40-60 个 AdhE 分子(Kessler, D.，Herth, W.和 Knappe, J.，J.Biol.Chem.，267，18073-18079 (1992))。当将大肠杆菌细胞培养从厌氧条件转换至有氧条件时，adhE基因的转录降低，并维持在于厌氧条件下所得范围的10%以内(Chen，Y.Μ.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.173, 8009-8013 (1991) !Leonardo, M.R.，Cunningham, P.R.和 Clark, D.P., J.Bacteriol.175, 870-878 (1993) ；Mikulskis, A., Aristarkhov, A.和 Lin, E.C.C.，J.Bacteriol.179，7129-7134(1997) ；MembriIlo-Hernandez, J.和Lin, E.C.C.，J.Bacteriol.181，7571-7579 (1999))。翻译也受到调节，并且需要 RNA 酶III (Membrillo-Hernandez, J.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.181, 7571-7579(1999)；Aristarkhov, A.等，J.Bacteriol.178，4327-4332 (1996))。已将 AdhE 鉴定为大肠杆菌细胞经受过氧化氢应激 (hydrogen peroxide stress)时的主要祀物之一(Tamarit, J., CabiscoI, E.和 Ros, J., J.Biol.Chem.273, 3027-3032 (1998))。[0008]尽管由AdhE催化的两个NADH-偶联反应具有可逆性，野生型大肠杆菌也无法在乙醇作为唯一碳源和能源存在时生长，因为adhE基因在有氧条件下以低水平转录(Chen，Y.Μ.和 Lin, E.C.C., J.Bacteriol.73, 8009-8013 (1991) ; Leonardo, M.R., Cunningham, P.R.&Clark, D.P.，J.Bacteriol.175870-878 (1993))，并且在有氧代谢过程中 AdhE 蛋白的半衰期因金属催化的氧化(MCO)而缩短。[0009]已经分离并表征了能够在乙醇作为唯一碳源和能源时进行有氧生长的大肠杆菌突变体(在37° C，具有取代Ala267Thr的突变体，在乙醇存在下生长，倍增时间为240分钟；具有取代Ala267Thr和Glu568Lys的变体，倍增时间为90分钟)(Membrillo-Hernandez, J.等,J.Biol.Chem.275, 33869-33875(2000) ；Holland-Staley,C.A.等，J.Bacteriol.182, 6049-6054(2000)) 0显然，当按照与生理上的方向相反的方向催化两个连续反应时，对于野生型AdhE而言乙酰辅酶A的形成是速率受限的。作为通过AdhE中的A267T取代来改进Vmax的交换(tradeoff)是酶的热稳定性降低和对MCO损坏的敏感性增加。AdhE中的第二氨基酸取代E568K(A267T/E568K)部分恢复了蛋白质稳定性和对MCO损坏的抗性，而未进一步改进在底物氧化中的催化效率。[0010]然而，迄今尚未有报道使用肠杆菌科(Enterobacteriaceaefamily)细菌通过在含有乙醇的培养基中发酵来增加L-氨基酸的产生，所述肠杆菌科细菌具有活性增强的对有氧失活(aerobic inactivation)有抗性的天然醇脱氢酶或突变醇脱氢酶。[0011]发明概述[0012]本发明的目的包括提高产生L-氨基酸的菌株的生产力，和提供使用这些菌株产生非芳族或芳族L-氨基酸的方法。[0013]通过发现在处于有氧培养条件下有功能的启动子的调控下表达编码醇脱氢酶的天然或突变adhE基因使L-氨基酸(例如，L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和/或L-亮氨酸)的产生增强而达到了该目的。[0014]本发明的目的是提供用于产生L-氨基酸的方法，其包括:[0015]A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，和[0016]B)从培养基中分离L-氨基酸，[0017]其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述非天然启动子在有氧培养条件下有功能。[0018]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述非天然启动子选自下组:Ptac、Plac、
Ptrp^ Ptrc^Rin Pl。[0019]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。[0020]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、胡萝卜软腐欧文氏菌(ErwiniacaFotovora)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、 Pantoea ananatis (菠萝泛菌)、植物乳杆菌(LactobacillusPI ant arum)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。[0021]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ IDN0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为另一种除天冬氨酸残基之外的氣基酸残基。[0022]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ IDNO:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为赖氨酸残基。[0023]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述醇脱氢酶具有至少一个额外的突变，该突变能够改进所述细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长。[0024]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述额外的突变选自下组:[0025]A)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO:2中在位置560的谷氨酸残基；[0026]B)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO:2中在位置566的苯丙氨酸残基；[0027]C)用其它氨基酸残基替代SEQ ID NO:2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和[0028]D)以上各项的组合。[0029]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述额外的突变选自下组:[0030]A)用赖氨酸残基替代SEQ ID NO:2中在位置560的谷氨酸残基；[0031]B)用缬氨酸残基替代SEQ ID NO:2中在位置566的苯丙氨酸残基；[0032]C)用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基分别替代SEQ ID勵:2中在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和[0033]D)以上各项的组合。[0034]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于选自下组的属:埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)和摩根氏菌属(Morganella)。[0035]本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自下组:L_苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。[0036]具体地，本发明涉及如下方面:[0037]1.一种用于产生L-氨基酸的方法，其包括:[0038]A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，和[0039]B)从培养基中分离L-氨基酸，[0040]其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能。[0041]2.根据项I的方法，其中所述非天然启动子选自下组[0042]3.根据项I或2的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。[0043]4.根据项1-3中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌:大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、 鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、Pantoeaananatis、植物乳杆菌和乳酸乳球菌。[0044]5.根据项1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为不是天冬氨酸残基的另一种氨基酸残基。[0045]6.根据项1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为赖氨酸残基。[0046]7.根据项5或6的方法，其中所述醇脱氢酶具有至少一个额外的突变，该突变能够改进所述细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长。[0047]8.根据项7的方法，其中所述额外的突变选自下组:[0048]A)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO:2中位置560的谷氨酸残基；[0049]B)用另一种氨基酸残基替代SEQ ID NO:2中位置566的苯丙氨酸残基；[0050]C)用其它氨基酸残基替代SEQ ID NO:2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和[0051]D)以上各项的组合。[0052]9.根据项7的方法，其中所述额外的突变选自下组:[0053]A)用赖氨酸残基替代SEQ ID NO:2中位置560的谷氨酸残基；[0054]B)用缬氨酸残基替代SEQ ID NO:2中位置566的苯丙氨酸残基；[0055]C)用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基分别替代SEQ ID勵:2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和[0056]D)以上各项的组合。[0057]10.根据项1-9中任一项的方法，其中所述产生L-氨基酸的细菌属于选自下组的属:埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和摩根氏菌属。[0058]11.根据项1-10中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组:L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。[0059]优选实施方案详述[0060]醇脱氢酶是Fe2+-依赖性多功能蛋白质，其在N-末端具有乙醛-辅酶A脱氢酶活性，在C-末端具有铁依赖性醇脱氢酶活性，和丙酮酸甲酸裂合酶失活酶(deactivase)活性。同物异名包括B1241、AdhC和Ana。在有氧条件下，在有氧代谢过程中的活性AdhE蛋白的半衰期因金属催化的氧化而缩短。[0061]在本发明中，短语“醇脱氢酶的活性”的意思是催化醇变成醛或酮的NAD-依赖性氧化反应的活性。醇脱氢酶(EC1.1.1.1)良好地作用于乙醇、正丙醇和正丁醇。醇脱氢酶的活性能够通过例如由Membrillo-Hernandez, J.等描述的方法(J.Biol.Chem.275，33869-33875(2000))来检测和度量。[0062]醇脱氢酶由adhE基因编码，并且可以使用源自或天然存在于(native to)属于以下菌属的细菌的任何adhE基因作为本发明中的醇脱氢酶基因:埃希氏菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属(Yershinia)、泛菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属。adhE基因的来源的具体实例包括细菌菌株，如大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudo tuberculosis) > Pantoea ananatis、 植物乳杆菌和乳酸乳球菌。已经阐明了编码大肠杆菌醇脱氢酶的野生型adhE基因(与GenBank登录号NC_000913.2，g1:49175990的序列中编号1294669-1297344互补的核苷酸号)。adhE基因位于大肠杆菌K-12染色体上的ychG和ychE ORF之间。也已经阐明编码醇脱氢酶的其它adhE基因:来自胡萝卜软腐欧文氏菌的adhE基因(GenBank登录号NC_004547.2; g1:50121254的序列中的核苷酸号2634501-2637176);来自肠沙门氏菌的adhE基因(GenBank登录号NC_004631.1; g1:29142095的序列中的核苷酸号1718612-1721290);来自鼠伤寒沙门氏菌的adhE基因(GenBank登录号U68173.1 ;g1:1519723的序列中的核苷酸号1-2637);来自弗氏志贺氏菌的adhE基因(与GenBank登录号NC_004741.1; g1: 30062760的序列中的核苷酸号1290816-1293491互补的核苷酸号)；来自假结核耶尔森氏菌的adhE基因(与GenBank登录号NC_006155.1; g1: 51596429的序列中的核苷酸号2478099-2480774互补的核苷酸号);来自Pantoea ananatis的adhE基因(SEQ ID NO:29);来自植物乳杆菌的adhE基因(UniProtKB Entry: Q88RY9_LACPL);来自乳酸乳球菌 MG1363 的 adhE 基因(EMBL 登录号AJ001007);等等(见图2)。来自大肠杆菌的adhE基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:1表示。由这种adhE基因编码的氨基酸序列由SEQ ID N0:2表示。[0063]因此，能够使用基于来自大肠杆菌染色体的基因的已知核苷酸序列制备的引物通过 PCR(聚合酶链式反应；参见 White, T.J.等.，Trends Genet.，5，185 (1989))获得 adhE基因。编码来自其它微生物的醇脱氢酶的基因能够以类似的方式获得。[0064]用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自大肠杆菌的adhE基因的示例:[0065](A)具有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0066](B) SEQ ID NO: 2中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0067]用编码以下的蛋白质(A)或⑶的DNA作为源自Pantoea ananatis的adhE基因的示例:[0068](A)具有SEQ ID NO:30中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0069](B) SEQ ID NO: 30中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0070]用编码以下的蛋白质(A)或(B)的DNA作为源自弗氏志贺氏菌的adhE基因的示例:[0071](A)具有SEQ ID NO:53中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0072](B)SEQ ID NO: 53中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0073]用编码以下的蛋白质㈧或(B)的DNA作为源自鼠疫耶尔森氏菌的adhE基因的示例:[0074](A)具有SEQ ID NO:54中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0075](B) SEQ ID N0:54中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0076]用编码以下的蛋白质㈧或⑶的DNA作为源自胡萝卜软腐欧文氏菌的adhE基因的示例:[0077](A)具有SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0078](B)SEQ ID NO: 55中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0079]用编码以下 的蛋白质(A)或⑶的DNA作为源自鼠伤寒沙门氏菌的adhE基因的示例:[0080](A)具有SEQ ID NO:56中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0081](B)SEQ ID NO: 56中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0082]用编码以下的蛋白质㈧或⑶的DNA作为源自植物乳杆菌的adhE基因的示例:[0083](A)具有SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0084](B)SEQ ID NO: 57中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0085]用编码以下的蛋白质(A)或⑶的DNA作为源自乳酸乳球菌的adhE基因的示例:[0086](A)具有SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列的蛋白质；或[0087](B)SEQ ID NO: 58中所示氨基酸序列的变体蛋白，该变体蛋白具有醇脱氢酶活性。[0088]短语“变体蛋白”如用于本发明中意思是序列中具有变化的蛋白质，无论这些变化是氨基酸的缺失、插入、添加或取代，但是所述蛋白质仍保留可用水平的醇脱氢酶活性。变体蛋白中变化的数量依赖于蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。相对于蛋白质(A)而言，变化的数量可为1-30，优选1-15，和更优选1-5。变体中的这些变化是保留蛋白质功能的保守突变。换句话说，这些变化可以发生在对于蛋白质功能而言非关键性的蛋白质区域中。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性，所以这样的变化不影响三维结构或活性。因此，只要保持醇脱氢酶活性，蛋白质变体(B)可以是一种与SEQ ID N0.2中所示醇脱氢酶的完整氨基酸序列具有不少于70%,优选不少于80%,更优选不少于90%,并最优选不少于95%同一性的蛋白质变体。[0089]两个氨基酸序列之间的同源性能够使用公知的方法来测定，例如，计算以下三种参数的计算机程序BLAST2.0:得分、同一性和相似性。[0090]一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加应为保守突变，从而保持活性。代表性保守突变是保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gin、His或Lys 取代 Arg,用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn,用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp,用 Ser 或Ala 取代 Cys,用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln,用 Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu,用 Pro 取代 Gly,用 Asn、Lys> Gin、Arg 或 Tyr 取代 His,用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 He,用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu,用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys,用 lie、Leu、Val或 Phe 取代 Met,用 Trp> Tyr> Met、Ile 或 Leu 取代 Phe,用 Thr 或 Ala 取代 Ser,用 Ser 或Ala取代Thr,用Phe或Tyr取代Trp,用His、Phe或Trp取代Tyr,和用Met、Ile或Leu取代 Val。[0091]对来自大肠杆菌、弗氏志贺氏菌、Pantoea ananatis、鼠疫耶尔森氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(革兰氏阴性细菌)和植物乳杆菌、乳酸乳球菌(革兰氏阳性细菌)的醇脱氢酶的基本序列(primary sequence)进行比较的数据显示这些蛋白之间高水平的同源性(参见图2)。从这个观点，取代或缺失在全部上述蛋白中都相同的氨基酸残基(用星号标记)对于这些蛋白质的功能可能是重要的。用相似的氨基酸残基替代相似的(用冒号标记的)氨基酸残基而无损于蛋白质活性是可能的。但是对其它非保守氨基酸残基的修饰可能不导致醇脱氢酶活性的改变。[0092]可以获得编码与上述醇脱氢酶基本上相同的蛋白质的DNA，例如，通过修饰编码醇脱氢酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，例如通过定点诱变的方式，从而缺失、取代、插入或添加负责特定位点的一个或多个氨基酸残基的核苷酸序列。如上所述修饰的DNA可以通过常规已知的突变处理获得。 这些处理包括以羟胺处理编码本发明的蛋白质的DNA，或用UV照射或试剂如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理含有所述DNA的细菌。[0093]编码与醇脱氢酶基本上相同的蛋白质的DNA可通过在适当的细胞中表达具有如上所述突变的DNA并研究任何表达产物的活性来获得。编码与醇脱氢酶基本上相同的蛋白质的DNA也可以通过如下获得:分离能够在严紧条件下与探针杂交并且编码具有醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA,所述探针具有核苷酸序列，该序列包含例如如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本文所提及的“严紧条件”是这样的条件，在该条件下形成所谓的特异性杂合体，并且不形成非特异性杂合体。例如，可以以一些条件作为严紧条件的示例，在所述这些条件下，具有高同源性的DNA，例如具有不低于50%，优选不低于60%，更优选不低于70%，还更优选不低于80%，进一步优选不低于90%，最优选不低于95%的同源性的DNA能够相互杂交；但是具有低于上述同源性的DNA不能相互杂交。可选地，可以以一些条件作为严紧条件的示例，在所述这些条件下，DNA能够在下述盐浓度下杂交，该盐浓度等同于Southern杂交中通常的洗涤条件，即lxSSC，0.1%SDS，优选0.lxSSC,0.1%SDS，在60°C。洗涤的持续时间依赖于用于印迹的膜的类型，并且通常由制造商推荐。例如，在严紧条件下对于Hybond N+尼龙膜(Amersham)推荐的洗涤持续时间是I 5分钟。优选地，可以进行2至3次洗涤。[0094]也可以将SEQ ID NO:1的核苷酸序列的部分序列用作探针。可以使用基于SEQ IDNO:1的核苷酸序列的引物，并使用含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA片段作为模板通过PCR制备探针。当使用长度约300 bp的DNA片段作为探针时，用于洗涤的杂交条件包括，例如，50。C，2xSSC 和 0.1%SDSο[0095]如上所述的核苷酸的取代、缺失、插入或添加也包括天然存在的突变(突变体或变体)，例如，由于细菌的种或者属的多样性而天然存在的突变，并且所述细菌含有醇脱氢酶(,and which contains alcohol dehydrogenase)。[0096]野生型醇脱氢酶可能受到金属催化的氧化。尽管可以使用这样的野生型醇脱氢酶，但是对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶在本发明中是优选的。短语“对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶”的意思是在有氧条件下保持其活性的突变醇脱氢酶，或与野生型醇脱氢酶相比活性降低的量可忽略的突变醇脱氢酶。[0097]在大肠杆菌adhE基因的情况下，野生型醇脱氢酶包含SEQ ID NO: 2中所列的氨基酸序列。SEQ ID N0:2的醇脱氢酶中导致该蛋白质对有氧失活有抗性的突变的实例是用赖氨酸残基替代位置568处的谷氨酸残基。然而，向adhE基因中引入突变(例如在SEQ IDNO: 2中的位置568处)可能导致在含有乙醇作为碳源的液体培养基中的生长延缓，在这样的情况下，优选的是突变醇脱氢酶具有能够改进细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长的至少一个额外突变。例如，当用另一种氨基酸残基替代SEQ ID N0:2的醇脱氢酶中位置568处的谷氨酸残基时，通过引入选自下组的额外突变，改进了大肠杆菌的生长:[0098]A)用另一种氨基酸残基，例如赖氨酸残基，替代SEQ ID NO: 2中在位置560的谷氨酸残基；[0099]B)用另一种氨基酸残基，例如缬氨酸残基，替代SEQ ID NO: 2中在位置560的谷氨酸残基；[0100]C)用其它氨基酸残基，例如分别用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基，替代SEQ ID勵:2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、 异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和[0101]D)以上各项的组合。[0102]涉及的序列中的位置号，例如，短语“在位置22、236、554、560、566和786的氨基酸残基”是指在来自大肠杆菌的野生型AdhE的氨基酸序列中这些残基的位置。然而，氨基酸残基的位置可能变化。例如，如果在N-末端部分插入一个氨基酸残基，那么原本位于位置22的氨基酸残基则变成在位置23。在这样的情况下，在原位置22的氨基酸残基是本发明的在位置22的氨基酸残基。[0103]突变AdhE可以在除上面A)-C)中确定的位置之外的一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，条件是不丧失或降低AdhE活性。[0104]根据本发明的突变AdhE和突变adhE基因能够从野生型adhE基因获得，例如，通过使用常规方法的位点特异性诱变，所述常规方法如PCR (聚合酶链式反应，参见White，T.J.等.，Trends Genet.，5，185(1989)),其利用基于所述基因的核苷酸序列制备的引物。[0105]野生型大肠杆菌中adhE基因的转录仅在厌氧条件下被诱导，主要是响应于还原的 NADH 水平提高(Leonardo, M.R., Cunningham, P.R.&Clark, D.P., J.Bacteriol.175870-878(1993))。[0106]在本发明中，修饰用于产生L-氨基酸的细菌菌株，从而使adhE基因的表达由非天然启动子调控，即，在野生型菌株中不调控adhE基因表达的启动子。这样的修饰可以通过用在有氧培养条件下有功能的非天然启动子替代染色体上adhE基因的天然启动子从而使adhE基因与该非天然启动子可操作地连接来实现。作为在有氧培养条件下有功能的非天然启动子，可以使用在有氧培养条件下能够使adhE基因的表达在特定水平之上的任何启动子。关于本发明中AdhE蛋白的水平，根据Clark和Cronan(J.Bacteriol.141177-183(1980))的方法测量的无细胞提取物中醇脱氢酶的活性应为每mg蛋白质1.5个单位或更多，优选5个单位或更多，并且更优选10个单位或更多。有氧培养条件可以是那些通常用于培养细菌的条件，其中通过如振摇、通气和搅拌等方法来提供氧气。具体而言，可以使用已知在有氧培养条件下表达基因的任何启动子。例如，可以使用糖酵解(glycosis)、磷酸戊糖途径、TCA循环、氨基酸生物合成途径等中涉及的基因的启动子。此夕卜，λ噬菌体的Pta。启动子、Iac启动子、trp启动子、trc启动子、Pk或Plj启动子全部已知为在有氧培养条件下有功能的强启动子，并且是优选使用的。[0107]可以将非天然启动子的使用与基因拷贝的倍增(multiplication)组合。例如，将与非天然启动子可操作地连接的adhE基因插入能够在肠杆菌科细菌中发挥功能的载体，并将该载体引入细菌，这使得细胞中所述基因的拷贝数增加。优选地，使用低拷贝载体。低拷贝载体的实例包括，但不限于，PSC101、P丽118、P丽119等。术语“低拷贝载体”用于拷贝数为多至5个拷贝每细胞的载体。增加adhE基因的拷贝数也可以通过如下来实现:通过例如同源重组、Mu整合等将该基因的多个拷贝引入细菌的染色体DNA。同源重组使用以多个拷贝存在的序列作为染色体DNA上的靶来进行。在染色体DNA上具有多个拷贝的序列包括，但不限于，重复DNA，或存在于转座元件末端的反向重复序列。同样，如美国专利N0.5，595, 889中公开的，可以将adhE基因并入转座子，再使其转移以将该基因的多个拷贝引入染色体DNA。在这些情况下，可以将adhE基因置于在有氧培养条件下有功能的启动子的调控之下。可选地，可以通过例如向该启动子中引入突变以增加位于该启动子下游的基因的转录水平来增强启动子的作用。 另外，已知对于在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中的几个核苷酸的取代，特别是在起始密码子紧邻上游的序列中的几个核苷酸的取代，显著影响mRNA的可翻译性(translatability)。例如，依赖于起始密码子之前的三个核苷酸的性质，发现了 20倍范围的表达水平(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981 ；Hui 等，EMBO J.，3，623-629，1984)。之前，显示了 rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的_1位置的A对G的取代(A_for_Gsubstitution) (ABSTRACTS of17th International Congress of Biochemistry andMolecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the AmericanSocietyfor Biochemistry and Molecular Biology (第 17 届国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学学会1997年年会摘要)，San Francisco, CaliforniaAugust24-29, 1997, abstract N0.457)。因此,可以想到 rhtA23 突变增强 rhtA 基因表达,并因此增加对苏氨酸、高丝氨酸和转运到细胞外的一些其它物质的抗性。[0108]另外，还可以将核苷酸取代引入细菌染色体上adhE基因的启动子区，其产生更强的启动子功能。可以进行表达调控序列的改变，例如，使用温度敏感质粒按照与基因取代相同的方式进行，如国际专利公开W000/18935和日本专利申请公开号1-215280。[0109]在本发明中，“产生L-氨基酸的细菌”的意思是当在培养基中培养所述细菌时，具有产生L-氨基酸并将L-氨基酸分泌到培养基中的能力的细菌。可以通过培育来赋予或增强产生L-氨基酸的能力。本文使用的术语“产生L-氨基酸的细菌”也表示能够产生L-氨基酸并且引起L-氨基酸以大于该细菌(例如，大肠杆菌，如大肠杆菌K-12)的野生型或亲本菌株的量在培养基中积累的细菌，并且优选地表示能够在培养基中引起不少于0.5g/L，更优选不少于1.0g/L的量的目标L-氨基酸积累的细菌。术语“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸是特别优选的。[0110]肠杆菌科包括属于以下属的细菌:埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森氏菌属等。具体而言，可以使用根据NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information ;国家生物技术信息中心)数据库使用的分类学(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi id=91347)归类于肠杆菌科的那些。属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌是优选的。短语“属于埃希氏菌属的细菌”的意思是根据微生物领域的技术人员已知的分类法归类于埃希氏菌属的细菌。如在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括，但不限于大肠杆菌(E.coli)。[0111]对于能够用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌无具体限制，然而，例如，Neidhardt, F.C.等.(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Societyfor Microbiology, Washington D.C., 1208,表I)描述的细菌包括在本发明内。[0112]属于泛菌属的细菌的意思是根据微生物领域的技术人员已知的分类法归类于泛菌属的细菌。最近已经将成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的一些种基于16S rRNA的核苷酸序列分析等重新归类于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis (菠萝泛菌)、 斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等(Int.J.Syst.Bacteriol.，43，162-173(1993))。[0113]本发明的细菌包括这样的肠杆菌科的菌株，该菌株具有产生L-氨基酸的能力，并且已经经过修饰从而使编码醇脱氢酶的基因在启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能。此外，本发明的细菌包括这样的肠杆菌科的菌株，该菌株具有产生L-氨基酸的能力，并且没有天然的醇脱氢酶活性，但是已经用编码醇脱氢酶的DNA片段转化。[0114]在本发明中，由于编码醇脱氢酶的基因在处于有氧培养条件下时有功能的启动子的控制下表达，所以在含有乙醇作为碳源的培养基中积累的L-氨基酸的量能够显著增加，所述L-氨基酸例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸。[0115]产生L-氨基酸的细菌[0116]作为被修饰而具有本发明的突变醇脱氢酶的本发明的细菌，可以使用能够产生芳族或非芳族L-氨基酸的细菌。[0117]可以通过将编码本发明的突变醇脱氢酶的基因引入天然具有产生L-氨基酸的能力的细菌来获得本发明的细菌。或者，可以通过将产生L-氨基酸的能力赋予已经具有突变醇脱氢酶的细菌来获得本发明的细菌。[0118]产生L-苏氨酸的细菌[0119]能够用于得到本发明产生L-苏氨酸的细菌的亲本菌株实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美国专利N0.5，175，107，美国专利 N0.5，705，371)、大肠杆菌 472T23/pYN7 (ATCC98081)(美国专利 N0.5，631，157)、大肠杆菌NRRL-21593 (美国专利N0.5，939，307)、大肠杆菌FERM BP-3756 (美国专利N0.5，474，918)、大肠杆菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美国专利 N0.5，376，538)、大肠杆菌 MG442 (Gusyatiner 等，Genetika (俄语)，14，947-956 (1978))、大肠杆菌 VL643 和VL2055 (EPl 149911A)等。[0120]菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，也是鹿糖同化性的(sucrose-assimilative),并且此菌株中的ilvA基因具有渗漏突变(leaky mutation)。这种菌株还在rhtA基因中具有突变，该突变赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996含有质粒PVIC40，其通过将包括突变thrA基因的thrA*BC操纵子插入由RSF1010衍生的载体而获得。这种突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其具有基本上脱敏的苏氨酸反馈抑制。菌株 B-3996(大肠杆菌(Escherichia coli) TJI Γ 6/pVIC40)于 1987 年 11 月 19 日以登录号 RIA1867 保藏在 All-Union Scientific Center of Antibiotics (全联盟抗生素科学中心)(Russia, 117105Moscow, Nagatinskaya Street3~A)。该菌株还于 1987 年 4 月 7 日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia, 117545Moscow, IDorozhny proezd,.1)。[0121]大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792B)也可以用作亲本菌株来得到本发明的产生L-苏氨酸的细菌。菌株B-5318相对于异亮氨酸是原养型的，温度敏感λ噬菌体Cl阻抑物和Pk启动子替代了该菌株含有的质粒PVIC40中的苏氨酸操纵子的调节区。菌株VKPMΒ-5318在1990年5月3日以登录号VKPM Β-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) ο[0122]优选地， 额外地修饰本发明的细菌以增强以下基因中一个或多个的表达:[0123]-突变thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I ;[0124]-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；[0125]-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；[0126]-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；[0127]_asd基因，其编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶；和[0128]-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；[0129]编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经阐明(GenBank登录号NC_000913.2，g1:49175990的核苷酸位置337-2799)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(GenBank 登录号 NC_000913.2，g1:49175990 的核苷酸位置 2801-3733)。thrB 基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(GenBank 登录号 NC_000913.2，g1:49175990 的核苷酸位置 3734-5020)。thrC 基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX开读框之间。所有三个基因起单一的苏氨酸操纵子的作用。为了增强苏氨酸操纵子的表达，理想的是将影响转录的弱化子区域从该操纵子中去除(W02005/049808、W02003/097839)。[0130]编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，连同thrB和thrC基因，能够作为一个操纵子从已知质粒pVIC40获得，该质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996中。质粒pVIC40在美国专利N0.5，705，371中详细描述。[0131]rhtA基因位于大肠杆菌染色体上的18分钟处，接近glnHPQ操纵子，glnHPQ操纵子编码谷氨酰胺转运系统的组分。rhtA基因与0RFl(ybiF基因，核苷酸位置764-1651，GenBank登录号AAA218541，g1:440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之间。已经将表达由ORFl编码的蛋白的DNA序列定名为rhtA基因(rht:对高丝氨酸和苏氨酸的抗性)。同样，已知rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子而言的位置-1处A对G的取代(ABSTRACTSof thel7th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology inconjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry andMolecular Biology (第17届国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学学会 1997 年年会摘要)，San Francisco, California August24_29, 1997, abstractN0.457，EP1013765A)。在下文中，将 rhtA23 突变标记为 rhtA*。[0132]大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸位置3572511-3571408，GenBank登录号NC_000913.l，g1:16131307),并且能够利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White, T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))获得。其它微生物的asd基因能够以相似的方式获得。[0133]同样，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸位置983742-984932，GenBank登录号NC_000913.l，g1:16128895),并且能够通过PCR获得。其它微生物的aspC基因能够以相似的方式获得。[0134]产生L-赖氨酸的细菌[0135]属于埃希 氏菌属的产生L-赖氨酸的细菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是当培养基中存在L-赖氨酸时,这种抑制全部或部分地脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括,但不限于,氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧厢酸(lysine hydroxamate)、S_ (2_氨基乙基)_L_半胱氨酸(AEC)、Y -甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺(a-chlorocaprolactam)等。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体能够通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规人工诱变处理来获得。可用于产生L-赖氨酸的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543, NRRL8-12185;参见美国专利如.4，346，170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，天冬氨酸激酶的L-赖氨酸反馈抑制是脱敏的。[0136]可以使用菌株WC196作为产生L-赖氨酸的大肠杆菌细菌。这种细菌菌株是通过将AEC抗性赋予源自大肠杆菌K-12的菌株W3110来培育的。将所得菌株命名为大肠杆菌AJ13069 (Escherichia coli AJ13069)，并且在1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术研究院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary),Tsukuba Central6, 1-1, Higashil-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，Japan),并且获得了登录号FERM P-14690。之后根据布达佩斯条约规定在1995年9月29日将其转为国际保藏，并且获得了登录号FERM BP-5252(美国专利N0.5，827，698)。[0137]能够用于得到本发明产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括这样的菌株，在这些菌株中将编码L-赖氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强。这些基因的实例包括，但不限于，编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因(dapA)、编码天冬氨酸激酶的基因(IysC)、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因(dapB)、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因(IysA)、编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因(ddh)(美国专利N0.6，040, 160)、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(PPC)、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因(asd)和编码天冬氨酸酶的基因(aspA) (EP1253195A)。另外，亲本菌株可以具有表达水平增加的涉及能效(energyefficiency)的基因(cyo) (EP1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利 N0.5，830，716)、ybjE 基因(W02005/073390)或它们的组合。[0138]用于得到本发明的产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括这样的菌株，其具有活性降低或消除的酶，该酶催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支(branch off)而产生L-赖氨酸之外化合物的反应。催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之外化合物的反应的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利N0.5，827，698)和苹果酸酶(malic enzyme) (W02005/010175)。[0139]产生L-赖氨酸的菌株的实例包括大肠杆菌WC196AcadAAldc/pCABD2 (W02006/078039)，这种菌株通过向菌株WC196中弓丨入质粒pCABD2 (其在美国专利N0.6，040, 160中公开)获得，菌株WC196具有破坏的编码赖氨酸脱羧酶的cadA和IdcC基因。质粒pCABD2含有:具有突变的编码二氢吡啶二羧酸合酶的大肠杆菌dapA基因，所述突变使L-赖氨酸反馈抑制脱敏；具有突变的编码天冬氨酸激酶III的大肠杆菌IysC基因，所述突变使L-赖氨酸的反馈抑制脱敏；编码二氢吡啶二羧酸还原酶的大肠杆菌dapB基因；和编码二氨基庚二酸脱氢酶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ddh基因。[0140]产生L-半胱氨酸的细菌[0141]能够用于得到本发明产生L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利N0.6，218，168，俄罗斯专利申请2003121601);使编码蛋白质的基因过表达的大肠杆菌W3110，所述蛋白质适于分泌对细胞有毒的物质(美国专利N0.5，972，663);半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2);由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物(positivetranscription regulator)活性增加的大肠杆菌 W3110 菌株(W00127307A1),等等。[0142]产生L-亮氨酸的细菌[0143]能够用于得到本发明产生L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美国专利N0.6，124，121))或对亮氨酸类似物(包括β _2_噻吩丙氨酸(β -2-thienylalanine)、3_轻基亮氨酸、4-氮杂亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸)有抗性的大肠杆菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A);通过遗传工程方法获得的大肠杆菌菌株如W096/06926中描述的那些；大肠杆菌H-9068 (JP8-70879A)，等等。[0144]可以通过增强L-亮氨酸生物合成中涉及的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。实例包括IeuABCD操纵子中的基因，这些基因优选的代表是突变IeuA基因，该基因编码不受L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(美国专利6，403，342)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。[0145]产生L-组氨酸的细菌[0146]能够用于得到本发明产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945, RU2003677);大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270, RU2119536);大肠杆菌 NRRL B-12116-B12121 (美国专利 N0.4，388，405)；大肠杆菌 H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美国专利 N0.6，344，347)；大肠杆菌 H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087);大肠杆菌 AI80/pFM201 (美国专利N0.6，258，554)等等。[0147]能够用于得到本发明产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，所述菌株中编码L-组氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强。这些基因的实例包括编码下述酶的基因=ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(phosphoribosyl formimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotideisomerase) (hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等。[0148]已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过将突变引入任何这些基因中以将对反馈抑制的抗性赋予由这些基因编码的酶，从而有效地增强产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利Nos.2003677和2119536)。[0149]具有产生L-组氨酸能力的菌株具体实例包括:大肠杆菌FERM P-5038和5048，其已经用携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体转化(JP 56-005099A);用rht (即氨基酸输出蛋白的基因)转化的大肠杆菌菌株(EP1016710A);赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素-抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利N0.2119536)，等等 ο[0150]产生L-谷氨酸的细菌[0151]能够用于得到本发明产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌VL334thrC+ (EPl 172433)。大肠杆菌VL334 (VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突变(美国专利N0.4，278，765)。利用生长于野生型大肠杆菌菌株K12 (VKPM B-7)细胞上的噬菌体P1，用常规转导来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了能够产生L-谷氨酸的L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。[0152]能够用于得到本发明产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，α -酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的菌株，或其中编码L-谷氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。这些基因的实例包括编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdh)、编码谷氨酰胺合成酶的基因(glnA)、编码谷氨酸合成酶的基因(gltAB)、编码异柠檬酸脱氢酶的基因(icdA)、编码乌头酸水合酶的基因(acnA、acnB)、编码朽1檬酸合酶(citrate synthase)的基因(gltA)、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(ppc)、编码丙酮酸脱氢酶的基因(aceEF、IpdA)、编码丙酮酸激酶的基因(pykA、pykF)、编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的基因(ppsA)、编码烯醇化酶的基因(eno)、编码磷酸甘油酸变位酶的基因(pgmA、pgml)、编码磷酸甘油酸激酶的基因(Pgk)、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因(gapA)、编码丙糖磷酸异构酶的基因(tpiA)、编码果糖二磷酸醛缩酶的基因(fbp)、编码磷酸果糖激酶的基因(pfkA，pfkB)、编码葡糖磷酸异构酶的基因(Pgi)等。[0153]经修饰以使朽1檬酸合成酶(citrate synthetase)基因和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的表达降低的，和/或α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的菌株的实例包括在ΕΡ1078989Α、ΕΡ955368Α 和 ΕΡ952221Α 中公开的那些菌株。[0154]用于得到本发明产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括将下述酶的活性减少或去除的菌株，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的除L-谷氨酸外的化合物的合成。这些酶的实例包括异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸转乙酰酶(Pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰轻酸合酶(acetohydorxy acid synthase) (ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰转移酶(Pfl)、乳酸脱氢酶(Idh)、和谷氨酸脱羧酶(gadAB)。在美国专利Nos.5，378，616和5，573，945中描述了 α -酮戊二酸脱氢酶活性缺失或降低的属于埃希氏菌属的细菌及获得它们的方法。具体地，这些菌株包括下面的:[0155]大肠杆菌W 31 IOsucA::KmE[0156]大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)[0157]大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)[0158]大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)[0159]通过破坏大肠杆菌W3110的α -酮戊二酸脱氢酶基因(在下文称为“sucA基因”)来获得大肠杆菌W3110suCA::KmK。该菌株完全缺失α-酮戊二酸脱氢酶活性。[0160]产生L-谷氨酸的细菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物具有抗性的细菌。这些菌株也可能是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，包括例如大肠杆菌AJ13199 (FERMBP-5807)(美国专利N0.5.908, 768)，额外具有低L-谷氨酸分解能力的 FERM P-12379 菌株(美国专利 N0.5，393，671) ；AJ13138 (FERM BP-5565)(美国专利N0.6，110，714)，等等。[0161]产生L-谷氨酸的细菌的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于泛菌属(genus Pantoea)的突变菌株，并且可以如上所述获得。这些菌株包括 Pantoea ananatis AJ13356 (美国专利 N0.6，331，419)。Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Central6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，Japan)，登录号为 FERM P-16645。其后按照布达佩斯条约的规定，在1999年I月11日将其转为国际保藏，并得到登录号FERM BP-6615。作为破坏ct KGDH-EI亚基基因(sucA)的结果，Pantoea ananatis AJ13356的丽戍二酸脱氢酶活性缺失。当将上述菌株分离时将其鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌AJ13356保藏。但是，近来基于对16SrRNA的核苷酸测序等，将其重新归类为Pantoeaananatis。尽管AJ13356作为成团肠杆菌保藏在前述保藏单位，就本说明书而言，将它们描述为 Pantoea ananatis。[0162]产生L-苯丙氨酸的细菌[0163]能够用于得到本发明产生L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌4112739&7^::1'111037成)(￥1^1 B-8197);具有突变pheA34基因的大肠杆菌HW1089 (ATCC55371)(美国专利N0.5，354，672);大肠杆菌 MWEClOl-b(KR8903681);大肠杆菌 NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146 和NRRL B-12147 (美国专利 N0.4，407，952)。同样地，可使用大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)，大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12 [W3110 (tyrA) /pPHATerm] (FERM BP-12662)和命名为 AJ12604 (FERM BP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB]作为亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-苯丙氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请 2003/0148473A1 和 2003/0157667 Al)。[0164]产生L-色氨酸的细菌[0165]能够用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌JP4735/pMU 3028(DSM10122)和JP6015/PMU 91(DSM10123)，其由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷(美国专利N0.5，756，345);大肠杆菌SV164 (pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制性的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6，180, 373);色氨酸酶缺陷的大肠杆菌 AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美国专利N0.4，371，614);产生磷酸烯醇丙酮酸的能力增强的大肠杆菌AGX17/pGX50, pACKG4-pps (W09708333,美国专利 N0.6，319，696)等等。还可以使用由 yedA 或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-色氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请2003/0148473A1和 2003/0157667A1)。[0166] 能够用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括其中以下酶中一种或多种的活性增强的菌株:邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者均受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制脱敏的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164和通过将质粒pGH5引入大肠杆菌SV164获得的转化菌株(W094/08031)，所述质粒pGH5包含编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。
能够用于得到本发明产生L-色氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括已经用色氨酸操纵子转化的菌株，所述色氨酸操纵子包含编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP57-71397A、JP62-244382A、美国专利N0.4，371，614)。此外，可以通过增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，其分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进产生L-色氨酸的能力(W02005/103275)。
产生L-脯氨酸的细菌
能够用于得到本发明产生L-脯氨酸的细菌的亲本菌株实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如ilvA基因缺陷并且能够产生L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPMB-8012) (EPl 172433).可以通过增强L-脯氨酸生物合成中涉及的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括编码对L-脯氨酸反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利3127361)。此外，可以通过增强一个或多个编码负责从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的例子是b2682和b2683基因(ygaZH 基因)(EP1239041A2)。
具有产生L-脯氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括下列大肠杆菌菌株:NRRL B-12403 和 NRRL B-12404 (英国专利 2075056)，VKPM B-8012 (俄罗斯专利申请2000124295)，德国专利3127361中描述的质粒突变体，Bloom F.R.等描述的质粒突变体(The15th Miami winter symposium(第15界迈阿密冬季研讨会)，1983，第34页)等等。
产生L-精氨酸的细菌
能够用于得到本发明产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请 N0.2001112869)，大肠杆菌 382 菌株(VKPM B-7926) (EPl 170358A1)，用编码 N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因转化的产生精氨酸的菌株(EP1170361A1)，等等。
能够用于得到本发明产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括编码L-精氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。这些基因的实例包括编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶的基因(argC)、编码鸟氨酸乙酰转移酶的基因(argj)、编码N-乙酰谷氨酸激酶的基因(argB)、编码乙酰鸟氨酸转氨酶的基因(argD)、编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因(argF)、编码精氨琥珀酸合成酶的基因(argG)、编码精氨琥珀酸裂合酶的基因(argH)、编码氨甲酰基磷酸合成酶的基因(carAB)等。
产生L-缬氨酸的细菌
能够用于得到本发明 的产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，经修饰以过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利N0.5，998，178)。理想的是将负责衰减的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使产生的L-缬氨酸不会削弱该操纵子的表达。此外，理想的是将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。
能够用于得到本发明的产生L -缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括氨酰t-RNA合成酶的突变体(美国专利N0.5，658，766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (Russia, 117545Moscow, IDorozhnyProezd, I)，登录号为 VKPM B-4411。
此外,还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变体和/或缺乏H+-ATP酶的突变体作为亲本菌株(W096/06926)。
产生L-异亮氨酸的细菌
能够用于得到本发明产生L-异亮氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，对6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(JP5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧I亏酸具有抗性的突变体，以及额外对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变体(JP5-130882A)。此外，还可以使用以编码L-异亮氨酸生物合成中涉及的蛋白(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因转化的重组菌株(JP2-458 A, FR0356739和美国专利N0.5，998，178)作为亲本菌株。
用于产生本发明的L-氨基酸的方法包括以下步骤:在培养基中培养本发明的细菌，使L-氨基酸能够在培养基中积累，和从培养基中收集L-氨基酸。此外，本发明的方法包括用于产生L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸的方法，包括以下步骤:在培养基中培养本发明的细菌，使L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸能够在培养基中积累，和从培养基中收集L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸或L-亮氨酸。
在本发明中，从培养基培养、收集和纯化L-氨基酸等可通过常规发酵方法进行，其中使用细菌来产生L-氨基酸。
培养基可以是合成的或天然的，只要该培养基包括碳源、氮源、矿质，如有必要，还包括细菌生长所需的适量营养物。碳源可以包括多种糖，例如葡萄糖和蔗糖，多种有机酸和醇，如乙醇。根据本发明，可以使用乙醇作为唯一碳源或者与糖(如葡萄糖和蔗糖)混合。作为氮源，可以使用多种铵盐如氨水和硫酸铵，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆-水解物和消化的发酵微生物。作为矿质，可以使用磷酸氢二钾(potassiummonophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等等。作为维生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等等。如有必要，可以向培养基添加额外的营养物。例如，如果细菌生长需要L-氨基酸(L-氨基酸营养缺陷型(L-amino acid auxotrophy)),可以向培养基添加足够量的L-氨基酸。
培养优选在有氧条件下进行，如摇动培养和带有通气的搅拌培养，温度为20-40° C，优选30-38° C。培养物的pH通常为5_9，优选6.5-7.2。可以用氨水、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲剂调节培养物的pH。通常1-5天的培养导致目标氨基酸在液体培养基中的积累。
培养之后，可以通过离心或膜过滤将固体如细胞从液体培养基去除，然后可以收集目标L-氨基酸并通过离子交换、浓缩和/或结晶方法纯化。
附图简述
图1显示大肠杆菌染色体中adhE基因上游区的结构，以及含有cat基因和P^tac启动子的整合DNA片段的结构。
图2显示来自以下菌种的醇脱氢酶的原始序列的比对:大肠杆菌(ADHE_ECOLI, SEQ ID NO:2),弗氏志贺氏菌(Q83RN2_SHIFL, SEQ ID NO:53)、Pantoeaananatis(ADHE PANAN, SEQ ID NO: 30)、鼠疫耶尔森氏菌(Q66AM7_YERPS, SEQ ID NO: 54)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Q6D4R4_ERWCT，SEQ ID NO: 55)、鼠伤寒沙门氏菌(P74880_SALTY, SEQID NO: 56)、植物乳杆菌(Q88RY9_LACPL, SEQ ID NO:57)和乳酸乳球菌(086282_9LACT，SEQID NO: 58)。所述比对使用PIR多重比对程序来进行(http://pir.georgetown.edu)。用星号(*)标记相同的氨基酸，用冒号(:)标记相似的氨基酸。
图3显示在含有乙醇(2%或3%)作为唯一碳源的M9基本培养基上生长的修饰菌株的生长曲线。
图4显示在含有葡萄糖(0.1重量％)和乙醇(0.1体积％)的混合物的M9基本培养基上生长的修饰菌株的生长曲线。
图5显示具有在天然启动子或P1^ta。启动子调控下的突变adhE*基因的菌株在含有乙醇(2%或3%)作为唯一碳源的M9基本培养基上生长的生长曲线的比较。
实施例
将参考以下非限定性实施例对本发明进行更具体的阐释。
实施例1.制备大肠杆菌MG1655 Δ tdh, rhtA*
通过如下构建产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG1655Atdh，rhtA*(pVIC40):使用cat基因将大肠杆菌MG1655(ATCC700926)中编码苏氨酸脱氢酶的天然tdh基因失活，其后引入rhtA23突变(rhtA*)，该突变赋予对高浓度的苏氨酸(>40mg/ml)和高丝氨酸(>5mg/ml)的抗性。然后用来自大肠杆菌VKPM B-3996的质粒pVIC40转化所得菌株。质粒pVIC40在美国专利N0.5，705, 371中详细描述。
为了替代天然的 tdh 基因，用 Datsenko K.A.和 Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97，6640-6645)所述的也称为 “Red 介导的整合(Red-mediatedintegration) ”和/或“Red-驱动的整合(Red-driven integration) ”的方法，将携带由 cat基因编码的氯霉素抗性标记(CmK)的DNA片段整合到大肠杆菌MG1655的染色体中以替代天然基因。使用具有热敏感的复制子的重组质粒pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, 97，6640-6645)作为负责Red-介导的重组体系的由噬菌体λ得到的基因的供体。含有重组质粒PKD46的大肠杆菌BW25113可以从Ε.coli Genetic StockCenter, Yale University, New Haven, USA 获得，其登录号为 CGSC7630。
使用商业上可获得的质粒pACYC184(GenBank/EMBL登录号X06403, “Fermentas”，Lithuania)作为模板，以及引物 Pl (SEQ ID NO: 3)和 P2 (SEQ IDNO:4)通过PCR获得了含有由cat基因编码的CmK标记的DNA片段。引物Pl含有引入到该引物中的与tdh基因5’-区同源的35个核苷酸用于进一步整合到细菌染色体中。引物P2含有引入到该引物中的与tdh基因3’ -区同源的32个核苷酸用于进一步整合到细菌染色体中。
使用“Gene Amp PCR System2700” 扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50 μ I)组成为5 μ I含25mM MgCl2的IOx PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、每种 dNTP200 μ M、每种所用的引物 25pmol 和 IU Taq 聚合酶(“Fermentas” , Lithuania)。向所述反应混合物加入约5ng质粒DNA作为PCR扩增用的模板DNA。温度曲线设定如下:在95° C初始DNA变性5分钟，其后是25个循环的95° C变性30秒、55° C退火30秒、72° C延伸40秒，和在72° C最终延伸5分钟。然后将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化,使用“GenElute Spin Columns (GenElute自旋柱)”(Sigma, USA)提取,并用乙醇沉淀。
将获得的DNA片段用于电穿孔和Red介导整合入大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。
将MG1655/pKD46细胞在含有氨苄青霉素(100 μ g/ml)的液体LB培养基中在30° C培养过夜，然后用含有氨苄青霉素(100μ g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)(使用阿拉伯糖来诱导含有Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l ；NaC10.5g/l ；胰蛋白胨20g/l ；KC12.5mM ；MgCl210mM)以1: 100稀释，并且在30° C培养至细菌培养物的光密度达到0D_=0.4-0.7。将来自IOml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100 μ I水中悬浮。向该细胞悬液添加10 μ I溶解在去离子水中的DNA片段(IOOng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA) (N0.165-2098，2-89型)根据制造商的说明书进行电穿孔。将经过电击的细胞(shocked cell)添加至Iml SOC培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition(《分子克隆实验手册第二版》)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)),在 37° C温育 2 小时，然后涂布到含有25 μ g/ml氯霉素的L-琼脂上。使用引物P3(SEQ ID NO:5)和P4(SEQ ID NO:6)通过PCR检测生长了 24小时的菌落中取代天然tdh基因CmK标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20 μ I水中，其后使用I μ I所得悬液进行PCR。温度曲线设定如下:在95° C初始DNA变性5分钟；其后是30个循环的95° C变性30秒、55° C退火30秒和72° C延伸40秒；以及在72° C最终延伸5分钟。少数经检测的CmK菌落含有期望的1104bp DNA片段，其确认了取代tdh基因的1242bp片段的CmK标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37° C培养消除了热敏质粒pKD46，并且将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Δ tdh。
然后，将来自菌株VL614rhtA23 (Livshits VA.等，2003，Res.Microbiol.，154:123-135)的 rhtA23 突变引入获得的菌株 MG1655 Λ tdh，产生菌株 MG1655Δ tdh, rhtAtrhtAZS是一种赋予对高浓度的苏氨酸(>40mg/ml)和高丝氨酸(>5 mg/ml)的抗性的突变。为此用生长在供体菌株VL614rhtA23上的噬菌体Ρ1_感染菌株MG1655Atdh。在含有8mg/ml高丝氨酸和0.4%作为唯一碳源的葡萄糖的M9基本培养基上选择转导体。
实施例2.构建大肠杆菌MG1655:: PL_tacadhE
通过用Puae启动子替代菌株MG1655中adhE基因的天然启动子区获得了大肠杆菌 MG1655::PL_tacadh。
为了替代adhE基因的天然启动子区， 通过Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97，6640-6645)描述的也称为 “Red-介导的整合”和 / 或“Red-驱动的整合”的方法，将携带I/_ta。启动子和由cat基因编码的氯霉素抗性标记(CmK)的DNA片段整合到了大肠杆菌MG1655的染色体中来取代天然启动子区。
使用大肠杆菌MG1655PL_taexylE (W02006/043730)的染色体DNA作为模板通过PCR获得了含有IVta。启动子和cat基因的片段。I/_ta。启动子的核苷酸序列在序列表中提供(SEQID NO: 7) ο 使用引物 P5(SEQ ID NO: 8)和 P6 (SEQ ID NO: 9)用于 PCR 扩增。引物 P5 含有引入到该引物中的与位于adhE基因起始密码子上游318bp的区域互补的40个核苷酸，用于进一步整合到细菌染色体中；引物P6含有与adhE基因的5’-序列相同的39个核苷酸。
使用“Gene Amp PCR System2700” 扩增设备(Applied Biosystems)来提供PCR。反应混合物(总体积50 μ I)组成为5 μ I含15mM MgCl2的IOx PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、每种 dNTP200 μ Μ、每种所用的引物 25pmol 和 IU Taq 聚合酶(“Fermentas”, Lithuania)。向所述反应混合物加入约20ng大肠杆菌MG1655PL_tac;xylE基因组DNA作为PCR的模板。
温度曲线如下:在95° C初始DNA变性5分钟，其后是35个循环的95° C变性30秒、54° C退火30秒、72° C延伸1.5分钟，和在72° C最终延伸5分钟。然后将扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化,使用“GenElute SpinCoIumns^ (Sigma, USA)提取,并用乙醇沉淀。将获得的DNA片段用于电穿孔和Red介导的整合入大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。
将MG1655/pKD46细胞在含有氨苄青霉素(100 μ g/ml)的液体LB培养基中在30° C培养过夜，然后用含有氨苄青霉素(100 μ g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)(使用阿拉伯糖来诱导编码Red系统的基因的质粒)的SOB培养基(酵母提取物5g/l ；NaC10.5g/l ；胰蛋白胨20g/l ；KC12.5mM ；MgCl210mM)以1:100稀释，并且在30° C培养以达到细菌培养物的光密度OD6tltl=0.4-0.7。将来自IOml该细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水洗涤3次，其后在100 μ I水中悬浮。向该细胞悬液添加10 μ I溶解在去离子水中的DNA片段(IOOng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA) (N0.165-2098,2-89型)根据制造商的说明书进行了电穿孔。
将经过电击的细胞添加至Iml SOC培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning ALaboratory Manual, Second Edition”(《分子克隆实验手册第二版》)，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989))，在37° C温育2小时，然后涂布到含有25 μ g/ml氯霉素的L-琼月旨上。
将约100个所得克隆在含有2%乙醇作为唯一碳源的M9平板上进行选择。选取了在36小时中在含有2%乙醇的M9平板上生长的一些克隆，并使用引物P7 (SEQ ID NO: 10)和P8(SEQ ID NO: 11)通过PCR检测这些克隆中取代adhE基因天然启动子区的CmK标记的存在。为此，将新鲜分离的菌落悬浮在20μ I水中，然后将1μ I所得悬液用于PCR。温度曲线如下:在95° C初始DNA变性10分钟；其后是30个循环的95° C变性30秒、54° C退火30秒和72° C延伸1.5分钟；在72° C最终延伸I分钟。少数经检测的CmK菌落含有期望的 1800bp DNA片段，这证实了取代adhE基因的520bp天然启动子区的CmK标记DNA的存在。获得的菌株之一通过在37° C的 培养消除了热敏质粒pKD46，并将所得的菌株命名为大肠杆菌MG1655::PL_taeadhE(参见图1)。[0209]实施例3.构建大肠杆菌 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE
通过将来自菌株MG1655::PL_taeadhE的P^ae启动子转导至菌株MG1655 Δ tdh, rhtA* 中获得了大肠杆菌 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE0
用生长在供体菌株MG1655::PL_tacadhE上的噬菌体Plvi,感染菌株MG1655 Δ tdh, rhtA*,获得了菌株 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE0 检查这种菌株在含有 2%乙醇作为唯一碳源的M9平板上的生长。生长速率与菌株MG1655::PL_tacadhE的生长速率相同。
实施例4.增加adhE基因表达对L-苏氨酸产生的影响
为了评估增强adhE基因的表达对L-苏氨酸产生的影响,用质粒pVIC40转化了两种大肠杆菌菌株 MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE 和 MG1655 Δ tdh, rhtA*。
将菌株MG1655 Δ tdh, rhtA*, PL_tacadhE (pVIC40)和亲本菌株MG1655 Δ tdh, rhtA* (pVIC40)各自在营养培养液(nutrient broth)中在 37。C 培养 18 小时，将获得的每种培养物的0.3ml接种到20x200mm试管中具有以下组成的3ml发酵培养基中，并且用旋转摇床在34° C培养48小时。表I和2显示来自至少10次独立实验的数据。
发酵培养基组成(g/Ι):
权利要求
1.一种用于产生L-氨基酸的方法，其包括: A)在含有乙醇的培养基中培养具有醇脱氢酶的肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，和 B)从培养基中分离L-氨基酸， 其中编码所述醇脱氢酶的基因在非天然启动子的调控下表达，所述启动子在有氧培养条件下有功能，并且 其中所述产生L-氨基酸的细菌是大肠杆菌或Pantoea ananatis。
2.根据权利要求
1的方法，其中所述非天然启动子选自下组:Pta。、Pla。、Ptrp>Ptrc>匕和PL。
3.根据权利要求
1或2的方法，其中所述醇脱氢酶对有氧失活有抗性。
4.根据权利要求
1-3中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶源于选自下组的细菌 大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、Pantoeaananatis、植物乳杆菌和乳酸乳球菌。
5.根据权利要求
1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQID N0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为不是天冬氨酸残基的另一种氨基酸残基。
6.根据权利要求
1-4中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶包含SEQID N0:2中所列的氨基酸序列，只是位置568的谷氨酸残基被替代为赖氨酸残基。
7.根据权利要求
5或6的方法，其中所述醇脱氢酶具有至少一个额外的突变，该突变能够改进所述细菌在含有乙醇作为唯一碳源的液体培养基中的生长。
8.根据权利要求
7的方法，其中所述额外的突变选自下组: A)用另一种氨基酸 残基替代SEQID NO:2中位置560的谷氨酸残基； B)用另一种氨基酸残基替代SEQID NO:2中位置566的苯丙氨酸残基； C)用其它氨基酸残基替代SEQID NO: 2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和 D)以上各项的组合。
9.根据权利要求
7的方法，其中所述额外的突变选自下组: A)用赖氨酸残基替代SEQID NO:2中位置560的谷氨酸残基； B)用缬氨酸残基替代SEQID NO:2中位置566的苯丙氨酸残基； C)用甘氨酸残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基和缬氨酸残基分别替代SEQID NO:2中分别在位置22、236、461、554和786的谷氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、异亮氨酸残基和丙氨酸残基；和 D)以上各项的组合。
10.根据权利要求
1-9中任一项的方法,其中所述产生L-氨基酸的细菌属于选自下组的属:埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和摩根氏菌属。
11.根据权利要求
1-10中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组:L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。
专利摘要
本发明涉及一种使用肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法，例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸或L-谷氨酸，其中已经对所述细菌进行了修饰以增强由adhE基因编码的野生型醇脱氢酶或对有氧失活有抗性的突变醇脱氢酶的活性。
文档编号C12P13/14GKCN103215319SQ201210557397
公开日2013年7月24日 申请日期2007年7月12日
发明者利奥尼德.R.普蒂特辛, 伊里纳.B.奥尔特曼, 韦罗妮卡.A.科特利亚罗瓦, 奥尔佳.N.莫科瓦, 塔蒂亚纳.A.亚姆波尔斯卡亚, 尤里.I.科兹洛夫, 寺下优, 臼田佳弘, 松井和彦 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan