用肠杆菌科的细菌产生l-氨基酸的方法

专利名称：用肠杆菌科的细菌产生l-氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵产生L-氨基酸的方法，更具体地涉及有助于此发酵的基因。 这些基因可用于改进L-氨基酸的生产，例如，L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生产。
背景技术：
传统上，利用由天然来源获得的微生物菌株或其突变体通过发酵方法工业化生产 L-氨基酸。通常，修饰所述微生物以提高L-氨基酸的产品收率(production yield)。已经报导了许多提高L-氨基酸产品收率的技术，包括用重组DNA转化微生物(参见，例如，美国专利4，278，76 。其它提高产品收率的技术包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对所得L-氨基酸的反馈抑制脱敏(desensitize)(参见，例如，WO 95/16042 或美国专利 4，346，170,5, 661，012 和 6，040，160)。用于通过发酵生产L-苏氨酸的菌株是已知的，包括涉及L-苏氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(美国专禾U 5，175，107,5,661,012,5, 705, 371和5，939，307 ；EP 0219027)、对化学品如L-苏氨酸及其类似物有抗性的菌株(W001/14525A1、EP 301572A2、 美国专利5，376，538)、具有对生产的L-氨基酸或其副产物的反馈抑制脱敏的目标酶的菌株(美国专利5，175，107和5，661，012)、以及具有失活的苏氨酸降解酶的菌株(美国专利 5，939，307 和 6，297，031)。目前，已知的生产苏氨酸的菌株VKPM B-3996(美国专利5，175，107和5，705，371) 是最好的已知的苏氨酸生产菌之一。为构建菌株VKPM B-3996，如下所述，将几个突变和质粒导入到亲本菌株大肠杆菌K-12(VKPM B-7)中。突变的thrA基因(突变thrA442)编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对苏氨酸的反馈抑制有抗性。突变的ilvA基因(突变 ilvA442)编码活性降低的苏氨酸脱氨酶，其导致异亮氨酸生物合成速率降低和异亮氨酸饥饿的渗漏表型。在包含ilvA442突变的细菌中，thrABC操纵子的转录不被异亮氨酸所抑制，因此对于苏氨酸生产是非常有效的。编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因的失活阻止苏氨酸降解。将蔗糖同化的遗传定子(genetic determinant) (scrKYABR基因)转移到所述菌株。 为增加控制苏氨酸生物合成的基因的表达，将包含突变的苏氨酸操纵子thrA442BC的质粒 PVIC40导入中间菌株TDH6中。在菌株发酵期间累积的L-苏氨酸的量能够多达85g/l。通过优化所需化合物的主要生物合成途径，借助于为细菌补充更大量的糖例如葡萄糖作为碳源，可以完成对L-氨基酸生产菌株的进一步改善。不考虑PTS的葡萄糖转运效率，在高产菌株中获取碳源仍然可能是不充足的。已知糖和其它代谢物向细菌细胞中的主动运输由几种转运系统完成。其中，来自大肠杆菌的XylE蛋白是D-木糖通透酶，大肠杆菌中两种系统的其中一个负责吸收D-木糖；另一个是ATP-依赖性ABC转运蛋白Xy 1FGH。已显示克隆的xylE基因在体内补充xylE 突变体(Davis, Ε. 0. and Henderson, P. J.，J. Biol. Chem.，262 (29) ； 13928-32 (1987)) 在整个细胞中XylE-介导的转运由质子载体(protonophore)所抑制，并引发碱性pH改变(Lam, V. Μ.等，J. Bacteriol. 143(1) ；396-402 (1980))。利用 xylE 和 xylF 突变体的试验已证实对于D-木糖，XylE蛋白具有63_169μΜ的KM(Sumiya.M.等，Receptors Channels, 3 (2) ； 117-28 (1995)) 0 XylE蛋白是转运蛋白主要促进剂超家族(major facilitator superfamily) (MFS)的成员(Griffith，J. K.等，Curr. Opin. Cell Biol. 4(4)； 684-95 (1992))，看起来作为D-木糖/质子同向转运蛋白(symporter)起作用。xylE基因可能构成单顺反子操纵子，其表达由D-木糖所诱导。输入的木糖在XylA(木糖异构酶)和 XylB(木酮糖激酶)酶的作用下异化为5-磷酸木酮糖。在合适的条件下，由xylA基因编码的木糖异构酶还有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的转化(Wovcha，Μ. G.等，Appl Environ Microbiol. 45(4) 1402-4 (1983))。然而，迄今还没有利用肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)的细菌增加L-氨基酸的生产的报导，所述肠杆菌科的细菌具有增强的D-木糖通透酶活性。

发明内容
本发明的目的是增加产生L-氨基酸的菌株的生产力，以及提供用这些菌株生产非芳族或芳族L-氨基酸的方法。通过发现增加编码D-木糖通透酶的xylE基因的表达能增强L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生产而实现了该目标。由此完成了本发明。本发明的目的是提供肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中所述细菌经改造以增强D-木糖通透酶的活性。本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述D-木糖通透酶的所述活性通过增加编码D-木糖通透酶的基因的表达而增强。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中通过修饰编码D-木糖通透酶的基因的表达控制序列以增强基因表达，或者通过增加编码D-木糖通透酶基因的拷贝数，而增强 D-木糖通透酶的所述活性。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强葡糖激酶的活性。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强木糖异构酶的活性。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌经修饰而增加了 xylABFGHR位点的表达。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌选自下组菌属埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、普罗威登斯菌属(ftOvidencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、和摩根氏菌属(Morganella)。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述基因编码选自下组的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白质；和(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶的活性。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述编码D-木糖通透酶的基因包含选自下组的DNA:(a)包含SEQ ID NO=I中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA ；和(b)在严紧条件下可与SEQ ID NO 1中核苷酸1_1476的核苷酸序列或由所述核苷酸序列制备的探针杂交，并且编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质的DNA。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述严紧条件包括其中在60°C在Ix SSC和0. SDS的盐浓度下洗涤15分钟的条件。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-苏氨酸的细菌。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了选自下组的基因的表达-编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I并对苏氨酸的反馈抑制有抗性的突变thrA 基因，-编码高丝氨酸激酶的thrB基因，-编码苏氨酸合酶的thrC基因，-编码推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意组合。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌经修饰增加了所述突变thrA 基因、所述thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表达。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-赖氨酸的细菌。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-组氨酸的细菌。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-苯丙氨酸的细菌。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-精氨酸的细菌。本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-谷氨酸的细菌。本发明的又一目的是提供产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌， 使L-氨基酸在培养基中积累，并从培养基分离L-氨基酸。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述培养基包含木糖。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-组氨酸。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。具体地，本发明还涉及如下各项1.肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中所述细菌已经过修饰增强了 D-木糖通透酶的活性。2.根据项1的细菌，其中所述D-木糖通透酶的活性通过增加编码D-木糖通透酶的基因的表达而增强。3.根据项1的细菌，其中通过修饰编码D-木糖通透酶的基因的表达控制序列，或者通过增加编码D-木糖通透酶基因的拷贝数而增强所述D-木糖通透酶的活性。4.根据项1的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了葡糖激酶的活性。5.根据项1的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了木糖异构酶的活性。6.根据项1的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增加了 xylABFGHR位点的表达。7.根据项1的细菌，其中所述细菌选自下组菌属埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、和摩根氏菌属。8.根据项2的细菌，其中所述基因编码选自下组的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白质；和(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶活性。9.根据项2的细菌，其中所述编码D-木糖通透酶的基因包含选自下组的DNA (a)包含SEQ ID NO 1中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA ；禾口(b)在严紧条件下可与SEQ ID NO 1中核苷酸1_1476的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列制备的探针杂交，并且编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质的DNA。10.根据项9的细菌，其中所述严紧条件包括其中在60°C在Ix SSC^PO. 1% SDS 的盐浓度下洗涤15分钟的条件。11.根据项1的细菌，其中所述细菌是产生L-苏氨酸的细菌。12.根据项11的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了选自下组的基因的表达-编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I并对苏氨酸的反馈抑制有抗性的突变thrA 基因，-编码高丝氨酸激酶的thrB基因，-编码苏氨酸合酶的thrC基因，-编码推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意组合。13.根据项12的细菌，其中所述细菌经修饰增强了所述突变的thrA基因、所述 thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表达。14.根据项1的细菌，其中所述细菌是产生L-赖氨酸的细菌。
15.根据项1的细菌，其中所述细菌是产生L-组氨酸的细菌。
16.根据项1的细菌，其中所述细菌是产生L-苯丙氨酸的细菌。
17.根据项1的细菌，其中所述细菌是产生L-精氨酸的细菌。
18.根据项1的细菌，其中所述细菌是产生L-谷氨酸的细菌。
19.生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养根据项1的细菌，使所述L
酸在培养基中积累，并从培养基分离L-氨基酸。 20.根据项19的方法，其中所述培养基含有木糖。
21.根据项19的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。22.根据项19的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。23.根据项19的方法，其中所述L-氨基酸是L-组氨酸。24.根据项19的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。25.根据项19的方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。26.根据项19的方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。


图1显示大肠杆菌染色体中xylE基因上游区域的结构，和包含cat基因和杂合 PL-tac启动子的整合DNA片段的结构。图2显示在含葡萄糖的培养基上生长的大肠杆菌菌株MG1655、 MG1655 Δ ptsHI-crr 和 MG1655PL_ta。xylE 的生长曲线。图例MG =大肠杆菌 MG1655 ；MG Apts =i;J ff^MG1655AptsHI-crr ；MG Apts P xylE =大肠杆菌 MG1655 Δ ptsHI-crr
PL-tacXylE°本发明的优选实施方案本发明中，“产生L-氨基酸的细菌”指当在培养基中培养所述细菌时，具有在培养基中生产和分泌L-氨基酸的能力的细菌。可以通过培育而赋予或增强L-氨基酸生产能力。如本文所用的术语“产生L-氨基酸的细菌”还指能够以大于大肠杆菌如大肠杆菌K-12 的野生型或亲本菌株的量生产并导致L-氨基酸在培养基中积累的细菌，优选指所述细菌能够导致在培养基中积累不少于0. 5g/L量的，更优选不小于1. Og/L的目标L-氨基酸。术语“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-缬氨酸。L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、和L-谷氨酸是特别优选的。肠杆菌科包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、 Photorhabdus、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森氏菌属(Yersinia)等的细菌。具体地，可以使用依据NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/ Taxonomy/wgetorg ？ mode = Tree&id = 1236&lvl = 3&keep = l&srchmode = l&unlock) 中所用分类法归类于肠杆菌科的那些。属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌是优选的。短语“属于埃希氏菌属的细菌”指依据微生物学领域的技术人员已知的分类法归类于埃希氏菌属的细菌。如用于本发明的属于埃希氏菌属的微生物的例子包括但不限于大肠杆菌(E. coli)。可用于本发明的属于埃希氏菌属细菌没有特别限制然而，例如Ne i dhardt， F. C.等描述的细菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium,American Society for Microbiology, Washington D. C.，1208，表 1)包括在本发明中。术语“属于泛菌属的细菌”指依据微生物学领域的技术人员已知的分类法归类于泛菌属的细菌。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的一些菌种最近已被重新归类于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis>SfrESSlii (Pantoea stewartii) ··。 (Int. J· Syst· Bacteriol·，43， 162-173(1993))。本发明的细菌包括具有生产L-氨基酸的能力的肠杆菌科菌株，其经修饰增强了 D-木糖通透酶的活性。此外，本发明的细菌包括具有生产L-氨基酸的能力而不具有D-木糖通透酶天然活性，并且已经用编码D-木糖通透酶的DNA片段转化的肠杆菌科的菌株。短语“D-木糖通透酶的活性”指将糖如木糖和葡萄糖转运到细胞中的活性。可以通过补偿具有破坏的糖转运PTS-系统的细菌的生长延迟(参见，例如，实施例中描述的 AptsHI-crr 突变体)或者通过体内补偿 xylE 突变(Davis, Ε. 0. and Henderson, P. J.， J. Biol.Chem. ,262(29) ； 13928-32 (1987))来检测 D-木糖通透酶的活性。短语“细菌经修饰增强了 D-木糖通透酶的活性”指每个细胞的活性高于非修饰菌株例如野生型菌株的活性。这种修饰的例子包括增加每个细胞的D-木糖通透酶分子的数目，增强每个D-木糖通透酶分子的比活等。另外，可用于对比目的的野生型菌株包括例如大肠杆菌K-12。本发明中，作为增强D-木糖通透酶的胞内活性的结果，可以增加培养基中积累的L-氨基酸例如L-苏氨酸或L-精氨酸的量。可以通过增加编码D-木糖通透酶的xylE基因的表达获得细菌细胞中D-木糖通透酶活性的增强。源自属于埃希氏菌属的细菌的任何xylE基因以及源自其它细菌如棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)的任意xylE基因可以用作本发明中的D-木糖通透酶基因。源自属于埃希氏菌属的细菌的xylE基因是优选的。短语“增加基因的表达”指基因的表达量高于非修饰的菌株例如野生型菌株的表达量。这种修饰的例子包括增加每个细胞中基因的拷贝数，提高(一个或几个)基因的表达水平等等。例如，通过限制性处理染色体DNA，然后利用基于基因序列的探针进行 Southern印迹，荧光原位杂交(FISH)等测定基因的拷贝数。基因表达水平可以用多种方法包括Northern印迹、定量RT-PCR等测定。另外，可以当作对照的野生型菌株包括例如大肠杆菌 K-12 或 Pantoea ananatis FERM BP-6614 (US2004180404A1)。Pantoea ananatis FERM BP-6614于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (3独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)), 给予保藏号FERM P-16644。然后依据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日将其转为国际保藏，给予保藏号FERM BP-6614。虽然该菌株在其被分离时被鉴定为成团肠杆菌，但如上所述，基于16S rRNA的核苷酸序列分析，已经将其重新归类于Pantoea ananatis。作为增强D-木糖通透酶胞内活性的结果，提高了 L-氨基酸例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸或L-谷氨酸在培养基中的积累。已经阐明了来自大肠杆菌的编码D-木糖通透酶，即D-木糖/质子同向转运蛋白的xylE基因(GenBank登录号NC 000913. 2，gi :49175990的序列中的核苷酸编号4240277 至4238802)。xylE基因位于大肠杆菌K-12染色体上yjbAORF和maW基因之间。也阐明了另一个编码D-木糖通透酶的xylE基因(AAN45595. xylose-proton sym. . . [gi 24054686], AAM41050. MFS transporter. . . [gi :21112853]野油菜黄单胞菌(Xanthomonas
8campestris) :XCC1759)。本发明中，来自大肠杆菌的xylE基因由SEQ ID NO. 1表示。一旦被转运到细胞中，葡萄糖就由葡糖激酶磷酸化，所述葡糖激酶由glk基因所编码。因此也希望改造所述细菌以使之具有增强的葡糖激酶活性。已经阐明了编码大肠杆菌葡糖激酶的glk基因(GenBank登录号NC 000913. 1，gi :16127994的序列中核苷酸编号 2506481至2507446)。glk基因位于大肠杆菌K-12染色体上b2387和b23890RFs之间。在合适的条件下，由xylA基因编码的木糖异构酶也有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的转化(Wovcha, Μ. G.等，Appl Environ Microbiol. 45(4) 1402-4 (1983))。因此也希望修饰所述细菌以使之具有增强的木糖异构酶活性。已经阐明了编码大肠杆菌木糖异构酶的xylA基因(GenBank登录号NC_000913. 2，gi :49175990的序列中核苷酸编号37沘788至 3727466)。xylA基因位于大肠杆菌K-12染色体上xylB和xylF基因之间。当培养基包含作为附加碳源的木糖时，增加木糖利用酶的活性是必需的。“木糖利用酶”包括木糖转运、木糖异构化和木糖磷酸化的酶、以及调节蛋白。这种酶包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖转运蛋白、和木糖转录激活因子(xylose transcriptional activator)。木糖异构酶催化D-木糖到D-木酮糖的异构化的反应。木酮糖激酶催化利用 ATP磷酸化D-木酮糖产生D-木酮糖-5-磷酸(D-xylulose-5-phosphate)和ADP的反应。 木糖利用酶如木糖异构酶和木酮糖激酶活性的存在分别通过相应木糖异构酶阴性或木酮糖激酶阴性大肠杆菌突变体的补偿来测定。编码上述木糖利用酶的基因位于大肠杆菌染色体上xylABFGHR基因座中。编码木酮糖激酶(EC编号2. 7. 1. 17)的基因是已知的，已被命名为xylBteenBank登录号 NC_000913. 1，gi =16131435的序列中核苷酸编号3725546至3727000)。编码木糖结合蛋白转运系统的基因是已知的，已被命名为xylF(GenBank登录号NC_000913. l,gi :16131437 的序列中核苷酸编号37观760至37^75 。编码木糖转运系统推定的ATP结合蛋白的基因是已知的，已被命名为xylG(GenBank登录号NC_000913. 1，gi :16131438的序列中核苷酸编号3729830至3731371)。编码ABC型木糖转运系统的通透酶成分的基因是已知的，已被命名为xylH(GenBank登录号NC_000913. 1，gi :16131439的序列中核苷酸编号3731349至 3732530)。编码xyl操纵子的转录调节子的基因是已知的，已被命名为XylR(GenBank登录号 NC_000913. 1，gi :16131440 的序列中核苷酸编号 3732608 至 3733786)。因此，可以利用基于所述基因的已知核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考 White，T. J.等.，Trends Genet.，5，185 (1989))获得 xylE、glk 和 xylABFGHR 基因座的基因。编码其他微生物的D-木糖通透酶的基因可以按照类似的方式获得。用编码下述蛋白㈧或⑶的DNA例示源自大肠杆菌的xylE基因(A)具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质；或(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶活性。如本发明中所用的短语“变体蛋白”指其序列有改变的蛋白质，无论是氨基酸的缺失、插入、添加、还是取代，但其仍然保留了可用水平的所需活性，例如可用于增强L-氨基酸的生产。变体蛋白中改变的数目依赖于蛋白质三维结构中氨基酸残基的位点或类型。对于蛋白质(A)来说可以是2至30个，优选2至15个，更优选2至5个。所述变体中的这些改变可能发生在对于蛋白质的功能来说不重要的蛋白质区域中。这是因为一些氨基酸彼此具有高度的同源性，这样三维结构或活性不受这种改变的影响。所述变体蛋白中的这些改变可能发生在对于蛋白质的功能来说不重要的蛋白质区域中。因此，所述蛋白质变体(B) 可以是相对于SEQ ID NO. 2所示的D-木糖通透酶的完整氨基酸序列来说具有不小于70%， 优选80 %，更优选90 %，最优选95 %的同源性的变体，只要保留了 D-木糖通透酶的活性。 可以用熟知的方法例如计算机程序BLAST 2.0测定两个氨基酸序列之间的同源性，BLAST 2. 0计算三个参数分数、同一性和相似性。编码与上述D-木糖通透酶基本相同的蛋白质的DNA可以例如通过修饰编码D-木糖通透酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO=D来获得，例如以定点诱变方法，使特定位点包含一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入、或添加。如上所述修饰的DNA可以由常规已知的突变处理获得。这种处理包括羟胺处理编码本发明蛋白质的DNA，或者用紫外线照射或试剂如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理包含所述DNA的细菌。一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加应当是保守性突变，以保留所述活性。代表性保守性突变是保守性取代。保守性取代的例子包括Ser或Thr取代Ala，Glru His 或 Lys 取代 Arg，Glu、Gin、Lys, His 或 Asp 取代 Asn，Asn、Glu 或 Gln 取代 Asp，Ser 或 Ala 取代 Cys，Asn、Glu、Lys, His、Asp 或 Arg 取代 Gln，Asn、Gin、Lys 或 Asp 取代 Glu，Pro 取代 Gly，Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 取代 His，Leu、Met、Val 或 Phe 取代 lie，lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu, Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys, lie、Leu、Val 或 Phe 取代 Met, Trp, Tyr、Met、lie 或 Leu 取代 Phe, Thr 或 Ala 取代 Ser，Ser 或 Ala 取代 Thr, Phe 或 Tyr 取代 Trp, His、Phe 或 Trp 取代 Tyr，以及 Met、Ile 或 Leu 取代 Val。编码与D-木糖通透酶基本相同的蛋白质的DNA可以通过在合适的细胞中表达具有上述突变的DNA，并研究任何表达产物的活性而获得。编码与D-木糖通透酶基本相同的蛋白质的DNA也可以通过分离DNA获得，所述DNA可在严紧条件下与具有核苷酸序列的探针杂交并编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质，所述核苷酸序列包含例如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。此处所指“严紧条件”是在此条件下形成所谓的特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。可以举例说明所述严紧条件，例如，在所述严紧条件下，具有高度同源性的DNAs，例如具有不小于50 %同源性，优选80 %，更优选90 %，最优选95 %的 DNAs能够互相杂交，而具有低于上述同源性的DNAs不能互相杂交。或者，可以举例说明严紧条件，在所述严紧条件下，DNA能够于Southern杂交中，在相当于常规洗涤条件的盐浓度下杂交，即Ix SSC、0. SDS，优选0. Ix SSC、0. SDS、60°C。洗涤的持续时间依赖于用于印迹的膜的类型，通常是制造商所推荐的。例如，在严紧条件下，洗涤HyboncTN+尼龙膜 (Amersham)的推荐的持续时间是15分钟。优选地，洗涤可以进行2至3次。核苷酸序列SEQ ID NO 1的部分序列也可以用作探针。可以利用基于核苷酸序列 SEQ ID NO :1的引物，和包含核苷酸序列SEQ ID NO 1的DNA片段作为模板，通过PCR制备探针。长约300bp的DNA片段用作探针时，洗涤的杂交条件包括，例如50°C、2x SSC和0. 1% SDS。上述核苷酸的取代、缺失、插入、或添加还包括例如由于细菌的种或属中的多样性而天然发生(突变体或变体)并且包含D-木糖通透酶的突变。“用编码蛋白质的DNA转化细菌”指例如用常规方法将DNA导入细菌中。该DNA 的转化将导致编码本发明蛋白质的基因表达的增加，并将增强细菌细胞中所述蛋白质的活性。转化方法包括迄今报导的任何已知方法。例如，对于大肠杆菌K-12，已经报导了用氯
10化钙处理受体细胞以增强细胞对DNA的通透性的方法(Mandel，Μ. and Higa，Α.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))，并可以使用该方法。基因表达增强的方法包括增加基因拷贝数。将基因导入到能够在肠杆菌科细菌中发挥作用的载体中来增加基因的拷贝数。优选使用低拷贝载体。低拷贝载体的例子包括但不限于pSC101、pMW118、pMW119等。术语“低拷贝载体”用于其拷贝数多达每个细胞5个拷贝的载体。也可以通过将多拷贝基因导入到细菌染色体中来实现基因表达的增强，例如通过同源重组、Mu整合等方法导入。例如一次Mu整合作用允许向细菌染色体中导入多达3个拷贝的基因。增加D-木糖通透酶基因的拷贝数也可以通过向细菌的染色体DNA导入多拷贝的 D-木糖通透酶基因而实现。为了将多拷贝基因导入到细菌染色体中，利用其多拷贝在染色体DNA中作为靶物(target)存在的序列实施同源重组。在染色体DNA中具有多拷贝的序列包括但不限于重复DNA，或存在于转座元件(transposable element)末端的反向重复序列(inverted repeat) 还有，如美国专利5，595，889中公开的，可以将D-木糖通透酶基因掺入到转座子中，并使其转移以将多拷贝基因导入染色体DNA中。基因表达的增强也可以通过将本发明的DNA置于强启动子的控制之下而实现。例如，将Iac启动子、trp启动子、trc启动子、和lambda噬菌体的或启动子称为强启动子。基因表达的增强还可以通过将强终止子置于本发明的DNA下游而实现。强启动子和/ 或终止子可以与基因拷贝的增加组合使用。或者，例如可以通过向启动子导入突变以提高位于启动子下游的结构基因(基因的编码区)的转录水平，从而增强启动子的效果。类似地，例如可通过向终止子导入突变以提高位于终止子上游基因转录的周转(turnover)，从而增强终止子的效果。另外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区，尤其是恰位于起始密码子上游的序列中几个核苷酸的取代深刻地影响mRNA可译性。例如，发现了 20倍范围的表达水平，这依赖于起始密码子之前的三个核苷酸的性质(Gold等.，Annu. Rev. Microbiol.，35，365-403，1981 ；Hui 等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。先前，已表明 rhtA23 突变是相对于ATG起始密码子来说在-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29,1997, abstract No. 457) 。 0] , ! 明rhtA23突变增强了 rhtA基因表达，结果增加了对苏氨酸、高丝氨酸和转运出细胞的一些其它物质的抗性。另外，也可能向细菌染色体上的D-木糖通透酶基因的启动子或终止子区导入核苷酸取代，这导致更强的启动子或终止子功能。例如，可以利用温度敏感性质粒以与基因取代相同的方式进行表达控制序列的改变，如国际专利公开WO 00/18935和日本专利申请公开No. 1-215280中公开的。制备质粒DNA的方法包括但不限于DNA的消化和连接、转化、选择寡核苷酸作为引物等、或者本领域技术人员熟知的其他方法。例如在Sambrook，J.，Fritsch, Ε. F.，和 Maniatis,Τ. ,"Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition，，，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)中描述了这些方法。可以通过将前述DNA导入到本身具有产生L-氨基酸的能力的细菌中而获得本发明的细菌。或者，可以通过将产生L-氨基酸的能力赋予已包含所述DNA的细菌而获得本发明的细菌。牛产L-苏氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括，但不限于属于埃希氏菌属的产生L-苏氨酸的细菌，如大肠杆菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美国专利 Nos. 5，175，107 和 5，705，371)、大肠杆菌 NRRL-21593 (美国专利 No. 5，939，307)、大肠杆菌 FERM BP-3756 (美国专利 No. 5，474，918)、大肠杆菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美国专禾Ij No. 5，376，538)、大肠杆菌 MG442 (Gusyatiner 等·，Genetika (俄语),1978,14 947-956)、大肠杆菌 VL643 和 VL2055(EP 1149911A)等。菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，并且是蔗糖同化的，且i 1 vA基因具有渗漏 (leaky)突变。该菌株在rhtA基因中也有突变，其赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996包含质粒PVIC40，其通过将包括突变thrA基因的thrA*BC操纵子插入到 RSF1010衍生载体中而获得。该突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对于苏氨酸反馈抑制基本上脱敏。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏号RIA 1867保藏在 All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3_A, 117105 莫斯科，俄罗斯联邦)。所述菌株还于1987年4月7日以保藏号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms) (VKPM ；Dorozhny proezd. 1，莫斯科 1175佔，俄罗斯联邦)。优选本发明的细菌经额外修饰增强下述基因中一个或多个的表达-突变thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I ；-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；-asd基因，其编码天冬氨酸- β -半醛脱氢酶；和-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；已经阐明了编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(核苷酸位置 337 至 2799，GenBank 登录号 NC 000913. 2，gi :49175990)。thrA 基因位于大肠杆菌 K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。已经阐明了编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB 基因(核苷酸位置沘01 至 3733，GenBank 登录号 NC_000913. 2，gi :49175990)。thrB 基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrA和thrC基因之间。已经阐明了编码大肠杆菌苏氨酸合酶的 thrC 基因(核苷酸位置 3734 至 5020，GenBank 登录号 NC_000913. 2，gi :49175990)。 thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。这三个基因都作为单一苏氨酸操纵子起作用。编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA 基因，以及thrB和thrC基因，可以从熟知的质粒PVIC40作为一个操纵子获得，质粒 PVIC40存在于生产苏氨酸的大肠杆菌VKPM B-3996中。质粒pVIC40详细描述于美国专利No. 5，705，371。rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上靠近glnHPQ操纵子的ISmin处，其编码谷氨酰胺转运系统的组件。rhtA基因与0RFl(ybiF基因，位置764至1651，GenBank登录号 AAA218541，gi :440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之间。表达由ORFl编码的蛋白质的单元已被命名为rhtA基因(rht:抗高丝氨酸和苏氨酸)。另外，揭示了 rhtA23突变是相对于ATG起始密码子来说-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24—29，1997，abstract No. 457，EP 1013765A)。已阐明大肠杆菌的asd基因(核苷酸位置3572511至3571408，GenBank登录号NC 000913. l,gi :16131307)，并可以利用基于所述基因的核苷酸序列的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考White，T.J.等，Trends Genet.，1989，5 :185)获得。其它微生物的asd基因可以以类似的方式获得。还阐明了大肠杆菌的aspC基因(核苷酸位置983742至984932，GenBank登录号 NC 000913. l,gi :16128895)，并可以通过PCR获得该基因。其它微生物的aspC基因可以以类似的方式获得。产牛L-赖氨酸的细菌属于埃希氏菌属的产生L-赖氨酸的细菌的例子包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。所述L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但当L-赖氨酸共存于培养基中时，该抑制是完全或部分脱敏的。L-赖氨酸类似物的例子包括但不限于氧代赖氨酸、赖氨酸氧肟酸(lysine 1^办0份1^切)、5-(2-氨乙基)-1^-半胱氨酸(AEC)、γ -甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺(a-chlorocaprolactam)等等。对这些赖氨酸类似物有抗性的突变体可以通过对属于埃希氏菌属细菌进行常规人工诱变处理而获得。可用于产生L-赖氨酸的菌株的具体例子包括大肠杆菌AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185 ；参见美国专利4，346，170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的反馈抑制是脱敏的。菌株WC196可以用作大肠杆菌的产生L-赖氨酸的细菌。通过将AEC抗性赋予菌株W3110来培育该细菌菌株，菌株W3110来源于大肠杆菌K-12。所得菌株称为大肠杆菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术石if究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary), Tsukuba Central 6,1-1, Higashi l-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到登录号FERM P-14690。之后，依据布达佩斯条约的规定，于1995年9月四日转为国际保藏，得到登录号FERM BP-5252 (美国专利 5，827，698)。产生L-组氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的产生L-组氨酸的细菌，如大肠杆菌菌株M(VKPM B-5945, RU2003677)；大肠杆菌菌株 80(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌 NRRLB 12116-B12121 (美国专利 4，388，405)；大肠杆菌 H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美国专利 6，344, 347)；大肠杆菌 H-9341 (FERMBP-6674) (EP 1085087)；大肠杆菌 AI80/pFM201 (美国专利 6，258，554)等。产牛L-苯丙氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的产生L-苯丙氨酸的细菌，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::TnlO，tyrR) (VKPM B-8197)；含有 pheA34 基因的大肠杆菌 HW1089 (ATCC 55371)(美国专利 5，354，672)； 大肠杆菌 MWEClOl-b(KR8903681)；大肠杆菌 NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、禾口 NRRL B-12147 (美国专利 4，407，952)。另外，大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAB (FERMBP-3566)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAD] (FERM BP-12659)、大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-U662)、和命名为 AJ 12604(FERM BP-3579)的大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]可以用作亲本菌株(EP 488424B1)。另夕卜， 也可以使用属于埃希氏菌属的产生L-苯丙氨酸的细菌，其中由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质具有增强的活性(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。产牛L-精氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于产生 L-精氨酸的细菌如大肠杆菌菌株237 (VKPM B-7925)(美国专利申请2002/0058315A1)及其含有突变的N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利申请No. 2001112869)、大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926) (EP 1170358A1)、具有在其中导入的编码N-乙酰谷氨酸合成酶的 argA基因的产生精氨酸的菌株(JP 57-5693A)等等。产生L-谷氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的产生L-谷氨酸的细菌如大肠杆菌VL334thrC+(EP117M33)。大肠杆菌 VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突变(美国专利No. 4，278，765)。利用培养在野生型大肠杆菌K12 (VKPM B-7)细胞上的噬菌体P1，通过普通的转导方法转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了 L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。该菌株能够产生L-谷氨酸。用于衍生本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于α -酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的突变体或者具有减小的α-酮戊二酸脱氢酶活性的突变体。 α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的或者具有减小的α-酮戊二酸脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌以及获得它们的方法在美国专利5，378，616和5，573，945中描述。具体地，这些菌株包括下述大肠杆菌 W3IIOsucA Kmr大肠杆菌AJU624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJU6^(FERM BP-3854)大肠杆菌AJUM9 (FERM BP-4881)大肠杆菌W31 IOsucA :Kmr通过破坏大肠杆菌W3110的α -酮戊二酸脱氢酶基因 (以下称为“sucA基因”)而获得。该菌株是α-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷的。
产生L-谷氨酸的细菌的其它例子包括属于泛菌属的突变菌株，其为α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的或者具有减小的α-酮戊二酸脱氢酶活性，并可以如上所述获得。这样的菌株包括 Pantoea ananatis AJ13356。(美国专利 6，331，419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日以登录号FERMP-16645保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术石if究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and hdustry)(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary), Central 6，1-1， Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi， Ibaraki-ken， 305-8566，日本)。之后依据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日转为国际保藏，得到登录号FERM BP-6615。Pantoea ananatts AJ13356是α -酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，这是破坏cKGDH-El亚基基因(sucA)的结果。上述菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌，并保藏为成团肠杆菌AJ13356。然而，最近根据16S rRNA的核苷酸测序等将其重新分类为Pantoea ananatts0尽管AJ13356在前述保藏机构保藏为成团肠杆菌，但在本说明书中，将它们描述为 Pantoea ananatis0L-氨基酸的牛产草酰乙酸(OAA)作为导致合成Thr和Lys的反应的底物。OAA由于PEP与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的反应而得到，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作为催化剂起作用。因此，细胞中PEPC浓度的升高对于这些氨基酸的发酵生产可能是非常重要的。当葡萄糖用作发酵中的碳源时，葡萄糖被葡萄糖-磷酸转移酶(Glc-PTQ系统内在化(internalize)。此系统消耗PEP，而且PTS中的蛋白质由ptsG和ptsHIcrr编码。内在化期间，从一个分子葡萄糖产生一个分子PEP和一个分子丙酮酸(Pyr)。在蔗糖而非葡萄糖中培养时，已被修饰而具有利用蔗糖的能力(Scr-PTS)的产生L-苏氨酸的菌株和产生L-赖氨酸的菌株具有更高的生产这些氨基酸的能力(EP 1149911A2)。相信由一个分子蔗糖通过Scr-PTS产生三个分子PEP和一个分子Pyr，提高PEP/Pyr的比例，由此促进由蔗糖合成Thr和Lys。此外，已报导Glc-PTS受到几种表达控制(Postma P. W 等·，Microbiol Rev.，57 (3)，543-94 (1993) ；Clark B.等· J. Gen. Microbiol. ,96(2)，191-201 (1976) ；Plumbridge J.，Curr. Opin. Microbiol.，5 (2)， 187-93(2002) ；Ryu S.等·，J. Biol. Chem.，270 (6) J489-96 (199 )，因此有可能葡萄糖自身的掺入在氨基酸发酵中可能是限速步骤。通过在产生苏氨酸的菌株、产生赖氨酸的菌株、产生组氨酸的菌株、产生苯丙氨酸的菌株和/或产生谷氨酸的菌株中增加xylE基因的表达而进一步提高PEP/Pyr的比例将进一步增加氨基酸生产。因为从两个分子葡萄糖产生四个分子PEP，预期PEP/Pyr的比例将大大提高。由于xylE基因表达增加，预期将去除glc-PTS的表达控制。本发明产生L-氨基酸的方法包括在培养基中培养本发明的细菌，使L-氨基酸在培养基中积累，并从培养基收集L-氨基酸的步骤。此外，本发明的方法包括产生L-苏氨酸、 L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养本发明的细菌，使L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸积累在培养基中，并从培养基收集L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸。在本发明中，从培养基培养、收集、和纯化L-氨基酸等可通过常规发酵方法进行， 其中用微生物生产L-氨基酸。所述培养基可以是合成的或天然的，只要所述培养基包括碳源和氮源以及矿物质，并且必要时还包括微生物生长所需的适量营养物。碳源可以包括多种碳水化合物如葡萄糖、蔗糖和木糖，以及多种有机酸。取决于所选微生物的同化方式，可以使用醇包括乙醇和甘油。作为氮源，可以使用多种铵盐如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物和经消化的发酵微生物。作为矿物质，可以使用钾单磷酸盐(potassium monophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。硫胺、酵母提取物等可以用作维生素。必要时可以向培养基添加附加营养物。例如，如果微生物生长需要L-氨基酸 (L-氨基酸营养缺陷型)，则可以向培养基添加足量的L-氨基酸。 培养优选在需氧条件下进行，例如在20至40°C，优选30至38°C的温度振荡培养， 以及通气搅拌培养。培养的PH通常在5到9之间，优选6. 5到7. 2之间。可以用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱、和缓冲液调整培养的PH。通常，培养1至5天导致目标L-氨基酸在液体培养基中积累。培养后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基中去除固体如细胞，然后可以通过离子交换、浓缩和/或结晶方法收集并纯化目标L-氨基酸。
实施例以下将参考下述非限制性实施例更具体地解释本发明。实施例1 用杂合I\_ta。启动子取代大肠杆菌中xylE基因的天然启动子区为了取代xylE基因的天然启动子区，利用DatsenkoK. A. and Wanner B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97,6640-6645)描述的方法，将携带杂合P^ta。启动子和由cat基因编码的氯霉素抗性标记(CmK)的DNA片段整合到大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)的染色体中，代替天然启动子区，所述方法也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”。 具有热敏复制子的重组质粒 pKD46(Datsenko，K. Α.，Wanner, B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97,6640-6645)用作由噬菌体λ衍生的基因的供体，所述基因负责Red-介导的重组系统。包含重组质粒PKD46的大肠杆菌菌株BW25113可由大肠杆菌Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA 获得，其登录号为 CGSC7630。化学合成杂合I\_ta。启动子。取代的启动子的核苷酸序列显示于序列表中(SEQ ID NO 3)。包含杂合Pptae启动子的合成DNA片段在其5，端包含BglII识别位点，其对于进一步连接到被导入以进一步整合到细菌染色体中的cat基因和与xylE基因5’末端同源的36 个核苷酸来说是必需的。使用商业上可获得的质粒pACYC184(GenBank/EMBL 登录号 X06403，“Fermentas”， Lithuania)为模板，和引物Pl (SEQ ID N0:4)和P2(SEQ ID NO :5)通过PCR获得包含由 cat基因编码的CmK标记的DNA片段。弓丨物Pl在其5’端包含BglII识别位点，其对于进一步连接到杂合Pkta。启动子是必需的，引物P2包含与位于xylE基因起始密码子上游217bp 的区域同源的36个核苷酸，其被导入到引物中用于进一步整合到细菌染色体中。利用“TermoHybaid PCR Express”扩增仪实施PCR。反应混合物(总体积-50 μ 1)由含 15mM MgCl2&5yl IOx PCR 缓冲液(“ Fermentas ”，Lithuania)、200 μ tM 的每种 dNTP、 25pmol的每种所用引物和IU的iTaq-聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)组成。将大约 5ng的质粒DNA添加到反应混合物中作为模板DNA用于PCR扩增。温度曲线(temperature profile)如下在95°C初始DNA变性5min，接下来是95°C变性30sec、55°C退火30sec、72°C 延伸30sec的25个循环；和在+72°C最终延伸7min。然后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的 DNA 片段，用 “GenElute Spin Columns” ( “Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。用BglII限制酶处理上述两种DNA片段并连接。用引物P2 (SEQ ID NO : 和P3 (SEQ ID NO 6)通过PCR扩增连接产物。引物P3在其5，端包含36个核苷酸，这36个核苷酸与被导入用于进一步整合到细菌染色体中的xyIE基因的5’末端同源。通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，用“GenElute Spin Columns" ( “Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。获得的DNA片段用于电穿孔和Red-介导整合到大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。将MG1655/pKD46细胞于30°C在添加了氨苄青霉素(100 μ g/ml)的液体LB-培养基中培养过夜，然后用添加了氨苄青霉素(100 μ g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)(阿拉伯糖用于诱导Red系统的质粒编码基因)的SOB-培养基(酵母提取物，5g/l ；NaCl, 0. 5g/l ；胰蛋白胨，20g/l ;KC1，2. 5mM;MgCl2，10mM)l 100稀释，在30°C培养以使细菌培养物的光密度达到0D_ = 0. 4-0. 7。来自IOml细菌培养物的培养细胞用以冰预冷的去离子水洗涤3次， 然后悬浮在IOOul水中。将溶解在去离子水中的10 μ 1 DNA片段(IOOng)添加到细胞悬浮液中。依照厂商的说明，用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA) (No. 165-2098，2_89版本)进行电穿孔。 将电击过的(shocked)细胞添加到 1-ml SOC 培养基(Sambrook 等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), 在37°C温育2小时，然后将其涂布到含25 μ g/ml氯霉素的L-琼脂上。用引物P4(SEQ ID NO 7)和P5 (SEQ ID NO 8)通过PCR测试24小时内生长的菌落的CmE标记而非xylE基因的天然启动子区的存在。为此目的，将新分离的菌落悬浮在20 μ 1水中，然后将1 μ 1获得的悬浮液用于PCR。使用下述温度曲线在95°C初始DNA变性IOmin ；然后是95°C变性30sec、 55°C退火30seC、72°C延伸Imin的30个循环；在72°C最终延伸7min。所测试的少量0^菌落包含所需的 2000bp DNA片段，这证实了 CmK标记DNA而不是xylE基因的192bp天然启动子区的存在(参见图1)。这些菌株中的一个通过在37°C培养来消除热敏质粒pKD46， 并将所得菌株命名为大肠杆菌MG1655Ppta。XylE。实施例2 增加的xylE基因表达对具有破坏的PTS转运系统的大肠杆菌菌株生长的影响为了表明xylE基因表达增强对大肠杆菌菌株生长的影响，构建了具有破坏的PTS 转运系统的大肠杆菌菌株。为实现该目的，用Datsenko K. A.禾Π Wanner B 上.(Proc. Natl. Acad. ki. USA， 2000,97,6640-6645)描述的方法将携带卡那霉素抗性标记(KmK)的DNA片段整合到大肠杆菌MG1655/pKD46的染色体中，代替ptsHI-crr操纵子，该方法也称为“Red-介导的整合”和 /或“Red-驱动的整合”，实施例1也描述了该方法。已经阐明了 ptsHI-crr 操纵子(GenBank 登录号 NC 000913. 2，gi :49175990 的序列中，对于ptsH、ptsl和err基因分别为核苷酸编号2531786至2532043、2532088至2533815和2533856至25:3436 。ptsHI_crr操纵子位于大肠杆菌K-12染色体上cysK和 pdxK基因之间。利用商业上可获得的质粒pUC4KAN(GenBank/EMBL 登录号 X06404，“Fermentas", Lithuania)作为模板，和引物P6 (SEQ ID NO 9)和P7 (SEQ ID NO 10)通过PCR获得携带 KmE基因的DNA片段。引物P6包含与ptsH基因5、末端同源的36个核苷酸，引物P7包含与err基因3’-末端同源的36个核苷酸。将这些序列导入到引物P6和P7中，用于进一步整合到细菌染色体中。如实施例1所述进行PCR。然后，用琼脂糖凝胶电泳浓缩扩增的DNA片段，通过以“GenElute Spin Columns^ "Sigma", USA)离心从凝胶中提取，并用乙醇沉淀。所获得的DNA片段如实施例 1所述用于电穿孔和Red-介导整合到大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中，只是在电穿孔后将细胞涂布到含50 μ g/ml卡那霉素的L-琼脂上。利用引物P8 (SEQ ID NO 11)和P9 (SEQ ID NO: 12)通过PCR测试24小时内生长的菌落的记而非ptsHI-crr操纵子的存在。为此目的，将新分离的菌落悬浮在20 μ 1 水中，然后将1 μ 1获得的悬浮液用于PCR。PCR条件如实施例1所述。所测试的少量10^菌落包含所需的 1300bp DNA片段，这证实了 10^基因而非ptsHI-crr操纵子的存在。所获得的菌株中的一个通过在37°C培养而消除热敏质粒pKD46，并将所得菌株命名为大肠杆菌 MG1655AptsHI-crr。然后，将来自上述大肠杆菌MG1655Ppta。XylE的染色体的DNA片段通过Pl转导 (Miller, J. H. (1972)Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)转移到大肠杆菌 MG1655 Δ ptsHI-crr，得到菌株 MG1655 Δ ptsHI-crr
PL-tacXylE。检测三个大肠杆菌菌株MG1655、MG1655 Δ ptsHI-crr 和 MG1655 Δ ptsHI-crr PL_ta。xylE在含有葡萄糖作为碳源的基本Adams上生长的能力。如图2所示，大肠杆菌MG1655AptsHI-crr不能在含葡萄糖的基本Adams培养基上良好地生长(μ 0. 06)。 增加xylE基因表达明显增强了受体菌株在含葡萄糖的基本Adams培养基上的生长特性。实施例3 增加的xylE基因表达对苏氨酸产生的影响为了测试在Pptae启动子控制下的xylE基因增强的表达对苏氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655PL_ta。xylE的染色体的DNA片段通过Pl转导(Miller，J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) 转移到产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996。菌株VKPM B-3996于1987年4月7日以登录号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(俄罗斯，117545莫斯科，Ist Dorozhny proezd,1)。将大肠杆菌菌株B-3996和B_3996PL_ta。xylE都在37 °C在L-琼脂平板上培养18- 小时。为获得种子培养物，在旋转震荡器O50rpm)上，在32°C将所述菌株在含2ml具有4% 蔗糖的L-培养液(L-broth)的20x 200mm试管中培养18小时。然后，用0. 21ml (10% )种子材料接种发酵培养基。在20x 200mm试管中，在2ml用于发酵的基本培养基中进行发酵。 细胞在32°C 250rpm振动生长48小时。培养后，用以下流动相丁醇醋酸水=4 1 1 (ν/ν)通过纸层析测定培养基中积累的L-苏氨酸的量。将茚三酮的丙酮溶液用作显示试剂。切下含L-苏氨酸的斑点，在CdCl2的0. 5%水溶液中洗脱L-苏氨酸，用分光光度法在540nm处评估L-苏氨酸的量。结果显示在表1中。由于导入IVta。xylE，改进了苏氨酸生产。发酵培养基的成分(g/Ι)如下
葡萄糖80.0
(NH4)2SO422.0
NaCl0.8
KH2PO42.0
MgSO4 7H200.8FeSO4 7H200.02
MnSO4 5H200.02
疏胺素盐酸盐(thiamine HCl) 0.0002
酵母提取物1.0
CaCO330.0葡萄糖和硫酸镁分别灭菌。CaCO3在180°C干热灭菌2小时。pH调整到7. O。灭菌后将抗生素加到培养基中。表权利要求
1.生产L-苏氨酸的方法，其包括在培养基中培养产生L-苏氨酸的大肠杆菌以使L-苏氨酸在所述培养基中积累，并从所述培养基分离L-苏氨酸，其中所述大肠杆菌已经过修饰而增强了编码SEQ ID N0:2的氨基酸序列的xylE基因的表达，而且其中通过将所述xylE 基因置于包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列的强启动子的控制下而增强了所述xylE基因的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中所述xylE基因包含SEQID NO 1的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及用肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法，具体地公开了利用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸，例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，其中所述细菌经修饰增强了D-木糖通透酶的活性。
文档编号C12P13/08GK102286562SQ20111027126
公开日2011年12月21日 申请日期2005年10月21日 优先权日2004年10月22日
发明者原吉彦, 埃卡特里那.A.斯利文斯卡亚, 埃卡特里那.A.赛维拉索瓦, 埃尔韦拉.B.沃罗什洛娃, 埃琳娜.V.克里亚奇科, 塔特亚娜.V.里奥诺娃, 尤里.I.科兹洛夫, 康斯坦丁.V.赖贝克, 拉里萨.G.埃里克, 植田拓嗣, 瑟奇.V.马什科, 瓦莱里.Z.阿克维迪安, 米克海尔.M.古斯亚蒂纳, 薇拉.G.多罗申科 申请人:味之素株式会社