专利名称：连续吸附耦合发酵生产Thailandepsin A的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及伯克氏菌发酵与大孔吸附树脂连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法。
背景技术：
伯克氏菌似64(.Burkholderia thailandensis E264, ATCC 700388)能够合成组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitor)类抗癌物质Hiailand印sin A。作为与已被美国 FDA批准上市的抗癌药物Π(228 (格洛斯特医药公司，商品名Istodax)有不同的选择性抑制特点的结构类似物，Thailand印sin A具有特殊的缩酯环肽结构，可有效透过细胞膜，通过抑制组蛋白去乙酰酶而显示良好的抗肿瘤活性。美国国家癌症研究所NCI60数据显示， Thailandespin A有着广泛的抑制癌细胞增殖活性，特别对结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌和肾癌有明显作用，对皮肤T细胞淋巴瘤的疗效尤为显著。它被录入美国国家癌症研究所(NCI) 的发展治疗学项目(Developmental Therapeutics Program)，用于筛选NCI60人类癌症细胞系，编号为NSC D751510。目前，Thailand印sin A已进入临床试验阶段。作为一种极具开发前景的抗癌药物，Thailand印sin A有望在不远的将来作为商品药物推广，但是目前Thailand印sin A的发酵产量很低，而且人工合成非常困难，因此如何实现jThai land印sin A的高产有重要需求，也是目前Thai land印sin A应用的障碍之一。 目前，关于如何提高Thailand印sin A的发酵产量鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种连续吸附耦合发酵生产 Thailand印sin A的方法。该方法通过连续吸附耦合装置，原位吸附分离Thailand印sin A 产物，从而解除Thailand印sin A的产物负反馈抑制，提高产物发酵产量，简化生产工艺流程。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
本发明涉及的一种连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法，包括以下步骤
(a)将产生Thailand印sinA的伯克氏菌经种子活化培养，接入发酵罐中，发酵；
(b)当发酵罐中Thailand印sinA和菌体浓度达到一定程度，即发酵30-48小时， 处于对数生长的中后期，将发酵液连续输入吸附柱，利用吸附柱中的大孔吸附树脂吸附 Thailand印sin A，经吸附后的发酵液返回发酵罐继续发酵；
(c)以流加方式向发酵罐中补充葡萄糖，维持Thailand印sinA的不断合成；
(d)在Thailand印sinA合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵12-36小时后， 终止发酵，取出大孔吸附树脂，萃取分离，提纯，得到Thailand印sin A。优选的，步骤(a)中，所述发酵罐中，加入放大培养基的体积占发酵罐罐体装液量体积的分数为50 80%。优选的，步骤(a)中，所述放大培养基每升含以下质量的各组分葡萄糖10 20g、胰蛋白胨20 40g、氯化钠0 5g、K2HP04. 3H20 15 30g、KH2P04 2 6g和柠檬酸钠2 20mgo优选的，步骤(a)中，所述发酵的发酵温度为28 37°C。优选的，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂使用前经过预处理，所述预处理为将所述大孔吸附树脂浸没在体积分数为30 60%的乙醇溶液中12 Mh。优选的，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂的体积占所述吸附柱内容物总体积的分数为4 20%O优选的，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，平均孔径AVE为150 300。优选的，步骤(b)中，所述吸附柱的使用方式为多个并联使用、单独使用或者交替使用。优选的，步骤(b)中，所述吸附柱的材质为可高温灭菌处理的材料。优选的，所述可高温灭菌处理的材料为金属、陶瓷或玻璃。与现有技术相比，本发明将大孔树脂吸附和伯克氏菌发酵生产Thailand印sin A 相结合，产物的发酵合成和吸附分离同时进行，具有以下有益效果
(1)通过Thailand印sin A产物的吸附原位分离，可以有效解除产物对发酵过程的负反馈抑制，大幅提高iThailand印sin A的发酵产量。(2)将发酵产物Thailand印sin A吸附到大孔吸附树脂上，节省了后续分离工艺的时间和资源，产物的后处理更为简单、方便。(3)连续发酵过程中容易实现培养基及营养成分的流加，有助于产量的提高。(4)连续吸附耦合发酵装置制作较为简单、成本低，循环顺畅，操作方便，易于实现自动化，可以有效降低生产成本、提高生产效率；本工艺适合大规模生产应用。(5)连续吸附耦合发酵过程将吸附过程和发酵过程分离，从而便于进一步对吸附过程和发酵过程分别进行精细化控制，从而具有进一步提高生产效率的潜力。
图1为连续吸附耦合发酵生产抗癌物质Thailand印sin A的工艺流程其中1、发酵罐，2、吸附柱，3、空气压缩机，4、流加补料瓶，5、酸碱平衡补料瓶，6、恒流泵，7、三通阀。
具体实施例方式下面结合说明书附图和具体实施例做进一步的阐述
实施例1，不同循环流速条件下Hiailandepsin A的连续吸附耦合发酵 (一)仪器设备及原材料
德国赛多利斯BIOSTAT A plus 5L机械搅拌发酵罐、上海锦欣SunSource OLFlOOAFm 噪音无油空气压缩机、保定兰格BT-100恒流泵、日本三洋电子MLS-3780高压蒸汽灭菌器、 德国诺尔(KNAUER) Smartline 1000高效液相色谱仪(HPLC)。发酵菌株为伯克氏菌似64(.Burkholderia thailandensis E264,ATCC 700388)， 大孔吸附树脂选用三菱化学大孔吸附树脂HP-20。
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( 二 )伯克氏菌E264连续吸附耦合发酵
如图1所示，连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法，包括以下步骤
(1)伯克氏菌E264种子活化培养伯克氏菌E264种子经过一级固体种子保种、二级液体种子活化、三级液体发酵种子活化，活化用于发酵罐放大发酵所用的伯克氏菌E264菌种；
(2)连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌往吸附柱2中倒入预处理(所述预处理方法为浸没于30%乙醇溶液中12h)过的大孔吸附树脂(为非极性大孔树脂，平均孔径AVE为 200)，添加量为4%，接口密封连接；往发酵罐1罐体中倒入发酵罐放大培养基(所述发酵罐放大培养基包括葡萄糖10g/L、胰蛋白胨35g/L、氯化钠lg/L，K2HPO4. 3H20 15g/L，KH2PO4 2g/L，柠檬酸钠ang/L)，装液量50% ；将发酵罐1分别和流加补料瓶4和酸碱平衡补料瓶5 连接，将发酵罐1和吸附柱2连接，使整个装置内部形成循环通路；将装置进行高温蒸汽灭菌。(3)发酵罐放大培养将活化后的伯克氏菌E264菌种通过注射法接种于发酵罐 1中，整个过程保证无菌操作；开启通气、搅拌、温控等发酵罐放大培养过程。发酵温度为 28°C。(4)吸附耦合循环开启当发酵罐中Thailand印sin A和菌体浓度达到一定程度， 即发酵30小时，处于对数生长的中后期，开启循环用的恒流泵6，以一定流速将发酵液从发酵罐1输出，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而实现产物和细胞及发酵液的分离，解除产物对发酵的抑制作用，细胞和发酵液通过管路返回发酵罐1，保持循环流畅。根据需要， 通过恒流泵6和流加补料瓶4以及酸碱平衡补料瓶5，定时向发酵罐补料和保持酸碱平衡。 发酵过程中可通过三通阀7取样分析，判断生长速率。(5)发酵结束，回收产物经较长时间(5天)连续发酵后，发酵接近终点 (Thailand印sin A合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵12 36小时后)时，将吸附柱2中树脂取出烘干，用于后处理进行提取制备；用有机溶剂将产物Thailand印sin A萃取析出，供后续检测或使用；亦可将烘干的树脂保存，以保藏发酵产物抗癌物质 Thailandepsin A0在本实施例中，种源条件接种量1%，活化后的二级液体种子；通气条件 8. 38 X IO"3 S-1 ；罐压 0. OlMPa ；循环流速分别采用 20ml/min、40ml/min 和 60ml/min 的变
量梯度。发酵结束后，取出吸附柱中吸附有Thailand印sin A产物的树脂，烘干后取样用氯仿萃取，量取部分萃取液蒸干。采用高效液相色谱法(HPLC)取样检测，流动相为乙腈0. 1% 乙酸水=40 :60，流速为1. OmL/min，检测波长为210nm，进样20 μ L0实验结果为，循环流速20ml/min实验组Thai land印sin A产量为106 mg/L，是间歇发酵对照组45 mg/L的2. 3倍，平均生产效率为0. 63 mg/L^T1，是对照组0. SSmg/L^1 的1. 8倍；循环流速40ml/min实验组Thai land印sin A产量为85 mg/L,是间歇发酵对照组45 mg/L的1. 9倍，平均生产效率为0. 51 mg/L^T1，是对照组0. SSmg/L^1的1. 5倍；循环流速60ml/min实验组Thai land印sin A产量为86 mg/L,是间歇发酵对照组45 mg/L的 1. 90倍，平均生产效率为0. emg/L^T1，是对照组0. 35mg/L*h^的1. 5倍。实施例2，不同吸附开始时间条件下Thailandepsin A的连续吸附耦合发酵本实施例同实施例1，所不同之处在于在伯克氏菌E264连续吸附耦合发酵
步骤(2)中往吸附柱2中倒入预处理过的大孔吸附树脂，添加量为12%，往发酵罐1罐体中倒入发酵罐放大培养基，装液量65% ；所述发酵罐放大培养基包括葡萄糖20g/L、胰蛋白胨 20g/L、氯化钠 2. Og/L，K2HPO4. 3H20 22. 5g/L、KH2PO4 4g/L、柠檬酸钠 llmg/L ；所述预处理方法为浸没于45%乙醇溶液中18h ；所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，平均孔径 AVE 为 200。步骤(3)中发酵温度为32°C ；
步骤(4)中分别在发酵进行到48h、3^!后，开启循环用的恒流泵6 ； 步骤(5)中较长的连续发酵时间为8. 5天；
种源条件接种量1%，三级液体发酵种子；通气条件8. 38 ΧΙΟ"3 s—1 ；罐压0. OlMPa ；连续吸附循环流速20ml/min。实验结果为，循环开启时间48h实验组Thailand印sin A产量为108 mg/L，是间歇发酵对照组45 mg/L的2. 4倍，平均生产效率为0. 71 mg/L^T1，是对照组0. Slmg/L^1的 2. 3倍；循环开启时间3 实验组Thailand印sin A产量为116 mg/L，是间歇发酵对照组46 mg/L的2. 5倍，平均生产效率为0. Ibmg/L·^1,是对照组0. 35mg/L*h^的2. 4倍。^MM 3，不同葡萄糖流加条件下Thailandepsin A的连续吸附耦合发酵本实施例同实施例1，所不同之处在于
在伯克氏菌E264连续吸附耦合发酵
步骤(2)中往吸附柱2中倒入预处理过的大孔吸附树脂，添加量为20%，往发酵罐1罐体中倒入发酵罐放大培养基，装液量80% ；所述发酵罐放大培养基包括葡萄糖15g/L、胰蛋白胨 40g/L、氯化钠 4g/L、K2HPO4. 3H20 30g/L、KH2PO4 6g/L、柠檬酸钠 20mg/L ；所述预处理方法为浸没于60%乙醇溶液中Mh ；所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，平均孔径AVE为 290-300。步骤(3)中发酵温度为37°C ；
步骤(4)中在发酵进行到3 后，开启循环用的恒流泵6 ； 步骤(5)中较长的连续发酵时间为12天；
发酵条件为种源条件接种量1%，三级液体发酵种子；通气条件8. 38 X ΙΟ"3 s—1 ；罐压 0. OlMPa ；循环流速20ml/min ；葡萄糖流加条件采用两组变量梯度从60h起，每1 流加 lg/L的葡萄糖，直至发酵结束；从60h起，每1 流加2g/L的葡萄糖，直至发酵结束。实验结果为，60h起每12h补糖lg/L实验组Thailand印sin A产量为224 mg/L, 是不补糖对照组115 mg/L的1. 9倍，平均生产效率为1. 10 mg/L^T1，相比不补糖对照组 0. 74mg/L*h_1 提高了 48. 6% ； 60h 起每 12h 补糖 2g/L 实验组 Thailand印sin A 产量为 219 mg/L，是不补糖对照组115 mg/L的1. 9倍，平均生产效率为1. 07 mg/L^T1，相比不补糖对照组 0. 74 mg/I^h-1 提高了 44. 6%。在本发明中，吸附柱采用可进行高温灭菌处理的材料，优选金属、陶瓷或玻璃，其还可以根据发酵液处理量大小，可以多个并联，或单独使用，或交替使用。结合上述实施例的实验结果可知，本发明的方法可实现Thailand印sin A的连续、 高密度吸附耦合发酵，且设备制作简单、成本低，操作方便，易于实现自动化，具有良好的应用前景。
权利要求
1.一种连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将产生Thailand印sinA的伯克氏菌经种子活化培养，接入发酵罐中，发酵；(b)当发酵罐中Thailand印sinA和菌体浓度达到一定程度，即发酵30 48小时， 处于对数生长的中后期，将发酵液连续输入吸附柱，利用吸附柱中的大孔吸附树脂吸附 Thailand印sin A，经吸附后的发酵液返回发酵罐继续发酵；(c)以流加方式向发酵罐中补充葡萄糖，维持Thailand印sinA的不断合成；(d)在Thailand印sinA合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵12 36小时后，终止发酵，取出大孔吸附树脂，萃取分离，提纯，得到Thailand印sin A。
2.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵罐中，加入放大培养基的体积占发酵罐罐体装液量体积的分数为 50 80%。
3.根据权利要求2所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述放大培养基每升含以下质量的各组分葡萄糖10 20g、胰蛋白胨 20 40g、氯化钠 0 5g、K2HPO4. 3H20 15 30g、KH2PO4 2 6g、柠檬酸钠 2 20mg。
4.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵的发酵温度为观 37°C。
5.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂使用前经过预处理，所述预处理为将所述大孔吸附树脂浸没在体积分数为30 60%的乙醇溶液中12 Mh。
6.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂的体积占所述吸附柱内容物总体积的分数为4 20%。
7.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，平均孔径AVE为150 300。
8.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述吸附柱的使用方式为多个并联使用、单独使用或者交替使用。
9.根据权利要求1所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述吸附柱的材质为可高温灭菌处理的材料。
10.根据权利要求9所述的连续吸附耦合发酵生产Thailand印sinA的方法，其特征在于，所述可高温灭菌处理的材料为金属、陶瓷或玻璃。
全文摘要
本发明公开了连续吸附耦合发酵生产ThailandepsinA的方法，步骤为产生抗癌物质ThailandepsinA的伯克氏菌经种子活化培养，接入发酵罐发酵；在发酵罐中ThailandepsinA和菌体浓度达到一定程度，即发酵30～48小时，处于对数生长的中后期时，将发酵液连续通过吸附柱，利用其内部的大孔吸附树脂吸附ThailandepsinA，经吸附后的发酵液返回发酵罐继续发酵；以流加方式往所述发酵罐中补充葡萄糖，维持ThailandepsinA的不断合成；最后终止发酵；取出大孔吸附树脂，萃取分离、提纯ThailandepsinA。本发明实现ThailandepsinA的连续、高密度发酵，提高发酵产量，延长发酵周期，同时由于可从大孔吸附树脂中有效回收产物ThailandepsinA，简化后处理工艺，大大降低生产成本。
文档编号C12P21/04GK102321713SQ201110271108
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者张雪洪, 程义强, 钟鸣 申请人:上海交通大学, 清安医药科技武汉有限公司