专利名称：以扬麦16为受体的转基因植株快速再生的培育方法
技术领域：
本发明涉及转基因植株快速再生的培育方法，尤其是一种以杨麦16为受体的转基因植株快速再生的培育方法。
背景技术：
小麦是禾本科(Gramineae)小麦属(Triticum) —年生或多年生草本植物，是世界性的重要粮食作物。全世界约有35% 40%的人口以小麦作为主要粮食(金善宝.中国小麦学[M].北京中国农业出版社，1996:广3.)。我国小麦是仅此于水稻的第二大粮食作物，常年种植面积在2. 7X108hm2左右，占全国耕地面积的30%左右。用植物基因工程技术进行小麦遗传改良，提高小麦的产量、改善小麦的品质、增强小麦的抗病虫和抗逆能力，是小麦遗传育种的一个新的发展方向。扬麦16 (原名扬0-1沈)，系江苏省里下河地区农科所与国家小麦改良中心扬州分中心，用“扬91F138”和“扬90-30”经杂交育成的春性中熟高产多抗的小麦良种。2004年经江苏省农作物品种审定委员会审定通过，2005年在苏州丰产示范方核产，平均产量4 687. 5 kg/hm2，较对照扬158小麦增产337. 5 kg/hm2，增产7. 8%。经多年多点试验示范种植，表现出高产、稳产、优质、多抗、适应性强等优势，是江苏省近年来主要推广的小麦优良品种。植物基因工程技术可以按照需要，将不同物种来源的目的基因进行人工重组和遗传转移，打破了物种间基因交流的界限；能够克服远缘杂交造成的不结实、不育，充分利用基因资源，缩短育种周期。自1983年获得第一株转基因烟草以来，植物转基因技术发展迅速。目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目标涉及到高产、优质、抗病虫及抗逆境等诸多方面。大豆、玉米、油菜、棉花等转基因作物已进入商品化生产，取得了显著的经济和社会效益，转基因作物种植面积每年都以10%以上的速度递增，由1996年的170万公顷增加到2007年的1.143亿公顷(喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志.小麦转基因技术研究及其应用.中国农业科学2010,43(8) :1539-1553)。由于受到转基因技术的限制，小麦转基因研究滞后于其它作物。小麦是最后一个转化成功的重要禾谷类粮食作物，一方面由于小麦属于六倍体作物，遗传背景复杂，基因组相对较大(约16 000 Mb),是玉米的7倍，水稻的35倍；另一方面，小麦遗传转化过程中DNA 导入频率低且转化后再生能力不高，有较强的基因型依赖性(喻修道，徐兆师，陈明，李连城，马有志.小麦转基因技术研究及其应用.中国农业科学2010,43(8):1539-1553.)。直到1992年Vasil等将⑶S/Bar基因导入小麦品种I^avon，并获得了抗除草剂Basta的再生植株，才宣告世界上首例转基因小麦的问世。在国内，Cheng等在1997年成功获得可育的转基因植株，1999年Xia等在中国首次报道获得了稳定胚性组织的转基因小麦植株。此后小麦的转基因研究发展很快，并取得了一定的成就，但与双子叶植物相比，甚至与其他禾谷类作物(如玉米和水稻)相比，仍然存在较大的差距(叶兴国等，2000)。目前，小麦转基因技术仍处于建立和优化阶段。其中一个重要的原因是缺乏有效的离体再生体系，小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性强的问题一直是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的主要因素。目前转基因小麦90%以上是用基因枪法获得的。基因枪法转化是将外源基因在Ca2+或亚精胺等作用下吸附在重金属金或钨粒子表面(直径Ium左右)，制成DNA微弹，利用基因枪将微弹高速射入植物受体细胞，引起微弹上吸附的DNA分子整合到植物基因组中，然后通过组织培养技术，再生植株，从而实现外源基因的遗传转化。在进行基因枪轰击后，小麦幼胚能否长出胚性愈伤组织是转基因小麦成苗的关键因素之一。因为小麦幼胚在经过基因枪轰击后，组织会受到一定损伤，再生能力会大大下降，随着基因型的不同，小麦自身的修复和抵御伤害的能力也有所不同。所以，选择良好基因型的小麦幼胚作为轰击对象是进行基因枪遗传转化的首要条件。只有具有优良基因型的转基因小麦品种才具有广阔的研究价值和生产价值。基因枪法是应用于单子叶植物最常用的遗传转化的方法，基因枪法可选用未成熟胚或未成熟胚诱发的愈伤组织作为靶组织。基因枪法应用于大麦、小麦、玉米、燕麦及水稻等，都获得了转基因植株。基因枪法获取转基因植株通常需费时10至15个月 (Gordon-Kamm, 1990;Vasil等，1992)。即使选用未成熟胚作为靶组织使得转化方法得以改进，但是转基因植株的获得仍需时4至6个月(Vasil等，1992，1993 ；Becker等，1994)。小麦转基因植株再生的培育周期一般较长，主要原因是在传统的转化方法中基因转化操作以后，一般恢复培养2周的时间，导致转化细胞和非转化细胞的大量增殖，而非转化细胞的大量增殖就导致所需筛选除掉非转化细胞的时间相对较长，一些研究采取恢复培养后，对愈伤组织进行多次继代培养，在继代培养的过程中添加筛选试剂，然后再进行分化培养；一些研究采取恢复培养后，直接进行分化培养，由于在基因转化后，恢复培养的时间较长(2周)，因此一般分化筛选2次以上，每次2周，时间在30天以上。在传统方法中，一般的小麦生根培养基为1/2MS培养基，形成3-6条发育良好的根系，一般需要30天左右的时间，导致小麦转基因植株再生的培育周期过长。
发明内容
本发明的目的在于针对小麦转基因植株获得耗时长的问题，一般最少需要4-6 个月，提供一种以扬麦16为受体的小麦快速转基因方法。本发明的目的是这样实现的一种以扬麦16为受体的转基因植株快速再生的培育方法，对转基因后的愈伤组织进行恢复培养、分化筛选、生根培养，其特征在于包括基因转化，以及对转基因后的愈伤组织进行恢复培养、分化筛选和生根培养，其特征在于在进行基因转化时同时导入bar基因或Hyg基因，在分化筛选培养基中添加与bar基因或Hyg 基因对应的筛选试剂，在愈伤组织恢复培养后通过分化筛选培养基对愈伤组织进行一次分化筛选，再转入生根培养基，使整个转基因再生植株的培育缩短至45飞0天，具体方法是
a)将扬麦16幼胚在愈伤组织诱导培养基上培养5天，在高渗培养基培育4-5小时， 进行基因转化时同时导入bar基因或Hyg基因，再在高渗培养基培育10-15小时，最终完成前期的基因转化；
b)基因转化后在愈伤组织诱导培养基上培养7天，再转移至分化筛选培养基；
c)在分化筛选培养基上培养15-20天，获得转基因再生幼苗；
d)再生幼苗转到生根培养基上，培养13-16天，形成发育良好的根系，获得完整的转基因再生植株；
所述的分化筛选培养基为V2MS培养基+1. 5 mg/L NAA +1.5 mg/L KT +20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝胶，PH调至6. 0 ；其中，V2MS培养基为MS基本培养基的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的含量减半；当筛选标记基因为bar基因时，分化筛选培养基中添加3 mg/L Basta ；当筛选标记基因为Hyg基因时，分化筛选培养基中添加25 mg/L的潮霉素；
所述的生根培养基为1/2MS培养基+ 1 mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝胶，PH调至6.0。在本发明中所述的愈伤组织诱导培养基为改良的MS培养基，具体配方为改良 MS 培养基 + 2-4 mg /L 2，4_D + l_2g/L VBl + 150mg/L 谷氨酰胺 +30g/L 蔗糖 + 3 g/ L植物凝胶，PH调至6. 0 ；其中，改良MS培养基是指添加MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐，而不添加MS基本培养基的有机物质；植物凝胶为Wiytogel或Gelrite ；所述的高渗培养基为在愈伤组织诱导培养基中添加0. 2M山梨醇和0. 2M甘露醇，PH调至6. 0。本发明的优点在于以具有优良的基因型小麦新品种杨麦16为受体，由于在愈伤组织恢复培养后通过分化筛选培养基对愈伤组织进行一次分化筛选大大缩短了转基因植株再生培育过程中分化筛选的时间；由于分化筛选培养基中含有Basta或潮霉素溶液，可以根据需要筛选除掉不含有标记基因bar基因或Hyg基因的非转化愈伤组织或其分化的幼芽；由于生根培养基含有0. 5g/L的麦芽提取物，更有利于转基因再生幼苗生根；由于基因转化操作以后恢复培养1周即转入分化筛选，恢复培养比传统的转化方法时间缩短一半； 由于恢复培养仅为1周，使转化细胞和非转化细胞既有所增殖，但并未大量增殖，有益于在分化筛选时获得较高频率的转基因阳性苗；由于分化筛选仅为一次15天，较传统的转化方法至少缩短15天以上的时间，本发明的综合效果可以使整个转基因再生植株的培育缩短至45飞0天，比传统的转基因再生植株培育方法需要4至6个月的周期，具有明显的技术优势。外源基因的转化频率在1%左右，建立了一种快速的小麦转基因方法。
图1转基因幼苗分化筛选图； 图2转基因幼苗生根图3在单子叶植物中高效表达的载体pAHC25-c/7r示意图4转基因再生植株的分子检测图；其中1-8为转化后再生植株；9为阴性对照 (扬麦 16) ；10 为阳性对照(pAHC25-c/7r 质粒)；11 为 DL2000 Marker。
具体实施例方式实施例1
供试受体小麦杨麦16的种子愈伤组织诱导培养基
改良 MS 培养基 + 2-4 mg /L 2，4_D + l_2g/L VBl + 150mg/L 谷氨酰胺+30g/L 蔗糖+ 3 g/L植物凝胶，pH调至6. 0。其中改良MS是指添加MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐，而不添加MS 基本培养基的有机物质；植物凝胶为Wiytogel或者Gelrite (下同)
供试取胚受体小麦杨麦16的种子于2010年8月底9月初播于盆中，此后每半月播一批，共4批。平均温度低于15°C时，苗移入温室。取开花后12-14天的幼嫩种子，置于1升的烧杯中，用酒精含量为75%溶液浸泡1分钟，用无菌水冲洗一次，再用升汞含量0. 1%的表面消毒液消毒20分钟，用无菌水水洗六次。剥取Imm大小的幼胚，盾片向上放置于愈伤诱导培养基上，一般每个培养皿放置100个胚。置于黑暗的条件下培养，温度^TC。实施例2 髙渗培养基
在实施例1中的愈伤组织诱导培养基中添加0. 2M山梨醇和0. 2M甘露醇，PH调至6. 0。筛选标记基因为bar基因。转基因研究中，选择合适的筛选标记基因和适当浓度的筛选试剂是转基因成功的重要保证。迄今为止，转基因研究中使用的选择标记基因有50多个，以卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和草丁膦抗性基因应用居多。除草剂Basta的有效成分为Wiosphinothricin (PPT)结构类似谷氨酸，能竞争地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶的活性，导致细胞由于NH4+累积而中毒死亡。PPT乙酰转移酶(Phosphinothricin -acetyltransferase，PAT)可以使PPT乙酰化而使除草剂失活。编码PAT酶的bar基因是从细菌hygrocopicus中克隆出来的。转化进力ar基因的细胞、组织和植株具有抗除草剂Basta的特性。基因枪为Bio-Rad公司PDS-1000/He型基因枪。基因转化前4-6小时将培养5天的幼胚及形成的愈伤组织转入髙渗培养基中暗培养，温度26 0C ο利用轰击压力IlOOpsi轰击幼胚及幼胚形成的愈伤组织，金粉直径为lMffl。每皿轰击愈伤组织数60-80个，每皿轰击一次。将轰击后的幼胚或愈伤组织在高渗培养基中保留 16-20小时，然后再转入愈伤组织诱导培养基中黑暗条件下恢复培养7天，温度^TC。促进被轰击细胞和组织的恢复以及长出新的愈伤组织，在此过程中，通过传统的方法将外源基因(包括筛选标记基因bar基因)整合进受体的基因组中。具体实施时，筛选标记基因也可以采用潮霉素抗性基因Hyg基因。转化进Hyg基因的细胞、组织和植株具有抗潮霉素的特性
实施例3
分化筛选培养基为V2MS培养基+1. 5 mg/L NAA +1.5 mg/L KT +20g/L蔗糖+ 3 g/ L植物凝胶+3 mg/L Basta, pH调至6. 0 (由于实施例1中的筛选标记基因为bar基因，对应的分化筛选培养基中就含有3 mg/L Basta，当筛选标记基因为Hyg基因时，分化筛选培养基中应该用25 mg/L的潮霉素溶液替代本实施例中的3 mg/L Basta)。具体方法
实施例2中轰击后的愈伤组织转至愈伤组织诱导培养基上恢复培养7天后，转移到分化筛选培养基上，在分化筛选培养基上培养15-20天左右，即可获得l-2cm高的转基因再生幼芽(图1)。实施例4 生根培养基为1/2MS培养基+ 1 mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝胶，pH调至6.0 ；其中=IAMS培养基为MS基本培养基的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质含量减半。
将实施例3形成的幼芽接种在生根培养基上，7天左右开始有不定根萌发，15天左右平均每株根数可达到3飞条，形成小麦转基因再生幼苗(图2)。整个转基因植株的再生培育全过程，包括幼胚愈伤组织的诱导、轰击幼胚形成的愈伤组织、转基因后的愈伤组织进行恢复培养、分化筛选、和幼苗生根培养，用时计45-60天。实施例5
将实施例4获得使的具有3飞条根的幼苗移栽于由河沙、泥炭土和园土三者按体积比 1 1 1的比例配制的基质中，采取穴盘移栽，半个月左右可获得移栽成活的幼苗。移栽的成活率可以达到95%以上。移栽成活的幼苗即可移植于盆钵，进行常规管理。实施例6
在幼苗移栽时，剪取部分叶片，提取基因组DNA (脱氧核糖核酸)，进行分子检测，分子检测为阳性的幼苗，确定为转基因植株。分子检测为PCR (聚合酶链式反应)分析方法，PCR分析是指根据目的基因的序列设计特异引物，提取待选转基因小麦的基因组DNA，以此为模版对目的基因进行PCR扩增， 能扩增出相应基因片段的植株为阳性转基因植株。发明人从辣椒的花粉中克隆获得了一个高赖氨酸蛋白基因，该基因已在GenBank 注册，登记序列号为EU367999 (孙晓波，2008)。以单子叶植物高效表达载体pAHC25载体作为基本载体加以改造构建成在单子叶植物高效的表达载体的pAHC25-c/7r Γ图3)。根据实施例1-5的方法，获得转化后的再生幼苗。在幼苗移栽时，剪取部分叶片，提取基因组 DNA。根据目的基因基因的序列设计特异引物。左端引物
5' -3' GCCGGATCCATGGGTTGTGGGGAATCAAAGCACGCAG 右端引物
5’ -3’ GCCCTGCAGTTAATCTGTTTTCAAATCTGTTGT
以待测幼苗的基因组DNA为模版对目的基因cflr基因进行PCR扩增，能扩增出相应基因片段的植株为阳性转基因植株。在图4中，1-8为转化后再生植株PCR扩增结果，9为阴性对照受体扬麦16 PCR扩增结果，10为阳性对照pAHC25-cflr质粒PCR扩增结果。11为 DL2000 Marker。3、4、5、7、8号植株能扩增出与阳性对照pAHC25_c/7r质粒相同的基因片段，确定为转基因植株。1、2、6号植株与阴性对照受体扬麦16 —样不能扩增出与阳性对照 pAHC25-cflr质粒相同的基因片段，确定为非转基因植株。
权利要求
1.一种以扬麦16为受体的转基因植株快速再生的培育方法，包括基因转化，以及对转基因后的愈伤组织进行恢复培养、分化筛选和生根培养，其特征在于在进行基因转化时同时导入bar基因或Hyg基因，在分化筛选培养基中添加与bar基因或Hyg基因对应的筛选试剂，在愈伤组织恢复培养后通过分化筛选培养基对愈伤组织进行一次分化筛选，再转入生根培养基，使整个转基因再生植株的培育缩短至45飞0天，具体方法是a)将扬麦16幼胚在愈伤组织诱导培养基上培养5天，在高渗培养基上培育4-5小时，进行基因转化时同时导入bar基因或Hyg基因，再在高渗培养基上培育10-15小时，最终完成前期的基因转化；b)基因转化后在愈伤组织诱导培养基上培养7天，再转移至分化筛选培养基；c)在分化筛选培养基上培养15-20天，获得转基因再生幼苗；d)再生幼苗转到生根培养基上，培养13-16天，形成发育良好的根系，获得完整的转基因再生植株；所述的分化筛选培养基为V2MS培养基+1. 5 mg/L NAA +1.5 mg/L KT +20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝胶，PH调至6. 0 ；其中，V2MS培养基为MS基本培养基的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的含量减半；当筛选标记基因为bar基因时，分化筛选培养基中添加3 mg/L Basta ；当筛选标记基因为Hyg基因时，分化筛选培养基中添加25 mg/L的潮霉素；所述的生根培养基为1/2MS培养基+ 1 mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝胶，PH调至6.0。
2.根据权利要求1所述的以扬麦16为受体的转基因植株快速再生的培育方法，其特征在于所述的愈伤组织诱导培养基为改良的MS培养基，具体配方为改良MS培养基+ 2-4 mg /L 2,4-D + l-2g/L VBl + 150mg/L 谷氨酰胺+30g/L 蔗糖 + 3 g/L 植物凝胶，PH 调至 6. 0 ；其中，改良MS培养基是指添加MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐，而不添加 MS基本培养基的有机物质；植物凝胶为Wiytogel或Gelrite ；所述的高渗培养基为在愈伤组织诱导培养基中添加0. 2M山梨醇和0. 2M甘露醇，PH 调至6.0。
全文摘要
本发明涉及一种以扬麦16为受体的转基因植株快速再生的培育方法，对转基因后的愈伤组织进行恢复培养、分化筛选、幼苗生根培养，其特征在于在进行基因转化时同时导入bar基因或Hyg基因，在分化筛选培养基中添加与bar基因或Hyg基因对应的筛选试剂，在愈伤组织恢复培养后通过分化筛选培养基对愈伤组织进行一次分化筛选，分化的幼苗转入生根培养基，使整个转基因再生植株的培育缩短至45~60天，将在传统的小麦转基因方法中转基因再生植株获得时间由4-6个月，缩短至1个半月至2个月的时间，外源基因的转化频率在1%左右。
文档编号C12N15/82GK102321663SQ20111027112
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者余桂红, 周淼平, 孙晓波, 张旭, 蒋苏, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院