专利名称：多重pcr快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法。
背景技术：
目前国际上公认的李斯特菌共有6种单核细胞增生李斯特菌(lis teria mwocj^ow/ ^，简称单增李斯特菌)、绵羊李斯特菌(listeria ivanovii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)lif {Listeria welshimeri)lif {Listeria grayi)和西尔李斯特菌(listeria seeligcri).其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4 ！的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一； 绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；英诺克李斯特菌在近期国内外报道存在食品中，对人类具有一定的潜在致病性。尤其在发生由非溶血性变为溶血性的变异时，有致病的潜力；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。从上世纪80年代起，美国、日本、新西兰、德国、英国、法国、欧洲等国家多次因食品污染爆发人类李斯特菌病。至2003年，我国有报道的散发性李斯特菌病例150例，死亡率269L 2008年，加拿大共发生57起李斯特菌感染，造成23人死亡。目前，鉴定李斯特菌的方法主要分为两类一类是传统的生化鉴定方法，包括微量生化反应方法和血清学方法等。另一类是分子生物学方法，包括普通PCR方法和实时荧光 PCR方法等。传统方法费时、费力，且实验重复性相对较低，但其准确性使很多国家在制定标准时依然采用传统方法。分子生物学方法鉴定细菌具备快速、简便的特点，但在准确性和特异性方面尚有需要改进之处。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法；本发明是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高效率，节约时间，而且节省检测成本。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤1)首先选择5条上游引物和1条下游引物；2)取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3) 分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4)取扩增后的产物5 μ L点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5)结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出230 250 bp 条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650 660 bp条带的， 判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460 470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360 370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860 870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为 上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ；
上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。所述的PCR 反应条件如下95 °C变性 3 min ；95 "C 15 s、58 "C 30 s、72 "C 45 s, 进行30个循环扩增；72 °C延伸5 min。所述PCR反应体系如下
IOX扩增缓冲液5 μ 1 ；(购于FERMENTAS)
4种dNTP混合物各200 μ mol/L ；
引物各 0.5 μ mol/L ；
DNA 模板2 μ g ；
Taq DNA聚合酶2 u ；(购于生工生物工程(上海)有限公司)
MgCl21. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至50 μ 1 ；
其中所述的4种dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸 dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP，脱氧胞苷三磷酸dCTP。(购于Bio Basic Inc)
所述的扩增缓冲液配方为:pH 8.8，25°C，100 mM Tris-HCl ；500 mM, KCl ；0.8%(ν/ν), 乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40)。 所述的阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板的方法为取5种李斯特菌(ATCC33090英诺克李斯特菌，CMCC54002单核增生李斯特菌，ATCC19119绵羊李斯特菌，ATCC35897威尔李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌) 的标准菌株细菌培养液1 ml (购于上海复祥生物公司)或者是待检菌液1 ml，置于无菌的 1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μ 1裂解液混勻，置于37 °C水浴1 h;然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化钠溶液，混勻后于13000 rpm离心15 min ；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积，3 mol/L，pH8. 0的醋酸钾，-20 °C保存1 h后，13000 rpm离心 15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μ 1 TE溶液(购于上海索莱宝生物科技有限公司)中，置4 °C保存备用。所述的裂解液配方为40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA, 1%十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7.8。 本发明的有益效果为本发明建立了利用多条引物
5竞争性退火的多重PCR方法检测和鉴别5种李斯特菌的方法，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度大大提高。由于本方法经一次PCR即可鉴别5种李斯特菌，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。综上所述本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法具有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和分析。
图1为本发明标准菌株的多重PCR扩增产物电泳图；其中1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5、英诺克李斯特菌，M、2000 bp DNA Ladder Marker ；
图2为本发明实施例1的样品检测的多重PCR电泳图；其中1、单增李斯特菌，2、威尔李斯特菌，3、绵羊李斯特菌，4、英诺克李斯特菌，5、格氏李斯特菌，6、样品，N、阴性对照， M、2000 bp DNA Ladder Marker。
具体实施例方式实施例1
特异性引物和标准菌株鉴定实验 1)、引物
根据Genebank中公布的5种李斯特菌(单增李斯特菌，绵羊李斯特菌，英诺克李斯特菌，威尔李斯特菌，格氏李斯特菌)iap基因序列的保守区和可变区，以及相关文献，使用 Primer5. 0软件设计引物；经预实验选择5条上游引物(MonoA、Ino2, WelD, GraU IvaA)和 1条下游引物(IislB)为最佳组合，引物序列如下 上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ； 上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，
引物由大连宝生物工程有限公司合成；预期扩增的片段大小分别为格氏李斯特菌 230 250 bp，单增李斯特菌650 660 bp，威尔李斯特菌460 470 bp，绵羊李斯特菌 360 370 bp，英诺克李斯特菌860 870 bp。2)、阳性对照标准菌液的DNA模板的制备
取5种李斯特菌(ATCC33090英诺克李斯特菌，CMCC54002单核增生李斯特菌， ATCC19119绵羊李斯特菌，ATCC35897威尔李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌)的标准菌株细菌培养液1 ml，置于无菌的Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μ 1裂解液(40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%SDS，pH7. 8)混勻，置于 37 °C水浴 1 h ；然后加入 200 μ 1 5 mol/L的氯化钠溶液，混勻后于13000 rpm离心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提 1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 mol/L, pH8. 0)，-20 °C保存1 h后，13000 rpm离心15 min,弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μ 1 TE溶液中，置4 °C保存备用。 3)、在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；
所述PCR反应体系如下
IOX 扩增缓冲液 5 μ 1 ；(购于 FERMENTAS ；100 mM Tris-HCl (pH 8. 8，25°C )，500 mM KCl, 0. 8%(v/v) Nonidet Ρ40) 4 种 dNTP 混合物各 200 μ mol/L ；
引物各 0.5 μ mol/L ；
DNA 模板2 μ g ；
Taq DNA聚合酶2 u ；
MgCl21. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至50 μ 1 ；
其中所述的4种dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸 dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP，脱氧胞苷三磷酸dCTP。PCR反应条件如下
95 °C 变性 3 min ；95 °C 15 s、58 °C 30 s、72 °C 45 s，进行 30 个循环扩增；72 °C 延伸 5 min。4)取扩增后的产物5 μ L点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，以 2000 bp Marker为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于0. 5 X TBE电泳缓冲液中电泳30 min ；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；结果如图1。实验表明5种李斯特菌分别产生长度差异显著的特异性扩增条带。5) PCR产物的序列鉴定
切下含有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒(TAKARA)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致 格氏李斯特菌230 250 bp，单增李斯特菌650 660 bp，威尔李斯特菌460 470 bp，绵羊李斯特菌360 370 bp，英诺克李斯特菌860 870 bp。实施例2
冻猪肉样品培养物(经生化鉴定为单增李斯特阳性)检测实验 1)样品DNA模板的制备
取疑似菌落的细菌培养液1 ml，置于无菌的1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm 离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μ 1裂解液(40 mmol/ L Tris-醋酸，20 mmol/L 醋酸钠，1 mmol/L EDTA, 1%SDS, ρΗ7· 8)混勻，置于 37 °C水浴 1 h ；.然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化钠溶液，混勻后于13000 rpm离心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 mol/L， pH8. 0)，-20 °C保存1 h后，13000 rpm离心15 min,弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μ TE溶液中，置4 °C保存备用。2)、在待检样品菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行 PCR扩增反应；
所述PCR反应体系如下
7IOX 扩增缓冲液 5 μ 1 ；(购于 FERMENTAS ； 100 mM Tris-HCl (pH 8. 8，25°C )，500 mM KCl, 0. 8%(v/v) Nonidet Ρ40) 4 种 dNTP 混合物各 200 μ mol/L ；
其中所述的4种dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸 dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP，脱氧胞苷三磷酸dCTP。
PCR反应条件如下
95 °C 变性 3 min ；95 °C 15 s、58 °C 30 s、72 °C 45 s，进行 30 个循环扩增；72 °C 延伸3)取扩增后的产物5 μ L点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，以 2000 bp Marker为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于0. 5 X TBE电泳缓冲液中电泳30 min ；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；结果如图2。4)结果判定，实验表明冻猪肉样品中含有单增李斯特菌。待检样品与阳性对照同时扩增出230 250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650 660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出 460 470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360 370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860 870 bp 条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。同时对PCR产物的序列鉴定切下带有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒(TAKARA)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致。
引物 DNA模板 Taq DNA聚合酶 MgCl2
各 0.5 μ mol/L ； 2 Ug； 2 u ；
1. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至
50 μ 1 ；
权利要求
1.一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于包括如下步骤1) 首先选择5条上游引物和1条下游引物；2)取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3)分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组 DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4)取扩增后的产物5 μ L点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5)结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出 230 250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650 660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460 470 bp 条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360 370 bp条带的， 判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860 870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。
2.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ； 上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。
3.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的PCR反应条件如下95 °C变性3 min ；95 °C 15 s、58 °C 30 s、72 °C 45 s，进行 30个循环扩增；72 °C延伸5 min。
4.如权利要求3所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述PCR反应体系如下IOX扩增缓冲液5 μ ;4种dNTP混合物各200 μ mol/L ；引物各 0.5 μ mol/L ；DNA 模板2 μ g ；Taq DNA聚合酶2u ；MgCl21. 5 mmol/L ；加双蒸水至50 μ 1 ；其中所述的4种dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸 dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP，脱氧胞苷三磷酸dCTP。
5.如权利要求4所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的扩增缓冲液配方为:pH 8.8，25°C，100 mM Tris-HCl ；500 mM, KCl ；0. 8%(v/v)，乙基苯基聚乙二醇。
6.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板的方法为取5种李斯特菌的标准菌株细菌培养液1 ml或者是待检菌液1 ml，置于无菌的1. 5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μ 裂解液混勻，置于37 °C水浴1 h;然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化钠溶液，混勻后于13000 rpm离心15 min ；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积，3 mol/L，pH8. 0的醋酸钾，-20 °C保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μ TE溶液(上海索莱宝生物科技有限公司)中，置4 °C保存备用。
7.如权利要求6所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的裂解液配方为40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7. 8。
全文摘要
本发明公开了了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤1)首先选择5条上游引物和1条下游引物；2)取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3)分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4)取扩增后的产物进行电泳；5)结果判定。本发明是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高了效率，节约时间，而且节省检测成本。
文档编号C12R1/01GK102286631SQ20111027133
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者叶妍妍, 孔繁德, 徐淑菲, 杨俊萍, 郭书林, 陈信忠, 陈垚, 龚艳清 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心