专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及利用 RT-PCR-DHPLC技术进行检测的检测方法及所使用的试剂。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以妊娠母猪繁殖障碍、仔猪和育肥猪出现呼吸道症状为特征的传染病。该病从1987年首次在美国被发现以来，已迅速传播至全世界各个养猪业发达的国家和地区，给世界养猪业造成了巨大经济损失，已被国际兽疫局 (OIE)列为需要通报的B类传染病。我国于1996年首次报道分离到PRRSV，目前该病毒已在我国很多省市猪群发生地方性流行，成为我国猪病的主要病原之一。近两年发生于我国南方的猪“高热病”也与此病原的变异株有关，当时由于诊断不及时，使许多中小猪场倒闭， 给我国养猪业造成了巨大的经济损失，因此建立快速、有效、实用的检测方法是防制PRRS 流行的重要环节。目前，常用的PRRS诊断方法有病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫组织化学法(IHC)等，但存在操作复杂费时、灵敏度或特异性不强等缺点。随着分子生物学技术的发展，RT-PCR也被广泛的用到病毒性疾病的快速诊断中， 此方法简单、方便、快速、敏感，但存在假阳性和PCR污染等弊端。近年来发展起来的实时荧光定量RT-PCR (Real time RT-PCR)技术具有特异性强、灵敏度高、速度快等优点但由于成本高、探针保存时间有限使得该方法应用范围有限。变性高效液相色谱通过对细微差别的 DNA序列可以从毒株水平快速识别病原。本研究旨在根据江西省近期PRRSV流行毒株的序列特点，将PCR-DHPLC技术用于PRRSV的检测，通过特异性、敏感性、重复性试验，并与常规 RT-PCR、荧光定量PCR进行比较，建立一种特异性强、敏感性高的PCR-DHPLC检测新技术，用于PRRS的快速、高通量诊断与监测。
发明内容
本发明的目的在于提供猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其RT-PCR-DHPLC 检测方法。首先，本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒，该试剂盒组成如下 ① 5X 反转录缓冲液，4 μ L、② IOmM dNTP,4 gL、③ 20U/ μ L Rnasin, 1 U L、
④ 200 U/ μ L M-MLV, 1 μ L、⑤ 10 X PCR 缓冲液，2 μ L、⑥ 5U/ U L Taq DNA 聚合酶，
0. 2μ L、⑦ 10 μ M PRRSV 上游引物，1 μ L、⑧ 10 |i M PRRSV 下游引物，2 μ L、⑨ ddH20，
16. 8μ L ；
其中，PRRSV特异性引物序列如下 上游引物:5，- CTGTGCCCTGGCTG CGTT -3，，下游引物:5，- GAGTCTGCCCTTGGT GT -3，。本发明还提供了利用上述试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法，包括如下步骤
1.在20μL的反转录体系中加入待测病毒总RNA 11 μ H,①号剂反转录4 μ 1
，②号剂2 μ],③号剂1 μ ,⑧号剂1 μ]1,70τ水浴10 min后迅速冰浴5 min，快
速加入④号剂1 口31,421水浴1 h，再放于70°C水浴5 min灭活反转录酶，立即置冰上冷却。将反转录后的cDNA置于-20 °C保存备用。2.取上步获得的cDNA 2 yL，加入⑤号剂2yL、②号剂2yL、⑥号剂0.2yL、⑦ 号剂和⑧号剂各ι μ L，⑨号剂16. 8 μ L，总体积25 μ L，5000 r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增
预变性:94°C,3 min ；
进入循环94°C变性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，;35次循环； 终止延伸72°C，7 min ； 4°C保存反应产物。3.将RT-PCR扩增产物进行DHPLC分析
色谱柱=PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱，4. 6 mmX50 mm，粒度 3 ψ- m ； 柱温:50°C ；
流动相(体积比)0. 0 min, 51. 0%缓冲溶液A，49. 0%缓冲溶液B ； 0. 5 min, 45. 7%缓冲溶液A，54. 3%缓冲溶液B ；
2.7 min, 41. 3%缓冲溶液A，58. 7%缓冲溶液B ； 4. 9 min, 38. 7%缓冲溶液A，61. 3%缓冲溶液B ； 7. 1 min, 37. 1%缓冲溶液A，62. 9%缓冲溶液B ； 9. 3 min, 35. 9%缓冲溶液A，64. 1%缓冲溶液B ；
其中，缓冲溶液A是浓度0. ImM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0. IM TEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液； 流速0. 9 mL/min ；
检测器荧光检测器，光源150W Xenon灯；激发谱带宽15 nm ；发射谱带宽15. 3 nm ；检测灵敏度在波长350 nm积分2 s ；
上样量=RT-PCR产物5 UL。
t检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品中是否含有PRRSV。本发明采用RT-PCR-DHPLC技术，针对PRRSV建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测PRRSV，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。
图 1 是 PRRSV RT-PCR-DHPLC 检测谱图。
图2 PCR-DHPLC检测PRRSV的特异性图。图3 PCR-DHPLC检测PRRSV的重复性图。
具体实施例方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。如图1所示，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度 (单位毫伏mV)。病毒RNA提取试剂盒(MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒)；反转录试剂、Ex Taq, 10XPCR buffer, dNIPs等PCR相关试剂购自大连宝生物公司，三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自iTransgenomic公司，乙腈(色谱纯)购自Fisher公司。本部分试验所用的主要仪器和设备包括基因扩增仪(ABI9700，美国ABI公司)， 实时定量PCR扩增仪(Lightcycler 480，瑞士 Roche公司)，核酸抽提纯化系统(MagNA LC2. 0，瑞士 Roche公司)，变性高效液相色谱(简称DHPLC，美国Transgenomic公司)。实施例1、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其检测方法的建立 (1)引物的设计、合成与试剂盒的组装
该试剂盒包含以下组分①5X反转录缓冲液、②IOmM dNTP、③20U/ Li L Rnasin, ④ 200 L μ L M-MLV、⑤ IOXPCR 缓冲液、⑥ OT/ μ L Taq DNA 聚合酶、⑦ 10 μ M
PRRSV上游引物、⑧10 μ M PRRSV下游引物、⑨ddH20 ；
其中，PRRSV特异性引物序列如下 上游引物:5，- CTGTGCCCTGGCTG CGTT -3，， 下游引物:5，- GAGTCTGCCCTTGGT GT -3，。(2) RT-PCR-DHPLC 检测方法
本检测方法使用本实施例建立的检测试剂盒，包括如下检测步骤 A.病毒RNA的提取及质粒标准模板的制备 A. 1病毒RNA的提取及反转录
病毒总RNA用瑞士 Roche公司的核酸抽提纯化系统MagNA LC2. 0配合其总核酸提取试剂盒并按其说明书进行提取，提取的RNA用60 μ L无RNase水溶解沉淀，-20 °C保存备用。在20 _UL·的反转录体系中加入待测病毒总RNA 11 μΙ,①号剂反转录4 μ H,②号剂2 μ 31,③号剂1 μ 31,⑧号剂1 μ L ’ 70°C水浴10 min后迅速冰浴5
min,快速加入④号剂1 μ L· , 42°C水浴1 h，再放于70°C水浴5 min灭活反转录酶，立即
置冰上冷却。将反转录后的cDNA置于-20 °C保存备用。A. 2目的基因的克隆
以合成的cDNA为模板，用合成的克隆用上、下游引物扩增目的片段，扩增产物经电泳鉴定后，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后将目的片段与PGEM-T Easy载体连接，将其转化DH5 α感受态细胞，挑取疑似阳性菌落进行培养，提取重组质粒，对重组质粒进行PCR、酶切鉴定，将鉴定正确的阳性重组质粒菌液送宝生物公司测序验证。B.引物筛选与反应体系优化
检索文献，确定靶基因，从GenBank下载所有靶基因的序列，用Lasergene进行序列比对，并截取最一致的序列设计PCR-DHPLC检测用引物，验证其保守型。调整Taq酶、Mg2+、引物对、引物用量、和循环条件，直至得出最佳反应体系和反应条件。C. PCR扩增条件
反应体系取cDNA 2 yL，加入⑤号剂2yL、②号剂2yL、⑥号剂0. 2 μ L、⑦号剂和 ⑧号剂各1 μ L，⑨号剂16. 8 μ L，总体积25 μ L，5000 r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增 反应条件
预变性:94°C,3 min ；
进入循环941变性608，601退火60s，72°C延伸60s，;35次循环； 终止延伸72°C，7 min ； 4°C保存反应产物。D. DHPLC 分析
色谱柱=PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱，4. 6 mmX50 mm，粒度 3 Ll m ； 柱温:50°C ；
流动相(体积比)0. 0 min, 51. 0%缓冲溶液A，49. 0%缓冲溶液B ；
0. 5 min, 45. 7%缓冲溶液A，54. 3%缓冲溶液B ；
2. 7 min, 41. 3%缓冲溶液A，58. 7%缓冲溶液B ；
4. 9 min, 38. 7%缓冲溶液A，61. 3%缓冲溶液B ；
7. 1 min, 37. 1%缓冲溶液A，62. 9%缓冲溶液B ；
9. 3 min, 35. 9%缓冲溶液A，64. 1%缓冲溶液B ；
其中，缓冲溶液A是浓度0. ImM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0. IM TEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液； 流速0. 9 mL/min ；
检测器荧光检测器，光源150W Xenon灯；激发谱带宽15 nm ；发射谱带宽15. 3 nm ；检测灵敏度在波长350 nm积分2 s ；
上样量rt-pcr产物5 μ 。实施例2、PCR-DHPLC检测方法特异性试验
取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒II型(PCV-2)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病毒(PRV)六种病毒培养液，提取RNA/DNA 进行PCR-DHPLC检测，检测结果仅PRRSV出现扩增吸收峰，结果为阳性；PPV、PCV-2、SIV, CSFV和PRV未出现相应的扩增吸收峰，结果均为阴性。如图2所示1.猪繁殖与呼吸综合征病毒2-6.猪细小病毒、猪圆环病毒II型、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒Fig. 2 Specialty detection of PCR-DHPLC for PRRSV 1. PRRSV 2-6. PPV, PCV-2,SIV, CSFV, PRV。
特异性试验结果表明，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法，适合于 PCR-DHPLC检测的引物可以特异性扩增检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，具有很好的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)鉴定特异性。实施例3、RT-PCR-DHPLC重现性试验
取7个不同时段培养的PRRSV细胞液，提取RNA后，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法进行检测，记录每次测定的出峰时间及峰值，验证PRRSV RT-PCR-DHPLC 法的重复性。检测结果如附图3所示。1-7.猪繁殖与呼吸综合征病毒8. PBSFig. 3 Repeatability detection of PCR-DHPLC for PRRSV 1-7. PRRSV 8. PBS
由图3可见，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均出现扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，阴性对照的检测结果为阴性。结果表明采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法进行检测，具有很好的重现性。实施例4、RT-PCR-DHPLC灵敏度试验
将已制备的PRRSV阳性质粒做10倍梯度稀释，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法进行检测，以此计算出RT-PCR-DHPLC所能检出的最低模板拷贝数，确定本方法的灵敏度。具体稀释浓度依次为1 X107，l XlO6,1 XlO5,1 XlO4,1 XlO3,1 XlO2,1 XlO1 和1拷贝/ μ L的质粒DNA液的标准品，并分别以此为模板进行RT-PCR-DHPLC检测。结
果显示RT-PCR-DHPLC的灵敏度达到10个拷贝/ Li L，结果见表1
表1.猪繁殖与呼吸综合征病毒标准毒株平板计数与RT-PCR-DHPLC检测结果的比较
稀择梯度5RT-PCR-DHPLC检测结果第"弟度Ci χItf拷Μ/ )十第2梯度(1 χ 10:拷贞/μι)十第3梯度Cl X 10;拷页/μι)十第4梯度C1 X ΙΟ^Μ/μ )十第5梯度C1 χ 10:拷 Λ/μι)_ 十_笫6梯度(1 X 10:拷贝/Ul)_ 十_笫7梯度(1 X ICT拷贝/μι)十第8梯度U拷Λ/μ )—
a 7个梯度之间的稀释倍数为10倍。
实施例5、应用于实际样品的检测，并与常规RT-PCR、实时荧光RT-PCR法对比
对16份临床可疑病料进行处理，提取RNA，应用本试验所建立PCR-DHPLC方法与 RT-PCR、实时荧光RT-PCR同时检测，同时设置阳性病料2份(样品编号为P1、P2)和阴性病料2份(样品编号为m、N2)作为对照。4种方法的验证比较结果如表1所示，用RT-PCR检出12份阳性病料，用PCR-DHPLC和荧光PCR方法检测出15份病料PRRSV阳性，采用培养鉴定方法鉴定这16份病料，15份病料为PRRSV阳性，与PCR-DHPLC法、实时荧光PCR法检测的结果一致。与实时荧光PCR法相比，PCR-DHPLC法具有同样的检测灵敏度，能检测出常规 RT-PCR不能检测的病料，该方法具有较好的适用性。表 2 PRRSV PCR-DHPLC 方法与常规 RT-PCR、real-timePCR 方法比较
Tablel Comparison of the detected results of real-time PCR and normal RT-PCR
权利要求
1. 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒，其特征在于包括含以下组分①5XμΧ、② IOmMM-MLV,1 U L 、 μ M PRRSV 上游其中，PRRSV特异性引物序列如下 上游引物:5，- CTGTGCCCTGGCTG CGTT -3，， 下游引物:5，- GAGTCTGCCCTTGGT GT -3，。
2. —种权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法，其特征在于方法步骤为1)在20μL的反转录体系中加入待测病毒总RNA 11 μ ，①号剂反转录4 μL，②号剂2 μ ,③号剂1 μ ,⑧号剂1 μ ，70°C水浴10 min后迅速冰浴5 min，快速加入④号剂1 μ -,，42°C水浴1 h，再放于70°C水浴5 min灭活反转录酶，立即置冰上冷却，将反转录后的cDNA置于-20 ！保存备用；2)取上步获得的cDNA2 yL，加入⑤号剂2yL、②号剂2yL、⑥号剂0.2 μ L、⑦号剂和⑧号剂各1 μ L，⑨号剂16. 8 μ L，总体积25 μ L，5000 r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性:94°C,3 min ；进入循环941变性608，601退火60s，72°C延伸60s，;35次循环； 终止延伸72°C，7 min ；4°C保存反应产物；3)将RT-PCR扩增产物进行DHPLC分析色谱柱=PS-DVB & C18 DNASep 色谱柱，4. 6 mmX50 mm，粒度 3 |1 m ； 柱温:50°C ；流动相体积比0.0 min, 51.0%缓冲溶液A，49.0%缓冲溶液B ；·0. 5 min, 45. 7%缓冲溶液A，54. 3%缓冲溶液B ；·2. 7 min, 41. 3%缓冲溶液A，58. 7%缓冲溶液B ； ·4. 9 min, 38. 7%缓冲溶液A，61. 3%缓冲溶液B ；·7. 1 min, 37. 1%缓冲溶液A，62. 9%缓冲溶液B ；·9. 3 min, 35. 9%缓冲溶液A，64. 1%缓冲溶液B ；其中，缓冲溶液A是浓度0. ImM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0. IM TEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液； 流速0. 9 mL/min ；检测器荧光检测器，光源150W Xenon灯；激发谱带宽15 nm ；发射谱带宽15. 3 nm ；检测灵敏度在波长350 nm积分2 s ；反转录缓冲液，4dNTP，4 μ L、③ 20U/ μ L Rnasin, 1 μ L、④ 200 U/ μ L ⑤ 10XPCR 缓冲液，2 μ L、⑥ 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，0. 2 μ L、⑦ 10 引物，1 μ L、⑧ 10 |i M PRRSV 下游引物，2yL、⑨ ddH20，16. 8yL ；上样量=RT-PCR产物5 Li L。
全文摘要
用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其检测方法。①5×反转录缓冲液、②10mMdNTP、③20U/μLRnasin、④200U/μLM-MLV、⑤10×PCR缓冲液、⑥5U/μLTaqDNA聚合酶、⑦10MPRRSV上游引物、⑧10MPRRSV下游引物、⑨ddH2O。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。
文档编号C12R1/93GK102373300SQ201110271479
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者孙思扬, 李琼, 杨春华, 钟毅 申请人:江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心