专利名称：转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法。
背景技术：
近年来，国内外在转基因作物的培育上已经取得了较大进展，我国在转基因水稻， 特别是抗虫水稻新品系的转育方面居世界先进水平，已经进入了实质性环境释放试验和生产性试验阶段，其大规模产业化应用蓄势待发，很有可能成为世界上率先商品化种植转基因水稻的国家之一。与传统的害虫防治方法相比，转Bt基因水稻抗虫技术不仅具有选择性强、使用安全、投资少、见效快等优点，而且对植物的保护作用具有连续性和全面性，是解决当前粮食问题的首选方法之一。然而，由于转基因水稻具有潜在的生态风险性、可能危及人类健康和引发环境污染等问题，已引起了世界性的“生物安全”论战。就环境安全性而言， 转基因抗虫水稻大规模生产后，其对农田生态系统和自然生态系统可能造成的负面影响是多方面的。如1)外源基因可能通过“基因漂移”和基因水平转移方式，向非转基因生物逃逸导致遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性变化等；幻外源基因表达产物在环境中形成积累，可能导致靶标生物对表达蛋白选择压的增加进而产生抗性或对非靶标生物具有毒害作用；幻可能造成地球化学过程和土壤养分循环的改变，等等。随着转基因水稻种植面积的日益扩大，国际上呼吁人类谨慎对待转基因作物和食品的声音亦有增无减，应严谨和科学地开展转基因水稻的环境安全性的评价研究。因此，有关抗虫转Bt基因水稻的环境安全性研究显得尤为迫切和重要，已成为国内外新的研究热点。土壤是农业生产的载体，转基因作物种植与土壤生态系统间将发生一系列交互作用，客观评价转基因作物对土壤环境的影响是转基因作物研究和发展的重要基础和现实问题。有关转基因水稻的土壤环境安全性评价已成为转基因作物环境安全性评价体系中不可或缺的一环，引起了国内外的高度重视。稻田土壤与水体中生长着种类繁多的土壤动物，它们在稻田生态系统平衡与水稻生长发育等方面扮演着众多独特而重要的角色。稻田中土壤动物的种类繁多、组成极其丰富，特别是土壤原生动物、线虫类、蚯蚓类对土壤中动植物残体分解、污染物降解、土壤理化性质的进化、土壤发育与物质迁移及能量转化等物理、化学过程方面都有重要作用，是农业生态系统的关键环节。土壤动物通过食物链(植物残体、微生物、腐殖质和水等)不断从环境中吸收富集必要的营养和矿质元素，将其转化为土壤有效成分。因此，转基因作物的外源基因及其表达蛋白对土壤动物的影响广受国内外关注。 同时，土壤动物还是表征土壤质量变化的敏感生物指标之一，适合用于土壤生态风险评价。 转基因水稻的安全性问题是全国关注的焦点，它对土壤动物的影响可通过两个方面进行评价，一个是对土壤动物的种群生态是否会产生影响，另一方面需检测转基因水稻对土壤动物的DNA是否会产生影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简便、结论准确的转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法，包括以下步骤1)、转基因抗虫水稻水浸泡液和和非转基因水稻水浸泡液的制备在转基因抗虫水稻秸梗中按照lg/20 30ml的料液比加入蒸馏水，于25 27°C 浸泡3. 5 14天，过滤，得转基因抗虫水稻水浸泡液；在非转基因水稻秸梗中按照上述相同的料液比加入蒸馏水，于上述相同的温度浸泡相同的时间，过滤，得非转基因水稻水浸泡液；即，制备非转基因水稻水浸泡液时的料液比、浸泡温度和浸泡时间完全同制备转基因抗虫水稻水浸泡液时的料液比、浸泡温度和浸泡时间；2)、草履虫母液的培养；将普通水稻秸梗按照lg/20 30ml的料液比加入蒸馏水，煮沸至少0. 5小时，过滤，得普通水稻水浸煮沸液；将大草履虫放入普通水稻水浸煮沸液中进行常规培养(即，培养温度为25 270C )，得草履虫培养母液；草履虫培养母液中草履虫的密度为(0. 8 1. 2) X 103ind/mL ；3)、用转基因抗虫水稻水浸泡液和非转基因水稻水浸泡液分别培养草履虫将草履虫培养母液按照1 90 110的体积比加入至转基因抗虫水稻水浸泡液中作为转基因培养液(即，草履虫培养母液与转基因抗虫水稻水浸泡液的体积比为 1 90 110)，于25 27°C恒温培养6 8天；将草履虫培养母液按照上述相同的体积比加入至非转基因水稻水浸泡液中作为非转基因培养液，于上述相同的温度培养相同的时间；即，制备非转基因培养液时的体积比、培养温度和培养时间完全同制备转基因培养液时的体积比、培养温度和培养时间；4)、草履虫细胞密度的计数从上述步骤幻所述培养的第2天起，每天对上述转基因培养液以及非转基因培养液进行草履虫细胞密度的检测；5)、当上述步骤4)的转基因培养液中的草履虫细胞密度彡lX103ind/mL，取该转基因培养液作为草履虫DNA的损伤检测的转基因细胞培养液；当上述步骤4)的非转基因培养液中的草履虫细胞密度> lX103ind/mL，取该非转基因培养液作为草履虫DNA的损伤检测的非转基因细胞培养液；6)、密度差异进行数据分析将步骤4)所得的非转基因培养液的草履虫细胞密度相对于相同培养天数所得的转基因培养液的草履虫细胞密度进行单因素方差分析，如果P > 0. 05，则继续进行下述步骤7)；如果P < 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全；7)、对草履虫DNA的损伤检测，依次进行以下步骤A)、将转基因细胞培养液制成细胞密度(0. 8 1. 2) X 105ind/mL的转基因细胞悬浮液，将非转基因细胞培养液制成细胞密度相同的非转基因细胞悬浮液；B)、取2份非转基因细胞悬浮液，其中一份作为阴性对照；在另一份中加入双氧水进行染毒，作为阳性对照；
C)、彗星电泳技术，依次进行以步骤①、对转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照分别进行彗星电泳技术，依照彗星电泳的判断标准，分别得转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据、阴性对照的彗星电泳判断数据和阳性对照的彗星电泳判断数据；②、预先的实验有效性的判断如果，阳性对照的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的P > 0. 05，则判定该彗星电泳实验无效；如果，阳性对照的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的 P^O. 05，则判定该彗星电泳实验有效，从而继续进行以下步骤③；③、得出结论如果，转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据与阳性对照的彗星电泳判断数据相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全。作为本发明的转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法的改进在彗星电泳技术中根据细胞慧星荧光尾部(T)与其可见头部(H)的比例，将损伤程度分为0级、1级、2级、 3级和4级；损伤程度< 5%，为0级(无损伤)；损伤程度< 20%，为1级(轻度损伤)；20%彡损伤程度<40%，为2级(中度损伤)；40%彡损伤程度<95%，为3级(重度损伤)；损伤程度，为4级(极其严重损伤)；对转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照分别拍摄数量相同的细胞；当所述彗星电泳的判断标准为细胞的拖尾率时，则用CASP软件统计转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照所对应的拖尾率；如果，转基因细胞悬浮液的拖尾率与阴性对照的拖尾率相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的拖尾率与阳性对照的拖尾率相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全；或者当所述彗星电泳的判断标准为DNA损伤专用单位时，所述DNA损伤专用单位的计算规则如下DNA损伤专用单位=0X0级细胞数+1 X 1级细胞数+2 X 2级细胞数+3 X 3 级细胞数+4X4级细胞数；如果，转基因细胞悬浮液的DNA损伤专用单位与阴性对照的DNA损伤专用单位相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的 DNA损伤专用单位与阳性对照的DNA损伤专用单位相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全。综上所述，本发明提供了一种检测转基因抗虫水稻土壤环境安全评价方法，利用转基因抗虫水稻秸梗浸泡液培养草履虫，通过对培养草履虫细胞密度的统计来确定转基因水稻是否对草履虫的生长、繁殖等产生影响；再利用彗星电泳技术检测草履虫DNA的损伤， 统计分析实验组、阴性对照组和阳性对照组三者的彗星细胞数来确定抗虫转Bt基因水稻对草履虫DNA的损伤情况；从而来判断转基因抗虫水稻对土壤环境是否安全。本发明具有如下优点根据转基因抗虫水稻对草履虫生长的细胞密度和DNA损伤的影响，间接评价转Bt基因抗虫水稻释放对土壤环境的安全性，实验操作简单，不需要复杂的仪器设备和繁琐的操作步骤。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是本发明的转基因水稻培养草履虫的彗星电泳损伤图片；A，0级，表示无损伤；B，1级，表示轻度损伤；C，2级表示中度损伤；D，3级表示重度损伤；E，4级表示极其严重损伤。
具体实施例方式(1)本发明选用材料为转基因抗虫水稻为转Bt基因抗虫水稻华池B6和TT51 (可购自浙江大学)，与其亲本(嘉早935、明恢6 及亲缘较远但农艺性状相近的水稻品种(中九B、R9311)。转Bt基因抗虫水稻华池B6含有cryIAb抗虫基因，转Bt基因抗虫水稻TT51含有 crylAb/crylAc融合基因，华池B6和TT51均能高抗多种鳞翅目害虫，且农艺性状良好，具有规模化生产潜力。具体转基因抗虫水稻品种及对照分别为YP1-转基因抗虫水稻华池Β6，ΥΡ2-水稻嘉早935 (华池Β6的非转基因亲本，对照组)，ΥΡ3-水稻中九B (YPl、ΥΡ2的非转基因对照，与ΥΡ1、ΥΡ2无任何亲缘关系)；ΥΡ4—转基因抗虫水稻ΤΤ51，ΥΡ5—水稻明恢63 (ΤΤ51的非转基亲本，对照组)，ΥΡ6-水稻R9311 (ΥΡ4、ΥΡ5的非转基因对照，与ΥΡ4、ΥΡ5无任何亲缘关系)。(2)分别对 ΥΡ1、ΥΡ2、ΥΡ3、ΥΡ4、ΥΡ5、ΥΡ6 进行以下操作剪取20g水稻秸梗，直接放入锥形瓶，加入500ml的蒸馏水，培养箱中浸泡。浸泡时间分别设定为3. 5天、7天，14天。浸泡时间到后，用双层滤纸过滤水稻浸泡液，从各样品浸泡液中取IOOml用于草履虫培养。(3)用实验室常规方法培养(普通水稻水浸煮沸液)大草履虫，经检测细胞密度达到大约lX103ind/mL时，作为草履虫培养母液备用。具体如下将普通水稻秸梗按照lg/25ml的料液加入蒸馏水，煮沸0. 5小时，过滤，得普通水稻水浸煮沸液；该普通水稻例如可为扬两优6号、丰优22 (不同地区优质水稻品种不同，以方便采集水稻桔梗为主)；将大草履虫放入上述普通水稻水浸煮沸液中于25-27°C进行常规培养，直至所得的草履虫培养母液草履虫的密度为lX103ind/mL ；(4)从草履虫培养母液中吸取Iml草履虫溶液(共吸取18次)，每Iml草履虫溶液中分别对应加入1种水稻浸泡液(分别为YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6这6个样品3种浸泡时间的水稻浸泡液，均各为100ml，为步骤⑵所得)中，放入^TC恒温培养箱中培养， 培养1周时间(7天)，并从接种后的第二天开始对草履虫的数量进行计数，期间无需提供光照。(5)用显微镜分别对上述YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6这6个样品不同浸泡时间段的水稻浸泡液培养的草履虫分别进行计数。分别如下计数时，先将草履虫培养液摇勻，吸取Iml于培养皿中，加入40ul甲醛溶液固定草 7履虫，再用移液枪吸取IOOul上述甲醛溶液固定后的草履虫培养液于血球计数框中进行全片计数。每天计数一次(从培养的第2天起开始计数)，计数时间固定为每天下午3点，连续计数5天，每个样品计数4次，取其平均数，作为每天各个培养液样品中草履虫的细胞密度。(6)对YPl、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6这6个样品水稻浸泡液培养的草履虫的细胞
密度差异进行数据分析(单因素方差分析)，根据草履虫密度的差异分析判断所述待测转基因抗虫水稻对土壤动物的安全性。表1各样品草履虫密度变化差异
权利要求
1.转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法，其特征是包括以下步骤1)、转基因抗虫水稻水浸泡液和和非转基因水稻水浸泡液的制备在转基因抗虫水稻秸梗中按照lg/20 30ml的料液比加入蒸馏水，于25 27°C浸泡 3. 5 14天，过滤，得转基因抗虫水稻水浸泡液；在非转基因水稻秸梗中按照上述相同的料液比加入蒸馏水，于上述相同的温度浸泡相同的时间，过滤，得非转基因水稻水浸泡液；2)、草履虫母液的培养；将普通水稻秸梗按照lg/20 30ml的料液比加入蒸馏水，煮沸至少0. 5小时，过滤，得普通水稻水浸煮沸液；将大草履虫放入所述普通水稻水浸煮沸液中进行培养，得草履虫培养母液；所述草履虫培养母液中草履虫的密度为(0. 8 1. 2) X 103ind/mL ；3)、用转基因抗虫水稻水浸泡液和非转基因水稻水浸泡液分别培养草履虫将草履虫培养母液按照1 90 110的体积比加入至转基因抗虫水稻水浸泡液中作为转基因培养液，于25 27°C恒温培养6 8天；将草履虫培养母液按照相同的体积比加入至非转基因水稻水浸泡液中作为非转基因培养液，于上述相同的温度培养相同的时间；4)、草履虫细胞密度的计数从上述步骤幻所述培养的第2天起，每天对上述转基因培养液以及非转基因培养液进行草履虫细胞密度的检测；5)、当上述步骤4)的转基因培养液中的草履虫细胞密度彡lX103ind/mL，取该转基因培养液作为草履虫DNA的损伤检测的转基因细胞培养液；当上述步骤4)的非转基因培养液中的草履虫细胞密度彡lX103ind/mL，取该非转基因培养液作为草履虫DNA的损伤检测的非转基因细胞培养液；6)、密度差异进行数据分析将步骤4)所得的非转基因培养液的草履虫细胞密度相对于相同培养天数所得的转基因培养液的草履虫细胞密度进行单因素方差分析，如果P > 0. 05，则继续进行下述步骤7)；如果P < 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全；7)、对草履虫DNA的损伤检测，依次进行以下步骤A)、将转基因细胞培养液制成细胞密度(0.8 1.幻X 105ind/mL的转基因细胞悬浮液，将非转基因细胞培养液制成细胞密度相同的非转基因细胞悬浮液；B)、取2份非转基因细胞悬浮液，其中一份作为阴性对照；在另一份中加入双氧水进行染毒，作为阳性对照；C)、彗星电泳技术，依次进行以步骤①、对转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照分别进行彗星电泳技术，依照彗星电泳的判断标准，分别得转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据、阴性对照的彗星电泳判断数据和阳性对照的彗星电泳判断数据；②、预先的实验有效性的判断如果，阳性对照的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的P>、0. 05，则判定该彗星电泳实验无效；如果，阳性对照的彗星电 泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的 P^o. 05，则判定该彗星电泳实验有效，从而继续进行以下步骤③； ③、得出结论如果，转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的 P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据与阳性对照的彗星电泳判断数据相比的 P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全。
2.根据权利要求1所述的转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法，其特征是在彗星电泳技术中根据细胞慧星荧光尾部(T)与其可见头部(H)的比例，将损伤程度分为0级、1级、2级、 3级和4级，损伤程度<5%，为0级； 5%彡损伤程度< 20%，为1级； 20%^损伤程度< 40%，为2级； 40 %彡损伤程度< 95 %，为3级； 95%彡损伤程度，为4级；转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照分别拍摄数量相同的细胞； 当所述彗星电泳的判断标准为细胞的拖尾率时，则用CASP软件统计转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照所对应的拖尾率；如果，转基因细胞悬浮液的拖尾率与阴性对照的拖尾率相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的拖尾率与阳性对照的拖尾率相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全；或者当所述彗星电泳的判断标准为DNA损伤专用单位时，所述DNA损伤专用单位的计算规则如下DNA损伤专用单位=0X0级细胞数+1X1级细胞数+2X2级细胞数+3X3级细胞数 +4X4级细胞数；如果，转基因细胞悬浮液的DNA损伤专用单位与阴性对照的DNA损伤专用单位相比的 P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的DNA损伤专用单位与阳性对照的DNA损伤专用单位相比的P > 0. 05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全。
全文摘要
本发明公开了一种转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法，利用转基因抗虫水稻秸梗浸泡液培养草履虫，通过对培养草履虫细胞密度的统计来确定转基因水稻是否对草履虫的生长、繁殖等产生影响；再利用彗星电泳技术检测草履虫DNA的损伤，统计分析实验组、阴性对照组和阳性对照组三者的彗星细胞数来确定抗虫转Bt基因水稻对草履虫DNA的损伤情况；从而来判断转基因抗虫水稻对土壤环境是否安全。本发明根据转基因抗虫水稻对草履虫生长的细胞密度和DNA损伤的影响，间接评价转Bt基因抗虫水稻释放对土壤环境的安全性，实验操作简单，不需要复杂的仪器设备和繁琐的操作步骤。
文档编号C12Q1/06GK102373274SQ20111027163
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者何琳, 吕孙建, 徐海圣 申请人:浙江大学