专利名称：一种以葡萄糖为底物合成生松素的大肠杆菌工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产生松素的大肠杆菌工程菌，是一种通过合成生物学和代谢工程手段过量表达由aroF、pheAfbl:、PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC等八个基因组成的合成途径， 实现以葡萄糖为底物来生产生松素的大肠杆菌工程菌。
背景技术：
黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2_苯基色原酮结构的化合物，其羟基衍生物多具黄色，因而得名。黄酮类化合物具有多种生物活性，主要包括心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎等，对镇痛、保肝、抗突变、降血糖和止咳平喘等具有预防、治疗或辅助治疗效果，而且人体不能合成黄酮类化合物，只能从植物性食物中获得，因此近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30%以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。
黄酮类化合物分布广泛，种类繁多，黄酮类化合物主要包括黄酮类(如黄岑素、黄岑苷等)、黄酮醇类(如槲皮素、生松素等)、二氢黄酮类(如陈皮素、甘草苷等)、二氢黄酮醇类(如水飞蓟素、异水飞蓟素等)、异黄酮类(如大豆素、葛根素等)、二氢异黄酮类(如鱼藤酮等)、查尔酮类(如异甘草素、补骨脂乙素等)、橙酮类(如金鱼草素等)、黄烷类(如儿茶素等)、花色素类(如飞燕草素、矢车菊素等)和双黄酮类(如银杏素、异银杏素等)。 而其中生松素是一种很重要的黄酮骨架物质，人们可以通过对生松素进行羟基化、还原化、 烷基化、氧化等修饰而获得良姜素、黄烷酮醇、白杨黄素等众多黄酮物质，另外生松素本身作为一种黄酮物质具有多种生物活性，主要包括缓解神经痛，防止脑水肿的发生，减少脑缺血的发生几率等。
目前，工业上生产生松素主要采用植物提取和化学合成等方法，但是如何从植物复杂的提取液中得到所需要的高纯度黄酮仍然是人类无法解决的一个技术难题，而高污染、使用有毒和有害化学试剂、以及黄酮物质的复杂结构等因素限制了化学法的使用，正因如此，微生物发酵法以使用廉价无污染的原料、较低的污染的排放、较低的能源需求等优点受到越来越多的关注。目前国内外关于微生物发酵法生产生松素的研究都需要在发酵液添加价格昂贵的前体物质如苯丙氨酸或者肉桂酸，而且从食品安全角度来考虑，由于肉桂酸是从脱胎于石油工业的化学合成法合成而来，因此肉桂酸的添加尤其得不到商业上的应用。另外目前的发酵法都采用的是两步法生产，即菌株首先在营养丰富的培养基中生长，在达到一定菌浓的时候，通过离心等方法收集所有的菌体置于基本培养基中发酵，显然这种发酵方式无法应用于大规模工业化。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种以葡萄糖为底物直接合成生松素的基因工程菌株，无需添加贵重的前体物质，只在单一培养基中便能合成生松素的大肠杆菌工程菌，通过在菌株体内构建从葡萄糖到生松素的由aroF、PheAfbr, PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC 等八基因构成的合成途径，实现以葡萄糖为底物来合成黄酮骨架物质生松素。
以下是本发明技术方案的详细描述。
途径基因的选择
以葡萄糖为底物的L-Phe生物合成途径由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4_磷酸赤藓糖(E4P)在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases, DS)的催化下缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反应为第一个限速反应。第二和第三个限速反应分别为由分支酸在分支酸变位酶(Chorismate mutase, CM)的作用下转变为预苯酸，继而在预苯酸脱水酶(Prephenate dehydratase, PDT)的作用下脱水、脱羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因编码的双功能酶。因此过量表达pheA和aroF这两个基因。
尽管苯丙氨酸脱氨酶(PAL)分布很广，但是只有R. glutinis用来做商业用途，同时R. glutinis对苯丙氨酸的催化活性也比其他种类要高，在深红类酵母中，又以 R. glutinis活性为最高，同时它对酪氨酸的催化活性也很高。在最近的研究中，已经有人用 P. crispurn的4-香桂酸辅酶A连接酶(4CL)、P. hybrida的查尔酮合成酶(CHS)、M. sativa 的CHI的组合来获得各种非天然的黄酮类骨架物质，并且获得了很高的产量。因此选择深红酵母(Rhodo torula glu tinis)的 PAL、香芳:菜(Petroselinum crispurn)的 4CL、矮牵牛(Petunia Xhybrida)的 CHS (AF233638)、紫苜猜(Medicago sativa)的查尔酮异构酶 (CHI) (M91079)。大肠杆菌细胞内的丙二酰辅酶A分子为途径中的限制性前体分子。通过丙二酰辅酶A合成酶可以直接将丙二酰和辅酶A转化为丙二酰辅酶A，这时可以通过过量表达matB和matC基因来提高产量。但是前一种代谢途径因为要添加生物素，对大规模生产化不利，因此选用后种代谢途径优化。
途径基因的合成与表达载体的构建
根据NCBI 网站上根据 Genbank NC000913. 2，GQ303716, AAC83455, AAC83457, DQ013364，X13325，AF233638，M91079，采用全基因合成方法获得途径所需要的八个基因，同时分别将 aroF、pheAfbr 克隆于 pRSFDuet-1，PAL、4CL 克隆于质粒 pETDuet-1，CHS、 CHI 克隆于 pCDFDuet-1，matB、matC 克隆于 pACYCDuet-1，从而构建 pRSFD-pheA-aroF， pET-RgPAL-Pc4CL、pCDF-PhCHS-MsCHI，pACYCD-matBiatC 四个共表达质粒。重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。
含有合成途径的Escherichia coli (BL21)重组菌的筛选
将四个共表达质粒以化学法转化Escherichia coli (BL21)感受态细胞。挑选能在含有100ug/mL的氨节，50ug/mL的卡那霉素,35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素等四种抗生素的LB平板上生长的菌落，使其在含上述的四种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子，进行PCR验证，可分别得到大约I.5bp, I. 2bp, 2. lbp, I. 7bp, I. 5bp, O. 9bp, I. 5bp, I. 3bp,表明八个途径基因已成功转入到 Escherichiacoli (BL21)中。
微生物菌株的培养与发酵
MOPS培养基(g/L):葡萄糖5g,氯化铵4g,磷酸氢二钾O. 3g,丙二酸2g, M0PS83. 7g, N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7. 1668g，氯化铵5. lg，硫酸铁O. 03g，硫酸钾O.5g,氯化镁 I. lg，氯化钠 29. 2g, trace element fromATCClOml,自来水定容至 1L。MOPS培养基的灭菌温度为115-121 °C，15min。维生素等热敏性材料配制后
O.22 um膜过滤除菌，接种前加入。将实验菌株接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养12-20h至菌株OD6tltl达到I. 0-2. O ;然后再加入25ml相同的MOPS培养基，30°C，250rpm条件下培养60h。生松素浓度的测定高效液相色谱(HPLC)仪器=AgilentllOO高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件色谱柱AminexHPX-87H ion exchange column流动相5mMH2SO4流速0.6mL/min柱温35°C进样量5μ L紫外检测器波长210nm样品制备500 μ L发酵液在10，OOOrpm下离心lOmin，取上清液移入I. 5mL离心管
中测生松素的含量。取100 μ L上清液移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0. 45 μ m滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。本发明的有益效果本发明的特点是以一株Escherichia coli (BL21)为出发菌株，利用合成生物学和代谢工程手段在菌株体内构建了一条从葡萄糖到生松素的由aroF、pheAftr> TAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC 等八基因构成的合成途径。重组菌 Escherichiacoli (BL21)在以葡萄糖为唯一碳源，发酵60h后，生松素的产量达到21mg/L，成功实现了以葡萄糖为底物来合成黄酮骨架物质生松素。为今后微生物法生产黄酮类物质提供了一定的借鉴意义。
具体实施例方式实施例I途径基因的选择以葡萄糖为底物的L-Phe生物合成途径由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4_磷酸赤藓糖(E4P)在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases, DS)的催化下缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反应为第一个限速反应。DS是分别由aroF、aroG和aroH基因所编码的三种同功酶,酶活组成比例为aroF : aroG : aroH =80 I 20。三种同功酶(aroF、aroG和aroH)的表达和酶活性分别受到产物L-Tyr、L-Phe和L-Trp的反馈阻遏和反馈抑制。第二和第三个限速反应分别为由分支酸在分支酸变位酶(Chorismate mutase, CM)的作用下转变为预苯酸，继而在预苯酸脱水酶(Prephenatedehydratase, PDT)的作用下脱水、脱羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因编码的双功能酶。因此过量表达pheA和aroF这两个基因。 苯丙氨酸脱氨酶(PAL)广泛存在于高等植物、真菌、酵母以及一种原核生物链霉菌，人类至今还没在真细菌或者动物组织中发现该酶。尽管PAL分布很广，但是只有R. glutinis用来做商业用途，同时R. glutinis对苯丙氨酸的催化活性也比其他种类要高，在深红类酵母中，又以R. glutinis活性为最高，同时它对酪氨酸的催化活性也很高。在最近的研究中，已经有人用P. crispurn的4CL、P. hybrida的CHS、Mlsativa的CHI的组合来获得各种非天然的黄酮类骨架物质，并且获得了很高的产量。因此选择深红酵母(Rhodotorula glutinis)的PAL、香芳:菜(Petroselinum crispurn)的4CL、矮牵牛(PetuniaXhybrida)的 CHS (AF233638)、紫苜蓿(Medicago sativa)的 CHI (M91079)。天然产物生产平台的发展通常受到前体物质或者辅助因子的限制，因为宿主菌中这些物质的量通常都不能满足大规模工业化生产的要求。在形成黄酮类骨架物质时，每生成一个分子的骨架物质需要3mol的丙二酰辅酶A。而大肠杆菌在补充了葡萄糖的培养基指数生长时，其中乙酰辅酶A是辅酶A代谢池中主要组分，丙二酰辅酶A只占其中很少的一部分。因此源于大肠杆菌细胞内的丙二酰辅酶A分子成为限制性前体分子。丙二酰辅酶A的生成途径有两种，一种是乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的作用下转化为丙二酰辅酶A，因此可以通过共表达ACC基因、生物素连接酶基因(birA)以及乙酰辅酶A合成酶(ACS)来提高产量；另一种是通过丙二酰辅酶A合成酶直接将丙二酰和辅酶A转化为丙二酰辅酶A，这时可以通过过量表达丙二酸转运的基因(matb)和丙二酸吸收途径的基因(matC)基因来提高产量。但是前一种代谢途径因为要添加生物素，对大规模生产化不利，因此选用后种代谢途径优化。实施例2途径基因的合成与表达载体的构建根据NCBI 网站上根据 Genbank NC000913. 2，GQ303716, AAC83455, AAC83457,DQ013364，X13325，AF233638，M91079,采用全基因合成方法获得途径所需要的八个基因，大小分别为 I. 5bp, I. 2bp, 2. lbp, I. 7bp, I. 5bp, O. 9bp, I. 5bp, I. 3bp。分别利用酶切连接技术将aroF，PheAfto基因与经EcoRI和HindIII，NdeI，KpnI酶切后的质粒pRSFDuet-1 (Novagen :71363)连接，将 PAL，4CL 基因与经 NcoI 和 HindIII, NdeI 和 BlnI·酶切后的质粒 pETDuet-1 (Novagen :71353)连接，将 CHS，CHI 基因与经 NcoI 和 HindIII，NdeI和BlnI酶切后的质粒pCDFDuet-1 (Novagen :71330)连接，将matB和matC基因与经过 EcoRI 和 HindIII, NdeI 和 KpnI 酶切后的质粒 pACYCDuet-1 (Novagen :71430)连接，由此得到四个共表达质粒 pRSFD-pheA-aroF，pET-RgPAL_Pc4CL、pCDF-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB-matC。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将四个共表达质粒以化学法转化Escherichiacoli (BL21)感受态细胞。挑选能在含有100ug/mL的氨苄，50ug/mL的卡那霉素，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素等四种抗生素LB平板上生长的菌落，使其在含上述的四种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子，测序验证结果，表明八个途径基因已成功转入到Escherichiacoli (BL21)中。其中LB 培养基(g/L)氯化钠10g, TryptonelOg, Yeast extract5g,固体培养基添加 20g 琼脂。LB+氨苄、卡那霉素、氯霉素、链霉素的抗性平板(g/L)LB+100mg氨节、50mg卡那霉素、35mg氯霉素、50mg链霉素，固体培养基添加20g琼月旨。实施例3发酵生产生松素的方法采用所述大肠杆菌工程菌为出发菌株，接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养12_20h至菌株OD6tltl达到I. 0-2. O ;然后再加入25ml相同的MOPS培养基和终浓度为ImM的IPTG，，30°C，250rpm条件下培养60h。重组菌与对照菌相比较，对照菌中没有检测出生松素的产量，而重组菌中生松素 的产量达到21mg/L。
权利要求
1.一种以葡萄糖为底物合成生松素的大肠杆菌工程菌，其特征在于表达生松素合成途径中的需要的关键酶系，所述酶系为3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶，分支酸变位酶，预苯酸脱水酶，苯丙氨酸脱氨酶，4-香桂酸辅酶A连接酶，查尔酮合成酶，查尔酮异构酶，丙二酸转运酶以及丙二酸吸收酶。
2.权利要求I所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因核苷酸序列如Genbank NC000913. 2所示，所述分支酸变位酶和预苯酸脱水酶的基因核苷酸序列如Genbank :GQ303716，所述丙二酸转运的基因核苷酸序列如Genbank AAC83455,所述丙二酸吸收酶的基因核苷酸序列如Genbank AAC83457,所述苯丙氨酸脱氨酶的基因核苷酸序列如Genbank DQ013364,所述4-香桂酸辅酶A连接酶的基因核苷酸序列如Genbank :X13325,所述查尔酮合成酶的基因核苷酸序列如Genbank AF233638，所述查尔酮异构酶的基因核苷酸序列如Genbank :M91079。
3.权利要求I或2所述工程菌的构建方法，其特征在于根据GenbankNC000913. 2， GQ303716, AAC83455, AAC83457, DQ013364, X13325, AF233638, M91079，分别采用化学全合成方法获得途径所需要的基因，克隆到表达载体后分别转化大肠杆菌Escherichia coli (BL21)后得到所述基因工程菌。
4.权利要求I所述工程菌应用于生松素的生产，其特征在于以权利要求I所述工程菌为出发菌株，接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养 12-20h至菌株OD6tltl达到I. 0-2. O ;然后加入25ml相同的MOPS培养基，加入IPTG、调节浓度为ImM，30°C，250rpm条件下继续培养60h。
5.根据权利要求书4所述的方法，其特征在于MOPS培养基组成为(g/L):葡萄糖5g，氯化铵4g，磷酸氢二钾O. 3g，丙二酸2g，M0PS83. 7g，N_{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7. 1668g， 氯化铵5. lg，硫酸铁O. 03g，硫酸钾O. 5g，氯化镁I. lg，氯化钠29. 2g，微量元素10ml，自来水定容至1L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素采用ATCCBAA-2326的配方。
全文摘要
本发明公开了一种从葡萄糖合成生松素的大肠杆菌工程菌及其应用，属于遗传工程或代谢工程领域。本发明采用合成生物学和代谢工程的手段，分别合成松素代谢中的八个基因组成的合成途径引入大肠杆菌Escherichia coli(BL21)，从而获得了一株能以葡萄糖为底物合成黄酮骨架物质生松素的重组菌，其在摇瓶中以葡萄糖为唯一底物发酵60h后，生松素的产量达到21mg/L。本发明利用合成生物学的方法，在大肠杆菌体内成功构建八基因组成的合成途径，成功实现了从葡萄糖合成生松素。为今后微生物法生产黄酮类物质提供了一定的借鉴意义。
文档编号C12P17/06GK102936577SQ20121045416
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者陈坚, 周景文, 吴俊俊, 堵国成 申请人:江南大学