专利名称：一种检测肠病毒的快速检测试纸及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种检测肠病毒的快速检测试纸以及其制造方法，尤其是检测可导致手足口病的肠病毒EV71和Coxsackievirus A16病毒的快速检测试纸。
背景技术：
手足口病(Hand foot mouth disease, HFMD)是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导，是由肠病毒引起的传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒(CoxAsckievirus)A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(Enterovirus71.EV71)最常见。
澳大利亚和美国、瑞典一样，是最早出现EV71感染的国家之一。1972 1973年、1986年和1999年澳大利亚均发生过EV71流行，重症病人大多伴有中枢神经系统症状(CNS)， 一些病人还有严重的呼吸系统症状。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以CNS为主要临床特征的EV71流行，仅保加利亚就超过750例发病，149人致瘫，44人死亡。英国1994年4季度暴发了一起遍布英格兰威尔士由CoxA16引起的手足口病流行，监测哨点共观察到952个病例，为该国有记录以来的最大一次流行，患者大多1 4岁，大部分病人症状平和。该国1963年以来的流行病资料数据显示，手足口病流行的间隔期为2 3年。其它国家如意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国也经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病。日本是手足口病发病较多的国家，历史上有过多次大规模流行，1969 1970年的流行以CoxA16感染为主，1973和1978年的2次流行均为EV71引起，主要临床症状为手足口病，病情一般较温和，但同时也观察到伴无菌性脑膜炎的病例。1997 2000年手足口病在闩本再度活跃，EV71、 CoxA16均有分离，EV71毒株的基因型也与以往不同。20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4 8月共有2628例发病，仅4 6月就有29例病人死亡。死者平均年龄1.5岁，病程仅2天，100%发热，62%手足皮疹，66%口腔溃疡，28%病症发展迅速，17%肢软瘫，17例胸片显示肺水肿。
年3月份以来，我国安徽省阜阳市也发生了较大规模的手足口病疫情。截至5月1日，安徽阜阳累计报告手足口病3321例，其中22例死亡；有978例正在住院治疗，其中重症病例48人，病危10例；正在接受门诊治疗1209人；已治愈1112人。EV71感染引起重症的比例高于其他类型肠道病毒，重症患儿病死率较高，目前尚无疫苗和特效治疗药物。因此，能够及时检测出患者体内携带的EV71病毒和CoxA16病毒，有助于及早发现并控制疫情，对患者及早治疗，挽救生命。
目前，检测肠道病毒，国内外多采用病毒分离、免疫荧光法、PCR等检测手段。病毒分离法耗时太长且成本较高；免疫荧光法需要昂贵的荧光显微镜且标本不易保存；PCR方法不
3能区别有感染毒力的病毒和死病毒，同时上述方法均需专业人员操作。
正是因为现有检测方法的落后，因此开发出使用方便，检测灵敏，价格低廉的检测产品是当务之急。
颜色颗粒免疫层析分析为肠病毒的检测提供了一个新的检测途径。免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合素桥联法等致敏方法形成免疫微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景。
乳胶微粒作为免疫微粒的一种，采用合成高分子乳胶微球，即羧化的聚苯乙烯乳胶作为载体，将抗体或抗原通过物理吸附固载于微球表面而形成免疫乳胶诊断试剂，通过胶乳凝集实验可检测对应的抗原或抗体。制备成的乳胶诊断试剂，用于诊断多种疾病，具有简便、快速、灵敏、价廉及操作容易等优点。
胶体金免疫层析技术是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，是根据免疫反应原理，利用大孔径微孔滤膜为载体，以胶体金作为固相标记物来检测样本中待测物质的一种快速免疫分析技术。
本发明在颜色颗粒免疫层析技术原理基础上，改进检测方法，建立了采用胶体金法及乳胶法检测肠病毒的方法。检测方法的改进，使检测更方便，结果更准确，具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一。
发明内容
本发明为解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种采用颜色颗粒免疫层析法来检测EV71和Cox A16病毒的快速检测试纸。其使用方便、结果准确、成本低、运输储存简便，且无需专业人员操作。本发明还提供了制备这种试纸的方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
一种检测EV71和Cox A16病毒快速检测试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、病毒颜色颗粒储藏垫、样品吸液层组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条或两条检测线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和病毒颜色颗粒储藏垫相互交叠连接，在病毒颜色颗粒储藏垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测病毒。
上述病毒单克隆抗体可以是EV71病毒单克隆抗体和/或Cox A16病毒单克隆抗体，也可以是二者的混合。
颜色颗粒可以是一种金属溶胶颗粒，可包括胶体金颗粒、银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒等；一种标记颗粒，可包括染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒等。其中，胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级，乳胶颗粒直径大小0.01 10ura;金属溶胶颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团，靠静电吸引而结合；乳胶颗粒是利用化
学结合的方式与蛋白质分子结合，形成免疫诊断试剂。
样品吸液层由三层材料叠加组成，依次为10 25g/n^无纺布层、玻璃纤维层、10 25g/m2无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后备用，上述装置除有毛细管作用原理外，还有虹吸作用原理，大大加快吸水移动速度。
用灭活的EV71病毒或CoxA16病毒免疫小鼠，细胞株注射鼠腹腔，提取腹水迷行纯化，在筛选出的杂交瘤细胞株中，分别获得2株高纯度、配对的EV71病毒单克隆抗体细胞株和CoxA16病毒单克隆抗体细胞株， 一株用于检测线包被， 一株可用于颜色颗粒标记。
把试纸样品吸液层放入待测样本中(液面不得超过MAX线)，由于毛细管作用样品将沿着试纸条向吸水板移动，当移动至颜色颗粒储藏垫时，样品中的EV71病毒和/或CoxA16病毒抗原分别与EV71或Cox A16病毒单克隆抗体标记探针发生特异结合，当移动至检测线时，样品中EV71和/或Cox A16病毒抗原又与检测线中相应病毒单克隆抗体相结合，因此其颜色颗粒滞留于检测线上，检测线处显示红色为阳性；相反如果待测样本中没有EV71病毒或CoxA16病毒，相应病毒单克隆抗体标记探针就不会与检测线上对应病毒的单克隆抗体发生特异结合，没有颜色颗粒滞留，即仅有一条红色控制线为阴性，这就是采用的本试纸双抗夹心法原理。根据此原理，两条线为阳性， 一条线为阴性得出判断。
硝酸纤维素膜上设置的控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，当样品通过颜色颗粒标记的EV71和/或Cox A16病毒单克隆抗体移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无EV71和/或CoxA16病毒，都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
由于采用上述技术方案，本发明所提供的EV71和/或Cox A16病毒快速检测试纸具有这样的有益效果，即方便快速、可移动、便于肠病毒的现场筛査工作，且特异性强，灵敏度高，无须专门技术人员操作，而且结果易读。
图l本发明的一种实施方式的结构示意2本发明的一种实施方式的检测结果示意3本发明的另一种实施方式的结构示意4本发明的另一种实施方式的检测结果示意图附图标记
底板l;硝酸纤维素膜2;控制线4;检测线3;颜色颗粒储藏垫5;样品吸液层6;吸水板7。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步解释如图1到图4所示， 一种手足口病快速检测试纸，包括底板l、吸水板7、硝酸纤维素膜 2、颜色颗粒储藏垫5、样品吸液层6;底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一 条检测线3和一条多克隆抗体控制线4，底板一端端头为吸水板7，另一端端头为样品吸液层， 硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和病毒颜色颗粒储藏垫相互交叠连接，在病毒颜色颗粒储藏 垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测EV71和/或Cox A16病毒。
实施例1:抗EV71病毒单克隆抗体的制备
1. 杂交瘤细胞的制备
(1) SP2/0骨髓瘤细胞在含有10%小牛血清DMEM培养液中培养48-72小时，待细胞生长良好， 准备融合。
(2) 抗原免疫EV71抗原10ug与等量完全福氏佐剂乳化后皮下注射，进行基础免疫。融合前 3天，在小鼠脾内和腹腔分别注射上述EV71抗原10ug。
(3) 制备免疫脾细胞最后一次加强免疫3天后处死小鼠，无菌取脾淋巴细胞。
(4) 细胞融合
融合剂PEG (4000);培养液10y。小牛血清DMEM。 SP2/0骨髓瘤细胞和免疫的BALB/C鼠 的淋巴细胞按l: 10或1: 5的比例融合。
(5) 抗体的检测
杂交瘤细胞在96孔板培养一周后，即开始用ELISA法检测特异性抗体。-4° C过夜包被 EV71抗原lug/ml，次日洗涤后，加入培养上清100ul，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 抗体反应，筛选阳性孔。
(6) 克隆化和扩大培养按常规方法克隆化和扩大培养。按照常规方法筛选单克隆抗体细胞 株，获得两株高纯度、配对的EV71病毒单克隆抗体细胞株。
2. 单克隆抗体的制备
(1)可采用常规技术生产单克隆抗体，例如，小鼠腹水法生产单克隆抗体，或体外无血清培 养法。
实施例2:
一种EV71病毒胶体金检测试纸，如图1所示，包括底板1、吸水板7、硝酸纤维素膜2、 颜色颗粒储藏垫5、样品吸液层6，其中，颜色颗粒储藏垫5优选为EV71病毒单克隆抗体金 标垫；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条检测线3和一条多克隆抗体控 制线4，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水 板和EV71病毒单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在EV71病毒单克隆抗体金标垫上压有样品 吸液层.，利用胶体金免疫层析法来检测EV71病毒。
试纸制法
1.将上述两株细胞株产生的两种EV71单克隆抗体， 一种用于检测线包被， 一种用于胶体金 标记。
62. 胶体金的制备及与EV71病毒单克隆抗体的结合
(1) 取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到9(TC，加入适量拧檬酸三纳继续加热搅拌 至沸腾3 10分钟，优选5分钟，冷却后避光保存备用。
(2) 胶体金-抗体结合物制备及纯化
二蒸水溶解氯金酸，加热至沸腾，至终浓度为0. 01%,每100ml加入10%柠檬酸三钠水溶 液1. 5ml。再煮沸10min呈橙红色，冷却后用0. 2mol/L {(20)3调至？朋.5,按照l-3mg抗体/100ml 胶体金加入纯化的EV71抗体IgG，优选2mg抗体/100ml胶体金，然后加入牛血清白蛋白 250mg/100ml胶体金，快速搅拌10min，加入l.O柳aCl，使NaCl的浓度为1%，摇匀，分别以 2000、 4000、 10000 r/min梯度离心，10min/次，最后获得沉淀物即为初步纯化的进标记抗 EV71结合物，溶于储存液。取胶体金-抗体结合物溶液，均匀喷在玻璃纤维素膜上，放在平 坦的塑料板上，然后冷冻1小时，放入冷冻干燥机上冻干过夜，至完全干燥后切条，干燥环 境中保存。
3. 膜的制备将实施例1制备的抗EV71单克隆抗体用0. 01MPBS稀释成3. 5呢/ml。用喷膜 机将以上抗体已lul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线。
将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0. 01MPBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将以上抗体以lu]/cm的速度 喷于硝酸纤维素膜上，形成控制线。
把固定有抗体的硝酸纤维素膜晾干后，置于25-37° C封闭液中浸泡60分钟。 将封闭后的硝酸纤维素膜置于37。 C烤箱中干燥30分钟。充分干燥备用。
4. 试纸条按公知技术组合，如图1所示。
5. 使用方法及结果判断使用时，把试纸样品吸液层放入待测样本中(例如，血液、血浆样 本，便样稀释液，唾液等)，5分钟时观察结果。若检测EV71病毒浓度高于检出量，观察窗 处出现两条红线为阳性，如图2所示；低于界限值，出现一条红线为阴性；控制线无色带产 生代表操作有误或试纸已经过期。
实施例3:
一种EV71病毒乳胶检测试纸，包括底板l、吸水板7、硝酸纤维素膜2、颜色颗粒储藏 垫5、样品吸液层6，其中，颜色颗粒储藏垫5优选为EV71单克隆抗体乳胶微粒储藏垫；底 板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条检测线3和一条多克隆抗体控制线4， 底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和EV71 单克隆抗体颜色颗粒储藏垫相互交叠连接，在EV71单克隆抗体颜色颗粒储藏垫上压有样品吸 液层，利用乳胶层析法来检测EV71病毒。
试纸制法
1. 将上述两株细胞株产生的两种EV71单克隆抗体， 一种用于检测线包被， 一种用于乳胶微 粒标记。
2. 乳胶微粒的制备1) 取乳胶溶液100ul，加入硼砂缓冲液900ul，高速离心10min;
2) 弃上清，加入硼砂缓冲液洗涤，再次高速离心10min;
3) 弃上清，加入硼砂缓冲液悬浮沉淀，加入EV71单克隆抗体20ug，体积定容至lml;
4) 向"3"所得溶液中加入10ulEDC (15mg/ml)，孵育4h，高速离心10min;
5) 弃上清，用封闭液(5% BSA)悬浮沉淀，封闭过夜。
3. 膜的制备机器制膜，利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。
检测线另一株EV71病毒单克隆抗体
控制线羊抗鼠多克隆抗体
4. 试纸条按公知技术组合。
5. 使用方法及结果判断使用时，把试纸样品吸液层放入待测样本中，5分钟时观察结果。 若检测EV71病毒浓度高于检出量，观察窗处出现两条红线为阳性；低于界限值，出现一条 红线为阴性；控制线无色带产生代表操作有误或试纸已经过期。
实施例4抗CoxA16病毒单克隆抗体的制备
制备方法同实施例l。其中，免疫小鼠的免疫量为皮下注射Cox A16抗原10ug，加完全福 氏佐剂，进行基础免疫。融合前3天，在小鼠脾内和腹腔分别注射上述EV71抗原10ug。
实施例5
一种CoxA16病毒胶体金检测试纸，包括底板l、吸水板7、硝酸纤维素膜2、颜色颗粒 储藏垫5、样品吸液层6，其中颜色颗粒储藏垫优选为CoxA16单克隆抗体金标垫；底板中部 为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条检测线3和一条多克隆抗体控制线4，底板一 端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和Cox A16单 克隆抗体金标垫相互交叠连接，在CoxA16病毒单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，利用 胶体金免疫层析法来检测Cox A16病毒。
试纸制法及使用方法与实施例2相同。
实施例6
一种CoxA16病毒乳胶检测试纸，包括底板l、吸水板7、硝酸纤维素膜2、颜色颗粒储 藏垫5、样品吸液层6，其中颜色颗粒储藏垫优选为CoxA16单克隆抗体乳胶为例储藏垫；底 板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条检测线3和一条多克隆抗体控制线4， 底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水銜和Cox A16病毒颜色颗粒储藏垫相互交叠连接，在Cox A16病毒颜色颗粒储藏垫上压有样品吸液层， 利用乳胶层析法来检测Cox A16病毒。 试纸制法及使用方法与实施例3相同。
实施例7
8一种EV71和CoxA16病毒联合胶体金检测试纸，如图3所示，包括底板1、吸水板7、 硝酸纤维素膜2、颜色颗粒储藏垫5、样品吸液层6，其中，颜色颗粒储藏垫5优选为含有EV71 单克隆抗体和Cox A16单克隆抗体的金标垫，两种单克隆抗体的含量比为1: 4至4: 1，优
选l: 1;底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有两条检测线3和一条多克隆抗体 控制线4，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸
水板和病毒单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在病毒单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，
利用胶体金免疫层析法来检测EV71病毒和Cox A16病毒。
试纸制法
1.胶体金的制备及与EV71病毒单克隆抗体的结合
(1) 取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到9(TC，加入适量柠檬酸三纳继续加热搅拌 至沸腾3 10分钟，优选5分钟，冷却后避光保存备用。
(2) 胶体金-抗体结合物制备及纯化
三蒸水溶解氯金酸，加热至沸腾，至终浓度为0.01%，每100ml加入10%柠檬酸三钠水溶 液1.5ml。再煮沸10min呈橙红色，冷却后用0. 2mol/L 1(2(:03调至pH8. 5，快速搅拌下加入实 施例1中纯化的一株EV71抗体IgG 2mg和实施例4中纯化的一株Cox A16单克隆抗体2mg， 加入牛血清的蛋白250mg，快速搅拌10min，加入10%NaCl，使NaCl的浓度为1%，摇匀，分 别以2000、 4000、 10000 r/min梯度离心，10min/次，最后获得沉淀物即为初步纯化的金标 记抗EV71和Cox A16联合结合物。取胶体金-抗体结合物溶液，均匀喷在玻璃纤维素膜上， 放在平坦的塑料板上，然后冷冻1小时，放入冷冻干燥机上冻干过夜，至完全干燥后切条， 干燥环境中保存。
3. 膜的制备将实施例1制备的另一株抗EV71单克隆抗体用0. 01MPBS稀释成3. 5mg/ml。 用喷膜机将以上抗体已lul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线。
将实施例3制备的另一株Cox A16单克隆抗体用0. 01M PBS稀释成3. 5mg/ml。用喷膜机将此 抗体以lul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成另外一条检测线。
将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0. 01MPBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将以上抗体以lul/cm的速度 喷于硝酸纤维素膜上，形成控制线。
把固定有抗体的硝酸纤维素膜晾干后，置于25-37° C封闭液中浸泡60分钟。 将封闭后的硝酸纤维素膜置于37。 C烤箱中干燥30分钟。充分干燥备用。
4. 试纸条按公知技术组合。
5. 使用方法及结果判断使用时，把试纸样品吸液层放入待测样本中，5分钟时观察结果。 若检测EV71或Cox A16病毒浓度高于检出量，观察窗处喷有相应病毒单克隆抗体的位置出 现红线，同时控制线处也出现红线，即出现两条检测线和一条控制先，则结果为阳性，如图 4所示；低于界限值，出现一条红线为阴性；控制线无色带产生代表操作有误或试纸已经过 期。实施例8
根据实施例7所述的EV71和Cox A16病毒联合胶体金检测试纸，在膜的制备过程中， 还可将EV71单克隆抗体和Cox A16单克隆抗体混合后，再用0.01M PBS稀释成3.5mg/ml 后用喷膜机以lul/cm的速度喷膜，形成一条混合检测线。其中，EV71单克隆抗体与CoxA16
单克隆抗体的混合比为l: 4至4: 1，优选l: 1。
使用时，把试纸样品吸液层放入待测样本中，5分钟时观察结果。若样本中EV71或Cox A16病毒其中的任何一种或两种的浓度高于检出量，观察窗处喷有混合单克隆抗体的位置出 现红线，同时控制线处也出现红线，则结果为阳性；低于界限值，出现一条红色控制线为阴 性；控制线无色带产生代表操作有误或试纸已经过期。
实施例9
实施例7或8中的EV71和Cox A16病毒联合胶体金检测试纸，还可按照实施例2和3 中单克隆抗体金标垫的制备方法，分别制备EV71单克隆抗体金标垫和Cox A16单克隆抗体 金标垫，然后叠加为两层使用，以代替含有EV71单克隆抗体和CoxA16单克隆抗体的混合金 标垫，此种方法在生产过程中更为简便。
另外，还可将实施例7、 8或9中的胶体金标记方法替换为乳胶微粒标记，制成EV71和 CoxA16病毒联合乳胶层析检测试纸。标记方法同实施例3。
权利要求
1.一种检测肠病毒的快速检测试纸，其包含背板、吸水板、样品吸液层、硝酸纤维素膜、颜色颗粒储藏垫，其特征在于所述硝酸纤维素膜上设有至少一条单克隆抗体检测线和多克隆抗体控制线，颜色颗粒储藏垫中含有单克隆抗体包附的颜色颗粒；上述单克隆抗体选自下列中的至少一种肠道病毒EV71小鼠单克隆抗体；科萨奇病毒Coxsackievirus A16小鼠单克隆抗体。
2. 权利要求1中所述检测肠病毒的快速检测试纸，其特征在于所述颜色颗粒可以是一种胶体金颗粒、 胶体银颗粒、胶体铁颗粒、磁性颗粒、染料颗粒、乳胶颗粒、或荧光颗粒。
3. 权利要求2中所述检测肠病毒的快速检测试纸，其特征在于所述颜色颗粒优选胶体金颗粒，其颗粒直径为纳米级。
4. 权利要求2中所述检测肠病毒的快速检测试纸，其特征在于所述颜色颗粒优选乳胶颗粒，其颗粒直 径为0.01 10um。
5. 权利要求1中所述检测肠病毒的快速检测试纸，其特征在于所述颜色颗粒储藏垫中含有EV71病毒 单克隆抗体和Coxsackievirus A16病毒单克隆抗体混合包附的颜色颗粒。
6. 权利要求5中所述检测肠病毒的快速检测试纸，其特征在于所述硝酸纤维素膜上设有两条检测线， 其中一条为EV71病毒单克隆抗体喷涂的检测线，另一条为Coxsackievirus A16病毒单克隆抗体喷涂 的检测线。
7. 权利要求5中所述检测肠病毒的快速检测试纸，其特征在于所述硝酸纤维素膜上设有一条由EV71 病毒单克隆抗体和Coxsackievirus A16病毒单克隆抗体混合喷涂的检测线。
8. —种制备权利要求1中所述检测肠病毒的快速检测试纸的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 单克隆抗体的制备SP2/0骨髓瘤细胞与抗原免疫过的小鼠脾淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞，经过筛选后，分别获得两株能够产生高纯度、配对的肠病毒EV71单克隆抗体的细胞株和两株 能够产生高纯度、配对的科萨奇病毒(Coxsackievirus) A16单克隆抗体的细胞株。(2) 用颜色颗粒标记单克隆抗体；(3) 膜的制备将上述步骤(1)中制备的另一株EV71单克隆抗体或科萨奇A16单克隆抗体用 0.01MPBS稀释成3.5mg/ml，用喷膜机将以上抗体以lul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形 成检测线；将多克隆抗体稀释成2mg/ml，用喷膜机以lul/cm的速度喷于硝酸；将膜晾干后， 在25-37° C封闭液中浸泡60分钟，取出后充分干燥，备用；(4) 将步骤(2)中制备的颜色颗粒标记抗体涂覆到玻璃纤维膜上，形成颜色颗粒储藏垫。(5) 在底板上顺次相互搭接的粘贴样品吸液层、颜色颗粒储藏垫、硝酸纤维素膜、吸水板。
9. 权利要求8中所述的制备检测肠病毒的快速检测试纸的方法，其特征在于步骤(2)中采用胶体金标 记抗体，其制备方法是用0.2mol/LK2CO3调至胶体金pH至8.5，搅拌下加入纯化的EV71单克隆抗 体或科萨奇A16单克隆抗体l-3mg/100ml胶体金，然后加入牛血清蛋白250mg,搅拌后加入NaCl， 使其浓度为1%，摇匀后离心，将沉淀溶于储存液中备用。
10. 权利要求8中所述的制备检测肠病毒的快速检测试纸的方法，其特征在于步骤(2)中采用乳胶颗粒 标记抗体，其制备方法是取乳胶溶液100ul，加入硼砂缓冲液900ul，离心后去上清，用硼砂缓冲液 洗涤、离心、去上清后，再加入硼砂缓冲液悬浮沉淀，加入EV71单克隆抗体或科萨奇A16单克隆抗 体20ug，体积定容至lml，再向所得溶液中加入10ull5mg/ml的EDC,孕育4小时后离心，弃上清， 用5%BSA悬浮沉淀，封闭过夜。
全文摘要
本发明公开了一种检测肠病毒的快速检测试纸及其制造方法。其通过颜色颗粒标记的免疫层析法检测样本中的肠病毒EV71和Coxsackievirus A16病毒。本发明的快速检测试纸条是在底板上顺次相互搭接的粘贴样品吸液层、颜色颗粒储藏垫、硝酸纤维素膜和吸水板而形成的检测试纸条。其中颜色颗粒储藏垫上涂覆有颜色颗粒标记的单克隆抗体，硝酸纤维素膜上设有EV71和/或Coxsackievirus A16单克隆抗体喷涂的试验线和抗鼠IgG多克隆抗体喷涂的控制线。本发明能够分别或同时检测样本中的EV71和Coxsackievirus A16病毒，能够尽早发现由这些病毒感染所引起的疫情，并且具有操作简便、快速获得结果、无需专业人员操作等优点。
文档编号G01N33/569GK101650366SQ20081014735
公开日2010年2月17日 申请日期2008年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者万志强, 万志静 申请人:万志静;万志强