一种含LncRNA的药物组合物及其用图
【技术领域】：
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，涉及一种内源性长链非编码RNA的新药及其用 途，特别是一种含LncRNA的药物组合物及其用途。
【背景技术】：
[0002] 目前，肿瘤已是危害人类健康和生命的重大杀手，全世界有肿瘤病人约1400万， 我国每年发病人数约200万，死亡140-150万，且发病人数和死亡人数呈现不断增长的趋 势，肿瘤已超过心脑血管疾病成为威胁人类健康的头号杀手。而常用的肿瘤化疗及放疗是 通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是细胞在 特定的内源和外源信号诱导下，遵循自身的程序，发生的受遗传调控的主动的高度有序的 自我结束生命的过程，在生物体的进化、维持内环境的稳定以及系统生长发育中起着重要 的作用；异常的细胞凋亡将会引起多种疾病的发生，例如过度的细胞凋亡会引发心血管疾 病，神经退行性疾病等，而细胞凋亡不足则会诱发肿瘤。但是细胞的凋亡过程调控异常，可 抑制化疗药物诱导的凋亡，导致耐药。治疗后耐药性的形成导致对抗肿瘤药物的敏感性降 低，从而导致了治疗的失败，因此，化疗药物在治疗肿瘤过程中的耐药性问题已成为目前临 床治疗中的重大难题。
[0003] 随着科技的发展和肿瘤细胞信号传导途经研宄的不断深入，以生物靶分子为基础 的肿瘤生物治疗成为研宄抗肿瘤药物的热点；肿瘤的生物疗法以分子生物学、细胞生物学 和分析免疫学为基础，与手术放疗化疗三大常规疗法作用相互补充，大幅提高肿瘤的治疗 疗效；将生物技术与放疗化疗结合起来，引入促凋亡的分子可以逆转肿瘤细胞产生的耐药 性，增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，从而避免了传统的放疗化疗方法引起的耐药性 和毒副作用的缺点，达到治疗肿瘤的效果。本领域迫切需要了解促肿瘤细胞凋亡相关的因 子，将其作为药物治疗的靶分子应用于临床的治疗中，因此寻找与促肿瘤细胞凋亡相关的 因子与放疗化疗结合治疗肿瘤疾病，具有广阔的前景。
[0004] 通常，IncRNA是指大于200个核苷酸的非编码RNA，与其他非编码RNA相比较， IncRNA具有类型多、作用模式多和数量多的特点；IncRNA可以通过改变染色质的结构来调 节基因的表达，也可以通过顺式或反式方法来沉默或激活一个基因或一个基因家族，甚至 整条染色体。由于IncRNA功能很广泛，所以IncRNA与疾病（特别是肿瘤）的关系已经引 起了人们的重视。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求制备一种能够促进肿瘤细胞凋 亡的含LncRNA核苷酸序列的药物组合物及其在治疗肿瘤中的用途。
[0006] 为了实现上述目的，本发明涉及的药物组合物包括LncRNA核苷酸序列重组质粒 载体或重组病毒，其LncRNA核苷酸序列如下列SEQ ID NO: 1所示：
[0007] SEQ ID NO: 1:
[0008] UUACAAGUGAACUUUCUUUCCUGUUUUAAAGCCUUUUAAAUAAACUUCCACUCCUGUGCUGAAACUUGC CUUAGUCUUUUUUUCUGCUUUAUGCCCCUCA⑶CGAAUUCUUUCAUCUGAGGAGGCAAGAAUUGAAGUUGCUGCAGA CGCCUGUGGAUUCACCACAAGUACAUUGGAGUAACCACUGGGAACAACAGGUUGCCUUAGAAGCUUUGCAGGUUGUU UUGUUUUUUUGUUUGUUUGUUUUUUUGAGACGGG⑶CUCACUU腳CGCCCAGGUUUGUUGCCCAGGCUGGAGUGCA GUGGCGCAAUCUCGGCUCUCCGCAACCUCUGCCUCCCGGGCUCAAGUGAUCCUCCCACCUCGGCUUCCCGAGUACCU GGGACUACAGGCAUGCACCACCACACCCGGCUAAUUUUAAUUUUUAUUUUGUAUUUUUAGUAGAGUUGGGGUUUCAC CAUGUUCCCAGCUG⑶CUUGAACUCUUGAGGUGAAGCAAUCCGCCCACCUCAGCCUCCCAAAGUGCUGAGAUUACAG ACGUGAGCCAUCGCGCCUAGCCUUGCAAGUUGUUUUUUGUUGAACAGAAGAAGCUAUUCAAAAAUGUCCAGGACUCU GUUAUUUAUUCAGCAAGCUUACAAAGCCAUCUUUGAUUGACUGAUUCUUUGACAAUGACUAUCUGGAUGACACAGGA AGGAUGCAAUUCUGGCCUUGGAGAGAAAACUUGCAAGGAAAGGAACAUGUUUGAAUUUCAGAUGUGUUCCUCAAUGA AUCACGAUCUUCAGGGAAUGUUUCAGGUGGAGGAAGGGGCUCUUGGUCAAUGAGCCUGAAGACUGCAUGGCAACCUU UGCCAGCUUUUGGCCUGAAAA⑶CAACUU⑶UCAUUUGAGAUAAUUCCUGUUUUAUAUACUUUCAUUUGAGAUAUUC CUGGUGUAUCAACUGAAACAAAAUCUAUGAAAUAUCAGAUUCACAAAAAUACAUUUUGAAUAUUGAACGUGGAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ； ^AS @ 组为模板，PCR扩增得到LncRNA序列，亚克隆连入腺病毒载体系统，构建LncRNA过表达病 毒；所述PCR的引物序列为：
[0009] 上游引物：5, -UTACAAGTGAACTTTCTTTCCTGTT-3,，
[0010] 下游引物：5' -TTCCACGTTCAATATTCAAAATGTA-3'。
[0011] 本发明所述腺病毒载体系统使用Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV系统。
[0012] 本发明涉及的重组病毒载体或重组质粒载体能在治疗宫颈癌降低肿瘤细胞的成 瘤能力的药物中应用；所述重组病毒为含有LncRNA序列的重组腺病毒载体。
[0013] 本发明涉及的药物组合物为LncRNA重组病毒载体或重组质粒载体包括水溶性填 充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂；
[0014] 本发明所述水溶性填充剂包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄 糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种；
[0015] 本发明所述pH调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐；所述酸选自枸橼酸、磷酸、 乳酸、酒石酸和/或盐酸中的一种或多种；所述碱选自氢氧化钾、氢氧化钠和/或氢氧化铵 中的一种或多种；所述盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵盐 中的一种或多种。
[0016] 本发明所述稳定剂为EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、 碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000和十二烷基硫酸钠或三 羟甲基氨基甲烷中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
[0017] 本发明所述的药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、 颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针剂、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
[0018] 本发明涉及的药物组合物构成的试剂盒中包括感染滴度IO16PFU的过表达LncRNA 的重组腺病毒、生理盐水和磷酸盐缓冲液。
[0019] 本发明所述的药物组合物用于预防和/或治疗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡或降低肿 瘤细胞的成瘤能力。
[0020] 本发明与现有技术相比，其所用生物原料易得，使用安全可靠，其制成的药物组合 物成分合理，疗效明显，应用范围广，使用环境友好。
【附图说明】：
[0021] 图1为IncRNA在阿霉素处理的Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞中的表达水 平变化。
[0022] 图2为IncRNA在Hela细胞中的促凋亡功能示意图，台盼蓝染色法检测细胞凋亡， NC表示阴性对照。
[0023] 图3为IncRNA在裸鼠水平上的促凋亡功能示意图。
【具体实施方式】：
[0024] 下面结合具体实施例和附图进一步描述本发明。
[0025] 本实施例中采用的Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞购自ATCC ;采用的裸鼠为 spf级babl/c小鼠，购自北京医科大学；所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法；所 用的试剂均为市售分析纯级试剂。
[0026] 实施例1、
[0027] 阿霉素处理的Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞中IncRNA的表达水平检测，分 别用阿霉素处理Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞0h，lh，3h，6h，12h，24h后收集细胞， 用Trizol提取总RNA，采用实时荧光定量PCR的方法对IncRNA的表达水平进行检测，观察 在阿霉素处理Hela细胞、A549细胞和SGC7901细胞的过程中IncRNA的表达变化。结果显 示随着阿霉素处理Hela细胞时间的增加，IncRNA的表达水平呈现明显上升的趋势；但是阿 霉素处理A549细胞和SGC7901细胞后，IncRNA的表达水平没有显著变化，如附图1。
[0028] 实施例2、
[0029] IncRNA及阴性对照腺病毒构建，本实施例以人基因组为模板，PCR扩增得到 IncRNA序列，亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV系统，构建IncRNA过表 达腺病毒。
[0030] 其LncRNA核苷酸序列如下列SEQ ID NO: 1所示：
[0031] SEQ ID NO: 1:
[0032] UUACAAGUGAACUUUCUUUCCUGUUUUAAAGCCUUUUAAAUAAACUUCCACUCCUGUGCUGAAACUUGC CUUAGUCUUUUUUUCUGCUUUAUGCCCCUCA⑶CGAAUUCUUUCAUCUGAGGAGGCAAGAAUUGAAGUUGCUGCAGA CGCCUGUGGAUUCACCACAAGUACAUUGGAGUAACCACUGGGAACA