miR-135的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR-135的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002]作为一类小的(18-25个核苷酸)非编码RNA，microRNA在各种生物的生命活动中，对基因的表达起着至关重要的调控作用。在哺乳动物中，超过1000种microRNA的序列已经被发现，每个microRNA可以调控多个信使RNA (mRNA),同时每个mRNA可以被成百上千个microRNA所调控。研宄估计，超过60%的蛋白编码基因表达受microRNA的调控。
[0003]最近研宄发现在肾脏疾病中，HiiCT0RNA可以异常调节基因的表达。例如通过激活血管内皮生长因子，miR-93可促进肾小球的损伤；通过抑制BCL2的表达，miR-195能促进足细胞凋亡；通过下调miR-30可加速足细胞损伤。在糖尿病模型的系膜细胞中miR-192能促进胶原的形成和肾小管间质纤维化的形成；在糖尿病肾病实验模型中，miR-192、miR-216和miR-217可诱导肾脏系膜细胞肥大。Dicer是microRNA成熟过程中所必须的酶，在肾脏细胞中特异地敲除Dicer将能导致肾脏病变:如在足细胞中特异性地敲除Dicer将能诱导蛋白尿和肾小球硬化；敲除Dicer能减少肾小球细胞数目和减轻近曲小管缺血再灌注损伤。这些结果都证实了 microRNA在肾脏疾病的发生发展中扮演了不可或缺的作用，但其中的具体机制还未得到深入研宄。
[0004]miR-135家族在哺乳动物中高度保守，其家族成员包括两个即miR_135a和miR-135b。目前一些研宄发现miR-135作为一种癌基因在肿瘤的发生发展中起着重要作用:如诱导直肠癌的发生；提高非小细胞肺癌对药物的抵抗；促进直肠癌的侵袭与生长。然而也有一些研宄发现miR-135a作为一种抑癌基因抑制肿瘤的发生:如抑制肾癌细胞的增殖和选择性杀死恶性胶质瘤细胞。另外还有一些研宄发现miR-135a能调节中脑的发育和促进糖尿病肾脏的纤维化。尽管目前有这么多关于miR-135的研宄，但miR-135大部分功能还未被研宄，特别是在肾脏疾病(例如足细胞疾病)中的作用。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了 miR-135的新用途，并将miR-135用于制备足细胞损伤诊断药物或制剂，还将miR-135用于诱导足细胞发生损伤，成功构建了足细胞损伤模型。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明的第一方面，提供了一种分离的miR-135基因在制备足细胞损伤诊断药物或制剂中的用途。
[0008]所述将miR-135基因用于制备足细胞损伤诊断药物或制剂，是指将miR-135基因表达产物作为一项足细胞损伤诊断指标应用于足细胞诊断药物的制备。
[0009]研宄发现:miR-135在损伤足细胞中的表达量显著高于正常足细胞。提示miR-135可能在足细胞损伤的发生发展中发挥重要作用；miR-135基因的表达水平可能成为足细胞损伤诊断的标志。
[0010]本发明的第二方面，提供了一种足细胞损伤诊断试剂盒，所述试剂盒包括:特异性扩增miR-135转录本的引物或特异性抗miR-135的抗体。
[0011]本发明的第三方面提供了 miR-135在制备诱导足细胞发生损伤的药物或制剂中的用途。
[0012]优选地，所述足细胞发生损伤表现为足细胞中desmin和snail的表达水平上调。
[0013]优选地，所述足细胞发生损伤表现为足细胞中nephrin、WTl和E_cadherin的表达水平下调。
[0014]优选地，所述足细胞发生损伤表现为足细胞骨架减少或足细胞骨架的重排。
[0015]进一步地，所述药物或制剂通过表达miR-135起到诱导足细胞发生损伤的作用。
[0016]更进一步地，所述miR-135通过激活wnt信号通路起到诱导足细胞发生损伤的作用。
[0017]较佳地，所述miR-135能够激活wnt信号通路表现为miR-135激活Topflash活性。
[0018]较佳地，所述miR-135能够激活wnt信号通路表现为miR-135促进未磷酸化的有活性的β-catenin的表达。
[0019]较佳地，所述miR-135能够激活wnt信号通路表现为miR-135诱导β -catenin进入细胞核。
[0020]进一步优选地，所述miR-135通过抑制GSK3 β的表达来起到激活wnt信号通路的作用。
[0021 ] 较佳地，所述miR-135通过直接靶向GSK3 β的3’ UTR来抑制GSK3 β的mRNA和蛋白表达水平。
[0022]本发明的第四方面，还提供了 miR-135在构建足细胞损伤模型中的用途。
[0023]本发明的第五方面，还提供了一种足细胞损伤模型构建方法，包括以下步骤:在足细胞中过表达有效剂量的miR-135 ;获得足细胞损伤模型。
[0024]在过表达miR-135进行诱导后，本发明人利用足细胞损伤疾病相关的指标来验证建立模型成功与否。验证发现，采用过表达miR-135进行诱导后，足细胞中desmin和snail的表达水平上调；足细胞中nephrin、WTl和E_cadherin的表达水平下调；足细胞骨架减少或足细胞骨架的重排。综合这些指标可知，本发明人过表达miR-135进行诱导后成功构建了足细胞损伤模型。
[0025]本发明过表达miR-135进行诱导后成功构建了足细胞损伤模型，所述模型具有多方面的应用。
[0026]例如，可以用于研宄和阐述足细胞损伤疾病的细胞乃至分子水平上的发病机制。
[0027]还可应用于治疗足细胞损伤的药物的筛选。
[0028]本发明的第六方面，还提供了一种筛选治疗足细胞损伤的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤:将测试候选药物施用于由前述方法构建的足细胞损伤模型，并与未施用测试候选药物的足细胞损伤模型进行比较，其中施用后导致足细胞损伤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗足细胞损伤的候选药物。
[0029]上述筛选出的候选药物可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物实验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的治疗足细胞损伤作用。
[0030]由于本发明采用过表达miR-135进行诱导，所构建的模型更类似于人类的发病过程，因而在药物的筛选上比以往的模型更为精准，效率更高。
[0031]本发明的有益效果在于:
[0032](I)本发明首次揭示了 miR-135与足细胞损伤的相关性，在90%以上的足细胞损伤病例中有高表达，损伤足细胞中的表达量:正常足细胞中的表达量多3.0:1，本发明方法在检出的灵敏度，准确性都显著优于现有的诊断方法。
[0033](2)本发明首次揭示了过表达miR-135能够足细胞发生损伤，更类似于人类的发病过程。
[0034](3)本发明的足细胞损伤模型具有足细胞损伤的典型特征，可极好地模拟体内足细胞损伤的发生发展，是足细胞损伤基础和临床应用研宄的理想模型，从而可良好地应用于筛选治疗足细胞损伤的药物。
【附图说明】
[0035]图1:miR-135在足细胞损伤模型中的表达变化。
[0036]图2:miR-135在体外足细胞(MPC5)损伤模型中表达变化。
[0037]图3:miR-135在FSGS患者临床标本中表达变化。
[0038]图4:miR-135 对MPC5 细胞相关基因 RNA水平表达影响，miR-NC:microRNA mimics阴性对照。
[0039]图5:miR-135对MPC5细胞相关基因蛋白水平表达影响，miR-NC:microRNAmimics阴性对照。
[0040]图6:miR-135对MPC5细胞骨架分布影响，NT:未经任何处理；miR_NC:microRNAmimics阴性对照，比例尺10 μπι。
[0041]图7:在293Τ和MPC5细胞中，miR-135促进Topflash报告载体的活性。miR-NC:microRNA mimics阴性对照；LiCl组作为阳性对照。
[0042]图8:miR-135促进未磷酸化的有活性的β -catenin的表达，NC:microRNAmimics阴性对照；LiCl组作为阳性对照。
[0043]图9:miR-135 能诱导 β -catenin 进入细胞核，miR-NC:microRNA mimics 阴性对照；LiCl组作为阳性对照，比例尺50 μπι。
[0044]图10:生物信息学分析GSK3 β是miR-135潜在的靶基因。
[0045]图11:GSK3 β的3’ UTR保守性分析。
[0046]图12:GSK3 β 3’ UTR载体构建示意图。
[0047]:图13:在2931'和]\0^5细胞中111丨1?-135可以结合到野生型651(30 3’^1?而抑制Iuciferase活性，miR-NC:microRNA阴性对照；Inh_NC:microRNA抑制剂的阴性对照；Inh-135:miR-135 抑制剂。
[0048]图14:miR-135对突变性GSK3 0 3’UTR报告载体的Iuciferase活性无抑制作用，miR-NC:microRNA 阴性对照。
[0049]图15:miR-135 可抑制 GSK3 β 的 RNA 表达，miR-NC:microRNA 阴性对照。
[0050]图16:miR-135可抑制GSK3 β的蛋白表达，miR-NC:microRNA阴性对照。
【具体实施方式】
[0051]本发明经过广泛而深入的研宄，利用不同的模型，对miR-135基因在足细胞损伤过程中的功能进行了研宄。出乎意料地发现，在足细胞损伤模型和FSGS患者的肾脏标本中，miR-135特异性高表达，提示miR-135与足细胞损伤有关。根据人miR-135基因及其表达产物设计的药物和诊断技术，可用于诊断和治疗人类的足细胞损伤。
[0052]此外，在小鼠足细胞系MPC5中过表达miR-135可导致足细胞受损，成功建立足细胞损伤模型。所述足细胞损伤模型具有足细胞损伤的典型特征，可作为模型，良好地模拟足细胞损伤的发生发展。同时，所述足细胞损伤模型还可应用于筛选选治疗足细胞损伤的候选药物。在此基础上完成了本发明。
[0053]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0054]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0055]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的