方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0056]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Samb10k等 MOLEC μ LAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edit1n，Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edit1n,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLEC μ LAR B1LOGY, John ffiley&Sons, New York,1987and per1dic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCT1N, Third edit1n， Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSIN ENZYM0L0GY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.)，AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLEC μ LAR B1LOGY, Vol.119, ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0057]实施例1在足细胞损伤模型中miR-135表达上调
[0058]1.miR-135在足细胞损伤小鼠模型中表达上调
[0059]为研宄miR-135在足细胞损伤中的作用，我们首先用阿霉素构建了小鼠足细胞损伤模型，在尾静脉注射阿霉素后不同时间点处死小鼠，解剖出肾脏，分离肾小球。然后用实时荧光定量PCR检测其miR-135的表达变化，如图1所示，miR-135在阿霉素注射后第四天表达升高，第十一天达到峰值。
[0060]2.miR-135在足细胞损伤体外模型中表达上调
[0061]为进一步研宄miR-135在体外细胞中的作用，我们用不同浓度的阿霉素、处理不同时间段后检测足细胞中miR-135的表达变化。如图2所示，miR-135的表达量随着阿霉素浓度的增加和处理的时间延长而升高。
[0062]3.miR-135在FSGS患者的肾脏标本中表达上调
[0063]接下来我们进一步研宄了 miR-135和足细胞损伤性疾病的关系，我们收集了 3例FSGS的肾脏标本和3例肾破裂的临床标本(作为对照)，实时定量PCR检测这些标本中miR-135表达量的变化情况，结果如图3，在FSGS肾脏标本中，miR-135的表达明显上调。
[0064]实施例2在小鼠足细胞系MPC5中过表达miR-135可导致足细胞受损
[0065]1.过表达miR-135可导致足细胞损伤marker的上调和功能性marker的下调
[0066]在培养的MPC5细胞中转染miR-135mimics，48h后裂解细胞提取RNA和蛋白质。众所周知，desmin和snail是足细胞两个经典的损伤marker，而nephrin、E_cadherin和WTl是足细胞功能性marker，通过定量PCR和western blot技术检测足细胞一些相关基因的表达变化，其检测结果如图4 (RNA水平)和图5 (蛋白水平)所示，desmin和snail的表达上调，而nephrin、WTl和E-cadherin的表达下降。
[0067]2.miR-135的过表达可造成足细胞骨架的排列紊乱
[0068]最近文献报道，足细胞骨架的紊乱伴随着功能的下降，所以骨架也是评判足细胞损伤的常见指标。因此我们猜想miR-135是否也可以造成足细胞骨架的重排。依据这个猜想我们在足细胞中过表达miR-135，然后用鬼笔环肽染足细胞的F-actin骨架，其结果如图6，miR-135可使足细胞骨架减少并且围绕细胞膜发生重排。
[0069]实施例3miR-135能激活wnt信号通路
[0070]1.miR-135可激活Topflash报告载体的活性
[0071]图4和图5显示miR-135能促进desmin和snail的表达，而这两个基因又是wnt信号通路下游的靶基因，因此我们猜想miR-135是否可以激活wnt信号通路，而文献报道wnt信号通路的激活导致足细胞损伤。依据这些研宄，我们首先在MPC5和293T细胞中研宄了 miR-135对Topflash活性的影响，结果如图7所示，无论在MPC5细胞中还是293T细胞中miR-135都能激活Topflash活性，LiCl作为阳性对照。
[0072]2.miR-135能促进未磷酸化的有活性的β -catenin的表达
[0073]在MPC5细胞中过表达miR-135后48h提取总蛋白，用蛋白免疫印记的方法检测未磷酸化的有活性的β -catenin的表达，如图8，miR-135可以促进未磷酸化的有活性的β -catenin的表达，LiCl作为阳性对照。
[0074]3.miR-135 诱导 β -catenin 入核
[0075]在培养的MPC5细胞中过表达miR-135的mimics和mimics control, 48h后通过细胞免疫荧光技术检测β-catenin在MPC5内的亚定位。如图9所示，正常情况下，足细胞的wnt信号通路处于沉默状态，β -catenin重要定位在胞质内和细胞与细胞的连接处。当细胞受损或者处于疾病状态时，wnt信号通路激活，β-catenin会进入细胞核并启动下游革巴基因的表达。实验结果显示miR-135能诱导β-catenin进入细胞核。
[0076]实施例4miR_135能抑制GSK3 0的表达
[0077]1.生物信息学预测miR-135可以靶向GSK3 β的3’ UTR
[0078]为了进一步研宄miR-135激活wnt信号通路的具体机制，我们应用生物信息学分析软件对wnt信号通路和miR-135进行生物信息学分析与预测，结果发现miR-135可以靶向GSK3 β (wnt信号通路抑制子)，如图10所示。图11表示GSK3 β的3’ UTR在哺乳动物中是高度保守的。
[0079]2.GSK3 β报告载体构建
[0080]为证实上述生物信息学的预测结果，我们根据其预测结合位点、利用分子克隆技术构建了 pCDNA3.l-luciferase-GSK3 β -3’ UTR的野生型报告载体和突变性报告载体，其示意图如图12。
[0081]3.miR-135 可直接靶向 GSK3 β 的 3’ UTR
[0082]为验证GSK30是否为miR-135的一个靶基因，我们利用上述野生型的报告载体在293T和MPC5细胞里做Iuciferase荧光素报告实验，实验结果如图13所示，无论是在293T细胞中还是MPC5细胞中，miR-135都能抑制Iuciferase的表达。但是用突变的载体进行上述实验时，我们发现miR-135不能抑制突变报告载体的Iuciferase的表达，如图14。这些结果证实了 miR-135可直接靶向GSK3 0的3’UTR，且作用位点与生物信息学预测完全相符。
[0083]4.GSK3 β的表达可被miR-135抑制
[0084]为了进一步研宄miR-135对GSK3I3表达的影响，我们在MPC5细胞里面过表达miR-135后，检测GSK3 0的mRNA和蛋白水平的变化，其结果如图15和图16，从中来可以看到miR-135能明显地抑制GSK3 β的mRNA和蛋白的表达。
[0085]实施例5药物筛选
[0086]以实施例2中的方法过表达miR-135制备的足细胞损伤模型为受试对象，检测候选药物施用前后，足细胞损伤变化，从而判断候选药物是否对于治疗足细胞损伤是有效的。
[0087]测试组:给予候选药物的模型；
[0088]对照组:不给予候选药物的模型。
[0089]如果与对照组相比，足细胞损伤明显改善，则说明该候选药物可治疗足细胞损伤。
[0090]可利用患足细胞损伤动物，对上述经筛选能够治疗足细胞损伤的候选药物，进行进一步的动物试验，进一步验证治疗效果。
[0091]以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
【主权项】
1.分离的miR-135基因在制备足细胞损伤诊断药物或制剂中的用途。
2.一种足细胞损伤诊断试剂盒，所述试剂盒包括:特异性扩增miR-135转录本的引物或特异性抗miR-135的抗体。
3.miR-135在制备诱导足细胞发生损伤的药物或制剂中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述足细胞发生损伤表现为足细胞中desmin和snail的表达水平上调；足细胞中nephrin、WTl和E-cadherin的表达水平下调；足细胞发生损伤表现为足细胞骨架减少或足细胞骨架的重排。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物或制剂通过表达miR-135起到诱导足细胞发生损伤的作用。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述miR-135通过激活wnt信号通路起到诱导足细胞发生损伤的作用。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述miR-135通过抑制GSK3β的表达来起到激活wnt信号通路的作用。
8.miR-135在构建足细胞损伤模型中的用途。
9.一种足细胞损伤模型构建方法，包括以下步骤:在足细胞中过表达有效剂量的miR-135 ;获得足细胞损伤模型。
10.一种筛选治疗足细胞损伤的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤:将测试候选药物施用于由前述方法构建的足细胞损伤模型，并与未施用测试候选药物的足细胞损伤模型进行比较，其中施用后导致足细胞损伤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗足细胞损伤的候选药物。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR-135的用途及其相关药物。本发明首次揭示了miR-135与足细胞损伤的相关性，并首次揭示了过表达miR-135能够足细胞发生损伤，更类似于人类的发病过程。本发明的足细胞损伤模型具有足细胞损伤的典型特征，可极好地模拟体内足细胞损伤的发生发展，是足细胞损伤基础和临床应用研究的理想模型，从而可良好地应用于筛选治疗足细胞损伤的药物。
【IPC分类】G01N33-53, C12N5-071, A61P13-12, C12Q1-68, C12Q1-02, A61K48-00, A61K31-7105
【公开号】CN104846102
【申请号】CN201510273864
【发明人】周钦, 吕小岩, 杨向贵
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月26日