基于转录组序列开发的榨菜est-ssr标记引物组的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于分子标记技术开发及应用领域，具体涉及榨菜EST (expressed sequence tags, ESTs)微卫星标记引物组（EST - SSR)。
【背景技术】
[0002] 棒菜（Brassica juncea (L. ) Czern. et Coss. var. tumida Tsen et Lee)分类学上 称为茎瘤芥，二年生草本植物，是经我国长期栽培驯化产生的一个芥菜变种。长期以来，众 多研宄者对榨菜种质资源的收集、分类、鉴定做了大量的工作，为榨菜育种研宄提供大量优 异材料，选育出了许多符合生产需求的榨菜品种。但是目前对于榨菜研宄中能够应用的分 子标记技术十分有限，分子标记作为遗传连锁图谱、基因定位的基础，已经成为作物遗传、 分子标记辅助育种研宄和应用的重要部分，因此，榨菜分子标记的缺乏限制了其优质种质 资源快速、有效的选育及生产应用。
[0003] 简单重复序列（SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重 复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记 具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性 最高的分子标记类型之一。但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。SSR标记可分 为基因组SSR (gSSR)和转录组SSR (EST - SSR)，与gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR 建立EST - SSR标记更经济，效率更高。EST - SSR标记来源于DNA的转录区域，相比于gSSR 标记，EST-SSR种间通用性更高，即基于一种材料开发的EST-SSR引物，往往在一个属内甚 至属间均能适用。更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关 研宄如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等中都有极高的 应用价值。
[0004] 近年来随着第二代测序技术的成熟，使得通过转录组数据获得EST-SSR成为可 能。但目前还未有相关利用榨菜转录组序列开发EST-SSR标记引物的报道。因此，利用第 二代高通量测序技术获得榨菜转录组序列信息，批量开发EST-SSR引物，将会对其重要性 状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研宄等起重要推动作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对榨菜目前尚无SSR标记引物和反应体系的不足，提供基于转 录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：基于转录组序列开发的榨菜 EST-SSR标记引物组，所述引物组包括1号引物~14号引物，所述1号引物的正向引物的 序列如SEQ ID NO. 1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述2号引物的正向引物 的序列如SEQ ID NO. 3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 4所示；所述3号引物的正向引 物的序列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 6所示；所述4号引物的正向 引物的序列如SEQ ID NO. 7所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 8所示；所述5号引物的正 向引物的序列如SEQ ID NO. 9所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 10所示；所述6号引物 的正向引物的序列如SEQ ID NO. 11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 12所示；所述7号 引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 13所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 14所示；所述 8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 15所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 16所示； 所述9号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 17所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 18 所示；所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 19所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 20所示；所述11号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 21所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 22所示；所述12号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 23所示，反向引物的序列 如SEQ ID NO. 24所示；所述13号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 25所示，反向引物 的序列如SEQ ID NO. 26所示；所述14号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 27所示，反 向引物的序列如SEQ ID NO. 28所示。
[0007] 进一步地，所述引物组通过以下步骤得到：
[0008] (1)获取榨菜转录组EST序列；
[0009](2)采用SSRLocator软件对步骤（1)获得的EST序列进行SSR位点的筛选；[0010](3)榨菜EST-SSR引物的设计：依据上述步骤⑵筛选的EST-SSR位点，采用 SSRLocator软件进行SSR引物设计出榨菜EST-SSR标记引物，得到引物组。
[0011] 进一步地，所述步骤（1)具体为：
[0012] (1. 1)采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后，转移 到-70 °C冰箱内保存。
[0013] (1. 2)使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA ;提取样品总RNA后，用带有Oligo (dT) 的磁珠富集mRNA ;利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤 核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700bp片段，将回收得到的片段 进行PCR扩增，建立测序文库，用Illumina HiSeqTM20(K)对测序文库进行测序；根据测序结 果，从中选取已知方向的EST序列。
[0014] 进一步地，所述步骤（2)具体为：先对上述步骤（1)中得到的序列进行聚类去冗 余，然后进行SSR位点的筛选；筛选标准包括：单核苷酸的重复次数大于或等于16次，二核 苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于5次，四核苷酸重复次数和五 核苷酸重复次数均大于或等于4次，六核苷酸重复次数~十核苷酸重复次数均大于或等于 3次。同时也筛选中间被少数碱基（间隔小于或等于5bp)打断的不完全重复的SSR位点。
[0015] 进一步地，所述步骤（3)中引物设计参数包括：引物长度为17_24bp ;GC含量为 30% -70% ;退火温度为50-70°C ;预期产物长度为100_280bp。
[0016] 进一步地，所述引物长度最佳为2(^?，6(：含量最佳为50%;退火温度最佳为55°〇， 预期产物长度最佳为200bp。
[0017] 本发明的优点是：本发明提供的基于转录组序列高效地完成对榨菜SSR标记引 物开发的技术，与现有技术相比，获得的转录组序列，极大地增加了引物开发所用的原始数 据；本发明利用生物信息学技术进行榨菜SSR标记引物的开发，批量处理数据，提高了开发 效率，克服了榨菜SSR引物十分稀少的问题，拓宽了榨菜分子标记辅助育种的思路和领域； 使用芸薹属不同作物对设计的引物进行PCR鉴定，结果真实可靠。实现了分子标记在芥菜 育种中的初步应用，为构建高密度芥菜遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记 辅助育种奠定基础。
【附图说明】
[0018] 图1为随机20对SSR引物在榨菜中的PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0019] 图2为3号引物在榨菜及近缘种中的PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1泳道：白菜 为模板的PCR产物；2泳道：黑芥为模板的PCR产物；3泳道：甘蓝为模板的PCR产物；4泳 道：榨菜为模板的PCR产物；5泳道：甘蓝型油菜为模板的PCR产物；6泳道：埃塞俄比亚 芥为模板的PCR产物；7泳道：拟南芥为模板的PCR产物；
[0020] 图3为10号引物在榨菜及近缘种中的PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1泳道：白菜 为模板的PCR产物；2泳道：黑芥为模板的PCR产物；3泳道：甘蓝为模板的PCR产物；4泳 道：榨菜为模板的PCR产物；5泳道：甘蓝型油菜为模板的PCR产物；6泳道：埃塞俄比亚 芥为模板的PCR产物；7泳道：拟南芥为模板的PCR产物。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0022] 实施例1 :本实施例制备榨菜EST-SSR标记引物组，包括以下步骤：
[0023] (1)榨菜转录组EST数据的获得：
[0024] (1. 1