)采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后，转移 到-70 °C冰箱内保存。
[0025] (1. 2)使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA ;提取样品总RNA后，用带有Oligo (dT) 的磁珠富集mRNA ;利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤 核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700bp片段，将回收得到的片段 进行PCR扩增，建立测序文库，用Illumina HiSeqTM20(K)对测序文库进行测序；根据测序结 果，从中选取已知方向的EST序列，共56, 822条EST序列。
[0026] (2)采用SSRLocator软件对步骤（1)获得的EST序列进行SSR位点的检测：
[0027] 先对上述步骤（1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选；筛选 标准包括：单核苷酸的重复次数大于或等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核 苷酸重复次数大于或等于5次，四核苷酸重复次数和五核苷酸重复次数均大于或等于4次， 六核苷酸重复次数~十核苷酸重复次数均大于或等于3次。同时也筛选中间被少数碱基 (间隔小于或等于5bp)打断的不完全重复的SSR位点，检索得到8, 777个EST-SSR位点。
[0028] (3)榨菜EST-SSR引物的设计：
[0029] 依据上述步骤⑵得到的EST-SSR位点，采用SSRLocator软件进行SSR引物 设计。引物设计主要参数：引物长度控制在17_24bp，最佳长度为20bp ;GC含量控制在 30%-70%，最佳为50% ;退火温度控制在50-70°C，最佳为55°C ;预期产物长度控制在 100-280bp，最佳为200bp，共设计获得6, 127对引物。
[0030] 下面检测上述实施例得到的EST-SSR引物的有效性及通用性。
[0031] 利用CTAB方法提取榨菜的基因组DNA。用基因组DNA对上述实施例制备的引物进 行PCR扩增，以检测引物设计的可靠性及可用性。
[0032] PCR反应采用20 y L反应体系，包括浓度为100ng/ y L的基因组DNA模板1. 0 y L， 浓度为10 yM的正向引物1. 0 y L、浓度为10 yM的反向引物1. 0 y L，浓度为5U/ y L的 Taq DNA 聚合酶 0? 2 y L，10 X PCR Buffer (Mg2+) 2. 5 y L，浓度为 2. 5mM 的 dNTP 2 y L，ddH20 12. 3 y L。扩增反应程序为：94°C预变性3min，进入35个循环，每个循环为94°C变性30S， 55°C退火30s，72°C延伸30s ;35个循环后再72°C延伸7min，最后4°C保存。
[0033]向PCR产物中加入2 yL 的loading buffer，以20bp的 DNAladder为 DNA 分子量 标准，采用质量体积比为0. 12g/ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶在240V稳压下电泳1. 5h，电泳 缓冲液为1XTBE。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶拍照。有条带的数据为"1"， 没有条带的为"〇"，使用榨菜DNA扩增出数据"1"的引物即为有效引物。20对引物在榨菜 中都能够扩增出条带，其中14对引物扩增得到的条带与预期大小一致（预期大小见表1)， 另外6对引物扩增得到的条带大于预期大小，说明SSR引物设计成功率较高，达到70%(图 1)〇
[0034]
【主权项】
1.基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组包括1号 引物~14号引物，所述1号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 1所示，反向引物的序列如 SEQ ID NO. 2所示；所述2号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 3所示，反向引物的序列 如SEQ ID NO. 4所示；所述3号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物的序 列如SEQ ID NO. 6所示；所述4号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 7所示，反向引物的 序列如SEQ ID NO. 8所示；所述5号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 9所示，反向引物 的序列如SEQ ID NO. 10所示；所述6号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 11所示，反向 引物的序列如SEQ ID NO. 12所示；所述7号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 13所示， 反向引物的序列如SEQ ID NO. 14所示；所述8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 15 所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 16所示；所述9号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 17所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 18所示；所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 19所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 20所示；所述11号引物的正向引物的序列 如SEQ ID NO. 21所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 22所示；所述12号引物的正向引物 的序列如SEQ ID NO. 23所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 24所示；所述13号引物的正 向引物的序列如SEQ ID NO. 25所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 26所示；所述14号引 物的正向引物的序列如SEQ ID NO. 27所示，反向引物的序列如SEQ ID NO. 28所示。
2. 根据权利要求1所述的榨菜EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组通过以下 步骤得到： (1) 获取榨菜转录组EST序列； (2) 采用SSRLocator软件对步骤（1)获得的EST序列进行SSR位点的筛选； (3) 榨菜EST-SSR引物的设计：依据上述步骤（2)筛选的EST-SSR位点，采用 SSRLocator软件进行SSR引物设计出榨菜EST-SSR标记引物，得到引物组。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)具体为： (I. 1)采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后，转移 到-70 °C冰箱内保存； (1. 2)使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA ;提取样品总RNA后，用带有Oligo (dT)的 磁珠富集mRNA ;利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷 并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700 bp片段，将回收得到的片段进行 PCR扩增，建立测序文库，用Illumina HiSeqTM20(K)对测序文库进行测序；根据测序结果， 从中选取已知方向的EST序列。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)具体为：先对上述步骤（1) 中得到的序列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选；筛选标准包括：单核苷酸的重复 次数大于或等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于 5次，四核苷酸重复次数和五核苷酸重复次数均大于或等于4次，六核苷酸重复次数~十核 苷酸重复次数均大于或等于3次；同时也筛选中间被少数碱基（间隔小于或等于5 bp)打断 的不完全重复的SSR位点。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中引物设计参数包括：引物 长度为17_24bp ;GC含量为30%-70% ;退火温度为50-70°C ;预期产物长度为100_280bp。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物长度最佳为20bp，GC含量最佳 为50% ;退火温度最佳为55°C，预期产物长度最佳为200bp。
【专利摘要】本发明公开了基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组，属于生物技术领域。该引物组是基于转录组序列开发得到的，在转录组测序的基础上，对大量序列信息进行批量处理，从而进行SSR序列的查找和SSR标记的引物设计，克服了榨菜目前SSR标记数量稀少及开发效率低等障碍。利用榨菜及芸薹属不同种的材料验证了SSR引物的有效性及通用性，为榨菜SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择、遗传连锁图谱构建、遗传多样性评价等奠定基础。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104846093
【申请号】CN201510247348
【发明人】陈利萍, 李俊星, 邹晓霞, 曹丽雯, 于宁宁
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月14日