一种试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及养殖领域，具体涉及一种凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的基因检 测试剂及检测方法，适用于凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的流行病学监测、肠道上皮 细胞微孢子虫的检测及基因工程技术等领域。
【背景技术】
[0002] 肠道上皮细胞微孢子虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)，简称"虫下肝肠胞 虫"，是一种很小的孢子虫，体长不到1微米。肠道上皮细胞微孢子虫最早于2009年由泰国 科学家在养殖的斑节对虾发现并报道。2014年，泰国科学家研宄发现肠道上皮细胞微孢子 虫是近年来引起凡纳滨对虾生长缓慢的主要原因之一。中国水产科学研宄院黄海水产研宄 所也对肠道上皮细胞微孢子虫开展相关调查研宄，这种寄生虫主要集中侵害对虾的肝脏， 感染了肠道上皮细胞微孢子虫的凡纳滨对虾，不会出现太多明显的死亡，主要引起肠道吸 收功能下降，导致虾生长缓慢。尽管染病虾比较小，但食欲正常，一样能正常吃料，肠、胃充 满着食物，肝胰腺略微萎缩，发软，但颜色比较深，从表面上看起来，虾并没有明显病症。因 为感染肠道上皮细胞微孢子虫的凡纳滨对虾一直吃饲料，因此养殖户会把时间和饲料都用 于养殖这种患病而根本长不大的对虾身上，而到头来往往达不到有效的收获，造成巨大的 经济损失。肠道上皮细胞微孢子虫可以经口传播，也可以垂直传播，目前还没有很好的治疗 方法。为了及早发现养殖凡纳滨对虾是否被肠道上皮细胞微孢子虫感染，有必要建立一种 快速、准确、灵敏的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用 于病原微生物的检测与研宄中。
[0003] 经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的凡纳滨对虾肠道上皮细胞微 孢子虫PCR检测方法、核酸及引物对有关的报道。本发明研制的凡纳滨对虾肠道上皮细胞 微孢子虫PCR检测方法，弥补了该技术领域的缺陷，为凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫 的监测提供有力手段。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种凡纳滨对虾肠道 上皮细胞微孢子虫特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于凡纳滨对虾肠道上皮细胞微 孢子虫的检测。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现的。
[0006] .凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包括：
[0007] (1) 2 X反应混合缓冲液，包含以下成分：
[0008] KC1，
[0009] MgCl2，
[0010] Tris-HCl，pH5. 8，
[0011] dNTP；
[0012] (2)检测引物的设计合成：上游引物ECZ-F :5'-TGTGGGAGAAATCTTAGmT-3'，下游 引物 ECZ-R:5' -ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3'；
[0013] (3)Taq 酶；
[0014] (4)灭菌的 ddH20 ;
[0015] (5)阳性对照液：肠道上皮细胞微孢子虫基因组DNA ;
[0016] (6)阴性对照液：健康凡纳滨对虾基因组DNA。
[0017] 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测肠道上皮细胞微 孢子虫的方法为：
[0018] (1)肠道上皮细胞微孢子虫DNA的提取：取凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织，加入灭 菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于_20°C冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离 心10分钟，取上清，加入Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心 5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混 匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入lmL预冷的75 %的乙醇，静置 5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH20溶解，即为试验 用DNA模板，提取的DNA模板置于-70°C保存备用；
[0019] (2)PCR反应体系：采用20yL的PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2X反 应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积， 同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心 数秒，置于PCR反应仪上；
[0020] (4)PCR反应条件：95°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，53°C退火30秒，72°C 延伸40秒，共循环30次；72°C延伸10分钟，最后4°C保存；
[0021] (5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1. 5%琼脂糖凝胶（含溴化乙 锭0. 5 y g/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物 的预期大小；
[0022] (6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在330bp处 出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若阳性对照 可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的肠道上 皮细胞微孢子虫。
[0023] 优选的技术方案如下：
[0024] 1.凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒包括：
[0025] (3) 2 X反应混合缓冲液1. OmL，包含以下成分：
[0026]
【主权项】
1. 凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒包括： (1) 2X反应混合缓冲液，包含以下成分： KCl， MgCl2， Tris-HCl，pH5. 8， dNTP ； (2) 检测引物的设计合成：上游引物ECZ-F :5'-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3'，下游引物 ECZ-R :5' -ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3' ； (3) Taq 酶； ⑷灭菌的ddH20 ; (5) 阳性对照液：肠道上皮细胞微孢子虫基因组DNA ; (6) 阴性对照液：健康凡纳滨对虾基因组DNA。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测肠道上皮细胞微孢子 虫的方法为： (1) 肠道上皮细胞微孢子虫DNA的提取：取凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织，加入灭菌处 理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于_20°C冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10 分钟，取上清，加入Tris-饱和酷，充分振荡混勾后，静置5分钟，然后12000rpm尚心5分钟， 取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静 置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入ImL预冷的75 %的乙醇，静置5分钟， 12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用CldH2O溶解，即为试验用DNA 模板，提取的DNA模板置于-70 °C保存备用； (2) PCR反应体系：采用20yL的PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2 X反应混 合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时 分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒， 置于PCR反应仪上； (4) PCR反应条件：95 °C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸 40秒，共循环30次；72°C延伸10分钟，最后4°C保存； (5) PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭 0. 5 y g/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的 预期大小； (6) 结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在330bp处出现 明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若阳性对照可见 目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的肠道上皮细 胞微孢子虫。
【专利摘要】本发明属于养殖领域，具体公开了一种试剂盒及检测方法。本发明所述的试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有肠道上皮细胞微孢子虫检测方法的不足，提供一种新型PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明对凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫提供了便利条件。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-90
【公开号】CN104846098
【申请号】CN201510264256
【发明人】雷燕, 肖洋, 张会军
【申请人】广州金水动物保健品有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月21日