在玉米3号和4号染色体上的与镰孢属穗霉菌抗性相关联的基因座的制作方法
【专利说明】在玉米3号和4号染色体上的与镰孢属穗霉菌抗性相关联 的基因座
[0001] 本申请是申请日为2011年1月26日的中国专利申请201180007300. 7"在玉米3 号和4号染色体上的与镰孢属穗霉菌抗性相关联的基因座"的分案申请。
[0002]相关申请的夺叉引用
[0003] 本专利申请要求2010年1月26日提交的美国临时申请61/298, 233的权益，其全 文以引用方式并入本文。
技术领域
[0004] 本公开涉及用于增强玉米植株中镰孢属（Fusarium)穗霉菌抗性的组合物和方 法。
【背景技术】
[0005] 镰孢属穗霉菌（也称为镰孢属穗腐病）是藤仓赤霉菌（Gibberella fuijkuroi)复 合种，即轮枝镰孢菌（F. verticillioides)、层出镰孢菌（F. proliferatum)、和/或胶孢镰 孢菌（F. subglutinans.)引起的玉米破坏性病害。它主要存在于美国东南部、欧洲南部、墨 西哥、巴西、阿根廷和南非，并影响籽粒产量和质量两者。镰孢属穗霉菌也可导致多个霉菌 毒素的污染，包括伏马毒素（FUM)、串珠镰刀菌素（M0N)、和/或白僵菌素，它们似乎会引起 许多人类和动物的疾病。例如伏马毒素与多种动物中毒症相关，所述动物中毒症包括脑白 质软化（Marasas 等人（1988) Onderstepoort J. Vet. Res. 55 :197-204 ;Wilson 等人（1990) 美国兽医实验室诊断专家协会：第33届年会文摘，Denver，Colo.，Madison，Wis.，USA)和猪 肺水肿（Colvin 等人（1992)Mycopathologia 117:79-82)中介绍的由 Oliver 和 Pharr 所 描述的方法，对每次刻压的加载/卸载曲线进行分析。伏马菌素也是可疑致癌物（Geary等 人（1971) Coord. Chem. Rev. 7 :81 ;Gelderblom 等人（1991) Carcinogenesisl2 :1247-1251 ; Gelderblom等人（1992)Carcinogenesis 13 :433_437)并已与人类出生缺陷相关（Missmer 等人（2006)Environ Health perspect 114:237-41)。
[0006] 使用表型选择将镰孢属穗霉菌抗性种质渗入易感系中是既耗时又困难，并且由于 镰孢属穗霉菌对环境条件敏感，年复一年地仅基于表型来选择抗性已被证明是不可靠的。 此外，专门的病害筛查场所的运作高昂，并且植物必须生长成熟才能对抗性或易感性水平 进行分类。
[0007] 然而，通过使用与镰孢属穗霉菌抗性相关联的分子标记进行的选择具有使得至少 一些选择仅基于子代的遗传组成的优点。此外，镰孢属穗霉菌抗性在植物生命周期非常早 的阶段甚至早至种子期就可确定。使用与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的分子标记可获得 更高的选择率，这就意味着镰孢属穗霉菌抗性的植物育种可更迅速地开展，从而在相对较 短的时间内生成商业上可接受的抗性植物。因此，希望提供用于鉴定和选择具有增强的镰 孢属穗霉菌抗性的玉米植株的组合物和方法。
[0008] 镰孢属穗霉菌遗传抗性的一些实例已被报道（Perez-Brito等人（2001) Agrociencia 35:181-196 ;Ali 等人（2005)Genome 48:521-533 ;Robertson_Hoyt 等人（2006)Crop Sci. 46:1734-1743 ;Zhang 等人（2005) J Appl Genet 47:9-15; Robertson-Hoyt等人（2007)Phytopathology 97:311-317 ;Ding等人（2008)M〇1 Breeding 22 ：395-403)〇
【发明内容】
[0009] 本发明提供用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的组合物 和方法。
[0010] 在一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方 法。在这些方法中，在玉米植株中检测到至少一个标记等位基因的存在。标记等位基因可 包括与以下标记等位基因中的任一种连锁并关联的任何标记等位基因：位于PHM12209. 11 的 "C"、位于 PHM12209. 20 的 "T"、位于 PHM12209. 21 的 "C"、位于 PHM12209. 22 的 "G"、位 于 PHM12209. 23 的"C"、位于 PHM9905. 11 的"A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、"位于 PHM2204. 105 的 A"、位于 PHM13926. 25 的 "C"、位于 PHM13926. 27 的 "G"、位于 PHM13926. 28 的 "G"、位于 PHM13926. 32 的 "G"、位于 PHM10892. 3 的"C"、位于PHM939. 47的"G"和位于PHM939. 48的"A"。然后选出具有与上述标记等位基 因中的任一种连锁并关联的标记等位基因的玉米植株。
[0011] 在其它实施方案中，标记等位基因可与以下标记等位基因中的任一种连锁：位于 PHM12209. 11 的"C"、位于 PHM12209. 20 的"T"、位于 PHM12209. 21 的"C"、位于 PHM12209. 22 的 "G"、位于 PHM12209. 23 的 "C"、位于 PHM9905. 11 的 "A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、位于 PHM2204. 105 的 "A"、位于 PHM13926. 25 的"C"、位于 PHM13926. 27 的"G"、位于 PHM13926. 28 的"G"、位于 PHM13926. 32 的"G"、位于 PHM10892. 3的"C"、位于PHM939. 47的"G"和位于PHM939. 48的"A"，基于单次减数分裂图 谱，距离为 30cM、25cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 9cM、 0? 8cM、0. 7cM、0. 6cM、0. 5cM、0. 4cM、0. 3cM、0. 2cM、或 0? lcM。
[0012] 在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的 方法。在这些方法中，在玉米植株中检测到至少一个标记等位基因的存在。所述标记等 位基因可为以下标记等位基因中的任一种：位于PHM12209. 11的"C"、位于PHM12209. 20 的 "T"、位于 PHM12209. 21 的 "C"、位于 PHM12209. 22 的 "G"、位于 PHM12209. 23 的 "C"、位 于 PHM9905. 11 的 "A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、位于 PHM2204. 105 的 "A"、位于 PHM13926. 25 的 "C"、位于 PHM13926. 27 的 G"、位于 PHM13926. 28 的"G"、位于 PHM13926. 32 的"G"、位于 PHM10892. 3 的"C"、位于 PHM939. 47 的 "G"和位于PHM939. 48的"A"。然后选出具有上述所列标记等位基因中的至少一种的玉米 植株。
[0013] 在另一个实施方案中，提供了用于鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株 的方法，即使用标记基因座序列、或标记基因座序列的一部分、或标记基因座的互补序列或 其一部分作为探针来检测在玉米植株中的标记基因座。在这些方法中，所述标记探针在 严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交：SEQ ID N0 :1、或基于 Clustal V比对方法与SEQ ID N0:1具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID N0:7、或基 于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :7具有95%同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因 座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。然后选出具有与增强的镰 孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的玉米植株。
[0014] 在另一个实施方案中，提供了用于选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性玉米植株的 方法，即检测在第一玉米植株中的至少一个标记基因座，将所述第一玉米植株与第二玉米 植株杂交，对子代植株进行在至少一个标记基因座评价，以及选择具有与第一玉米植株相 同的在所述至少一个标记基因座的等位基因的子代植株。可使用标记基因座的序列、所述 标记基因座序列的一部分、或所述标记基因座的互补序列或其一部分来检测所述标记基因 座。标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交：SEQ ID N0:1、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:1具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID N0:7、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:7具有95%同一性的核苷酸序列，并且 所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
[0015] 在另一个实施方案中，提供了用于鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株 的方法，即使用标记基因座的序列、标记基因座序列的一部分、或标记基因座的互补序列或 其一部分作为探针来检测在玉米植株中的标记基因座。在这些方法中，标记探针在严格条 件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交：SEQ ID N0:10、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :22、或基于 Clustal V比对方法与SEQ ID NO :22具有95%同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因座 包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。然后选出具有与增强的镰孢 属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的玉米植株。
[0016] 在另一个实施方案中，提供了用于选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性玉米植株的 方法，即检测在第一玉米植株中的至少一个标记基因座，将所述第一玉米植株与第二玉米 植株杂交，对子代植株进行在至少一个标记基因座评价，以及选择具有与第一玉米植株相 同的在至少一个标记基因座的等位基因的子代植株。可使用标记基因座的序列、标记基因 座序列的一部分、或标记基因座的互补序列或其一部分作为探针来来检测所述标记基因 座。标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交：SEQ ID NO :10、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :22、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :22具有95%同一性的核苷酸序列，并 且所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
[0017] 在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植株中与增强的抗性相关联的至少 一个标记基因座来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性玉米植株的方法。所述标记基因座 可选自以下标记基因座中的任一个：PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、 PHM13926、PHM10091和PHM18211、以及与这些标记连锁的任何其它标记，并且标记基因座 可位于3号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM12969和PHM18211。标记基因座包含与增 强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
[0018] 在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方 法。在一个方面，获得了具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述等 位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。标记基因座可位于在3号染色体上的区间内， 其包含并侧接PHM12969和PHM18211。然后可将第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且可 对杂交所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因评价。可选择具有第一玉米植株的等位 基因的子代植株作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。
[0019] 在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植株中与增强的抗性相关联的至少一 个标记基因座来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。所述标记基因座可 选自以下标记基因座中的任一个：PHM2015、PHM10326、PHM497、PHM4483、PHM5273、PHM939、 PHM10892、PHM9363、PHM18162、PHM9942、PHM5247、PHM3985、PHM6226 和 PHM10262,以及与这 些标记连锁的任何其它标记，并且标记基因座可位于4号染色体上的区间内，其包含并侧 接PHM10892和PHM10262。标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个 等位基因。
[0020] 在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方 法。在一个方面，获得了具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述等 位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。标记基因座可存在于染色体区间内，其包含并 侧接PHM10892和PHM10262。可将第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且可对杂交所得子 代植株进行第一玉米植株的等位基因评价。可选择具有第一玉米植株的等位基因的子代植 株作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。
[0021] 在另一个实施方案中，提供了通过检测两个分离的标记基因座的等位基因来鉴定 具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。第一标记基因座在3号染色体上的区间 内，其包含并侧接PHM12969和PHM18211 ;第二标记基因座在4号染色体上的区间内，其包 含并侧接PHM10892和HM10262。每个标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的 至少一个等位基因。
[0022] 在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的 方法。在一个方面，获得了第一玉米植株，其具有第一标记基因座的至少一个等位基因和 第二标记基因座的至少一个等位基因。第一标记基因座在3号染色体上的区间内，其包含 并侧接PHM12969和PHM18211 ;第二标记基因座在4号染色体上的区间内，其包含并侧接 PHM10892和PHM10262。第一标记基因座的至少一个等位基因和第二标记基因座的至少一 个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。可将第一玉米植株与第二玉米植株杂交， 并且可对杂交所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因评价。可选择具有第一玉米植株 的等位基因的子代植株作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。
[0023] 本文所述的鉴定和/或选择玉米植株的方法也是受关注的。
[0024] 所述植株可在"坚杆"杂种优势群中。
【附图说明】 [0025] 和序列表
[0026] 根据以下发明详述和附图以及序列表可更全面地理解本发明，以下发明详述和 附图以及序列表形成本申请的一部分。该序列表包含以单个字母表示核苷酸序列特征， 而三字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Researchl3:3021_3030 (1985)和 Biochemical Journal 219(No. 2) :345-373(1984)中所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用 方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R. §1.822 中所列出的规定。
[0027] 图1显示了在3号染色体上已测序的BAC(内源的）在物理图谱上的排列，通过并 包含PHM12969(SEQ ID N0 :1)和PHM18211(SEQ ID N0 :7)限定了这个区域。指示了本文所 述的PHM标记。
[0028] 图2显示了在4号染色体上已测序的BAC(内源的）在物理图谱上的排列，通过并 包含 PHM10892(SEQ ID N0 :10)和 PHM10262(SEQ ID N0 :22)限定了这个区域。指示了本文 所述的PHM标记的位点。
[0029] 图3显示了坚杆亚种群的关联分析，其中3号染色体标记用于与镰孢属穗霉菌抗 性显著关联的测试。X轴：以染色体上的cM表示距离。3. Y轴：概率值。在3号染色体上 与坚杆亚种群中穗霉抗性共分离的标记，P-水平为< 0. 001 (区域限定并包含PHM12969和 PHM18211)显示在盒区。
[0030] 图4显示了坚杆亚种群的关联分析，其中4号染色体标记用于与镰孢属穗霉菌抗 性显著关联的测试。X轴：在4号染色体上以cM表示的距离。4.Y轴：概率值。在4号染色体 上与坚杆亚群中穗霉抗性共分离的标记，P为彡0. 001的水平（区域限定并包含PHM10892 和PHM10262)示于加框区域中。
[0031] 图5显示了出用作镰孢属穗霉菌感染评分指南的FUSERS标度。
[0032] SEQ ID N0 :1 是 PHM12969 的参考序列。
[0033] SEQ ID N0 :2 是 PHM2204 的参考序列。
[0034] SEQ ID N0 :3 是 PHM9905 的参考序列。
[0035] SEQ ID N0 :4 是 PHM12209 的参考序列。
[0036] SEQ ID N0 :5 是 PHM13926 的参考序列。
[0037] SEQ ID N0 :6 是 PHM10091 的参考序列。
[0038] SEQ ID N0 :7 是 PHM18211 的参考序列。
[0039] SEQ ID N0 :8 是 PHM1695 的参考序列。
[0040] SEQ ID N0 :9 是 PHM939 的参考序列。
[0041] SEQ ID N0 :10 是 PHM10892 的参考序列。
[0042]