基因、标记等）的 线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的（例如以碱基对测量的或 分离的或重叠的邻接基因片段）并且不基于基因重组。
[0223] "植物"可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术 语"植物"可指代以下任何一种材料：整个植株、植物部分或器官（例如叶片、茎、根等）、植 物组织、种子、植物细胞、和/或子代的相同材料。植物细胞是从植物中获取的细胞或来源 于从植物中所获取细胞经培养出的细胞。
[0224] "多态性"是DNA中的变型，它过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在种群中必 须具有至少1 %的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性，所述 插入/缺失多态性本文也称为"插入缺失"。
[0225] "概率值"或"p值"是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否 随机的统计学概率。因此，概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在某些 方面，认为概率评分是"显著的"或"不显著的"。在一些实施方案中，认为随机分离的概率 评分为0.05 (p = 0.05,或5%的概率）是共分离的显著性指示。然而，可接受的概率可为 小于50% (p = 0. 5)的任何概率。例如，显著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于0. 15、小于 0. 1、小于0. 05、小于0. 01、或小于0. 001。
[0226] 术语"子代"是指杂交产生的后代。
[0227] "子代植物"由两种植株间的杂交生成。
[0228] "生产标记"或"生产SNP标记"是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标 记已被开发用于检测特异的多态性，并被设计为在多种化学应用和平台中使用。这里使用 的标记名以PHM前缀作为开头以表示"Pioneer Hybrid Marker"，随后是数字，是被设计成 针对序列的，其后是"或然后是针对DNA多态性的后缀。标记版本也可接（A、B、C 等），表示被设计成特异多态性标记的版本。
[0229] 术语"数量性状基因座"或"QTL"是指在至少一种遗传背景下（例如在至少一个 育种种群中），具有与表型性状的差异表达关联的DNA区域。QTL与基因或引起所讨论的性 状的基因紧密连锁。
[0230] "参比序列"是用作序列比对基准的限定序列。参考序列通过基因分型在该基因座 的多个品系、在序列比对程序（例如Sequencher)、然后获取比对的共有序列而获得。
[0231] "顶交测试"是通过将每一亲本与相同测试者（通常是纯合品系）杂交而进行的子 代测试。测试亲本可为自由授粉的品种、杂交品系或自交系。
[0232] 短语"在严格条件下"是指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂 交通常在核酸混合物中进行，但是基本上无其它序列。严格条件是序列依赖性的并将因不 同的环境而异。
[0233] 较长序列具体地讲在较高温度下杂交一般来讲，对特定序列而言严格条件是限定 的离子强度和pH值下，选择比热解链温度（Tm)低约5-10°C。Tm是（在限定离子强度、pH和 核酸浓度的情况下）50%与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上（因为存在的靶序列过多， 在Tm 50%的探针被平衡占用）的温度。严格条件将是那些如盐浓度小于1.0M钠离子，通 常为约0. 01至1. 0M钠离子的浓度（或其它盐），pH为7. 0至8. 3,并且对于短探针（例如 10至50个核苷酸）温度为至少30 °C，对于长探针（例如超过50个核苷酸）为至少60 °C。 严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。就选择性杂交或特异性杂交 而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性严格条件通常为：50% 甲酰胺、5x SSC、和1% SDS、在42°C下培养、或5x SSC、1% SDS、在65°C下培养，洗涤条件为 0. 2x SSC、和0. 1% SDS、在65°C下。对于聚合酶链反应，对于低严格性扩增，约36°C的温度 是典型的，尽管退火温度可在32°C至48°C之间变化，这取决于引物长度。决定杂交参数的 附加准则在多个参考文献中提供。
[0234] 标记的"不利等位基因"是与不利植物表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定 能从育种程序或栽培中移除的植物的有益效果。
[0235] 序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这 些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息计算包（DNASTAR? Inc.，Madison，WI) 的MEGAL丨GNK:程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方 法（Higgins和Sharp，CABI0S. 5 :151-153(1989))采用默认参数（空位罚分=10,空位长 度罚分=10)执行。用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的 默认参数为 KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5。对于 核酸，这些参数为 KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW = 4 以及 DIAGONALS SAVED = 4。 用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的"序列距离"表来获得"百分比 同一性"和"趋异"值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该 方式计算的。
[0236] 本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献 中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F?和 Maniatis，T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual;CoId Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor， 1989 (下文称为 "Sambrook"）。
[0237] 在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文 所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中 使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如"一种植株 (plant、the plant、或a plant)"包括多种植株；取决于上下文，使用的术语"植株"也可包 括该植株遗传相似或相同的子代；使用的术语"核酸"任选地包括该核酸分子的多个拷贝；
[0238] 现在来看实施方案：
[0239] 键抱.属糖霉閑#几性
[0240] 镰孢属穗霉菌（也称为镰孢属穗腐病）是藤仓赤霉菌复合种，即轮枝镰孢菌、层出 镰孢菌、和/或胶孢镰孢菌引起的玉米破坏性病害。与镰孢属穗霉菌抗性相关联的分子标 记和分子标记的等位基因的鉴定允许抗性的正选择仅基于子代的遗传组成。本文提供了通 过基因组成评价（如使用分子标记及其等位基因评价）来鉴定和选择具有增强的镰孢属穗 霉菌抗性的玉米植株的方法。
[0241] 基闵作图
[0242] 在很长一段时间里，人们已经认识到与特定表型例如镰孢属穗霉菌抗性相关联的 特定基因座可在生物的基因组中作图。有利的是，植物育种人员可使用分子标记通过检测 标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显 著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注的性状共分离的分子标记或分子标记簇， 植物育种人员能够对合适的分子标记等位基因进行正选择（该过程称为标记辅助选择或 MAS)从而迅速选择期望表型。育种人员也可使用此类标记通过计算机设计基因型并实施全 基因组选择。
[0243] 本领域熟知的多种方法可用于检测与受关注的性状例如镰孢属穗霉菌抗性共分 离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择 基因型（或等位基因）的标记。因此，比较标记基因座之间的供选择基因型（或等位基因） 之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所 述标记与基因型差异具有最大的关联性。
[0244] 两种此类用于检测受关注的性状基因座的方法是：1)基于种群的关联分析，和2) 传统的连锁分析。在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者（例如优良育种品系）的 已有种群中获取品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡（LD)的弱化和以下观点：在非 结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧 密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通 过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有 助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群（也称为亚种群）内的种群结构带来的不平 衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座上基因型（等位基因）进行比较。显著 的标记-性状关联指示标记基因座和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。
[0245] 传统的连锁分析使用相同的原则；然而，LD通过从少量创始者产生种群生成。选 择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评价多态性位点与给定表型的共分离 水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方 法（Lander 和 Botstein，Geneticsl21 :185-199(1989)，其中测试沿基因图谱（lcM 的区间） 的许多位点中的每一个位点处控制受关注性状的基因位于该位点的概率。基因型/表型数 据用于计算每个测试位点的L0D评分（概率比率的对数）。当L0D评分大于阈值时，存在控 制受关注性状的基因位点位于基因图谱上的该位点上的显著证据（它将位于两个特定标 记基因座之间）。
[0246] 本发明提供了玉米标记基因座，通过关联分析测定，其展示了其与镰孢属穗霉菌 抗性共离析在统计意义上的显著性。这些基因座或附加连锁基因座的检测可用于标记辅助 玉米育种程序，以产生具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植物。
[0247] 标iPj目合物
[0248] 本文已鉴定与玉米镰孢属穗霉菌抗性相关联的标记，和涉及在玉米植株的种质资 源中检测一个或多个与增强抗性相关的基因的存在的方法。玉米植株可为杂交的或近交 的，并且可为刚杆杂种优势群。
[0249] 对于3号染色体上鉴定的QTL，所述标记基因座能从表1中提供的任何标记基因 座中选择，包括 PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、PHM10091 和 PHM18211 ;表5中提供的任何一个单核苷酸多态性标记基因座，包括位于PHM12209. 11的 "C"、位于 PHM12209. 20 的 "T"、位于 PHM12209. 21 的 "C"、位于 PHM12209. 22 的 "G"、位于 PHM12209. 23 的 "C"、位于 PHM9905. 11 的 "A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、位于 PHM2204. 105 的 "A"、位于 PHM13926. 25 的 "C"、位于 PHM13926. 27 的 "G"、位于 PHM13926. 28 的 "G"，和位于 PHM13926. 32 的 "G"，以及与这些标 记连锁的任何其它标记（连锁标记能从MaizeGDB resource中测定）。
[0250] 对于4号染色体上鉴定的QTL，所述标记基因座能从表2中提供的任何标记基 因座中选择，包括 PHM2015, PHM10326, PHM497, PHM4483, PHM5273, PHM939, PHM10892， PHM9363, PHM18162, PHM9942, PHM5247, PHM3985, PHM6226,和 PHM10262 ;表 6 中提供的任 何一个单核苷酸多态性标记基因座，包括位于PHM10892. 3的"C"、位于PHM939. 47的"G" 和位于PHM939. 48的"A" ；以及与这些标记连锁的任何其它标记（连锁标记能从Maize⑶B resource 中测定）。
[0251] QTL的物理图谱位詈
[0252] 基因元件或位于单个染色体上的基因组DNA的邻接线性片段上的基因是物理上 连锁的。
[0253] 对于3号染色体上鉴定的QTL，具有最大物理距离、仍与受关注的表型，镰孢属 穗霉菌抗性相关联的两个标记为PHM12969和PHM18211。PHM12969位于BAC c0437dl8、 c0094gl8 和 b0219jl4 上。PHM18211 位于 BAC c0482dl9 和 c0060e22 上。在玉米物理图谱 上，这两处BAC区域划定了镰孢属穗霉菌抗性QTL。（图1)。可与介于以下序列之间并包 括以下序列的连续DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与镰孢属穗霉PHM12969菌抗性性状相 关联的标记基因座：SEQ ID N0 :1 (参考序列）或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0 :1 具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID N0:7(PHM18211的参考序列），或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :7具有95%同一性的核苷酸序列。图1显示这些已测序BAC在物 理图谱上的排列，其组成了介于并包含PHM12969和PHM18211的连续拉伸的DNA。
[0254] 对于4号染色体上鉴定的QTL，具有最大物理距离、仍与受关注的表型，镰孢属穗 霉菌抗性相关联的两个标记为PHM10892和PHM10262。PHM10892位于BAC b0269h08上，而 PHM10262位于BAC c0237f22和c0069i21上。在玉米物理图谱上，这两处BAC区域划定了镰 孢属穗霉菌抗性QTL (图2)可与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA装配的任何 多核苷酸可覆盖与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的标记基因座：SEQ ID N0:10(PHM10892 的参考序列）或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :10具有95%同一性的核苷酸序列， 和SEQ ID NO :22 (PHM10262的参考序列），或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0 :22具 有95%同一性的核苷酸序列。图2显示已测序的BAC在物理图谱上的排列，其组成了介于 并包括PHM10892和PHM10262的连续拉伸的DNA。
[0255] 连锁关系
[0256] 连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比（重组频率）表示， 或者以厘摩（cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。一cM等于由于在一代中的交换 导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1% (意味着性 状99%的情况下共分离）。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重 组频率关联的近似物理距离。
[0257] 标记座位本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记座位、根据标准连锁分 析进行评价。因此，一cM等于经过单代杂交的标记基因座将与在另一个基因座分离的1% 的概率。
[0258] 标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有 利。紧密连锁的基因座显示约10%或更低，优选地约9%或更低，更优选地约8%或更低， 更优选地约7 %或更低，更优选地约6 %或更低，更优选地约5 %或更低，更优选地约4 %或 更低，更优选地约3%或更低，更优选地约2%或更低的基因座间交换频率。在高度优选的 实施方案中，相关基因座（例如标记基因座和靶基因座）显示约1%或更低的重组频率，例 如约0. 75%或更低，更优选地约0. 5%或更低，或更优选地约0. 25%或更低的重组频率。 因此，所述基因座分开距离为约 10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、 0. 5cM或0. 25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因 座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0. 75%、 0. 5%、0. 25%、或更低）的两个基因座称为彼此"接近"。
[0259] 尽管特定标记等位基因可显示与镰孢属穗霉菌抗性表型共分离，但重要的是注意 到标记基因座不一定是负责表达镰孢属穗霉菌抗性表型。例如，不要求标记多核苷酸序列 是赋予增强的镰孢属穗霉菌抗性的基因的部分（例如是基因开放阅读框的部分）。特定标 记等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性表型的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先玉 米品系中，标记等位基因和等位基因之间的最初"相引"相连锁。最后通过反复重组，标记 和基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据 存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可 使用标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有 利的。
[0260] 对于3号染色体上的QTL，表1和5中的鉴定了的标记，以及任何一个与其距离 50cM以内的标记，可用于预测玉米植株的镰孢属穗霉菌抗性。这包括任何一个与其PHM 标记距离 50cM 以内的标记，PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、 PHM10091、和PHM18211，并与单核苷酸多态性标记距离在50cM以内，位于PHM12209. 11的 "C"、位于 PHM12209. 20 的 "T"、位于 PHM12209. 21 的 "C"、位于 PHM12209. 22 的 "G"、位于 PHM12209. 23 的 "C"、位于 PHM9905. 11 的 "A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、位于 PHM2204. 105 的 "A"、位于 PHM13926. 25 的 "C"、位于 PHM13926. 27 的 "G"、位于 PHM13926. 28 的 "G" 和位于 PHM13926. 32 "G"。
[0261] 对