于4号染色体上的QTL，表2和6中的鉴定了的标记，以及任何一个与其距 离50cM以内的标记，可用于预测玉米植株的镰孢属穗霉菌抗性。这包括任何一个与其 PHM 标记距离 50cM 以内的标记，PHM2015、PHM10326、PHM497、PHM4483、PHM5273、PHM939、 PHM10892、PHM9363、PHM18162、PHM9942、PHM5247、PHM3985、PHM6226 和 PHM10262、以及距离 在50cM以内的任何标记：位于PHM10892. 3的"C"、位于PHM939. 47的"G"和位于PHM939. 48 的 "A"。
[0262] 染色体厌间
[0263] 提供与镰孢属穗霉菌抗性相关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴 定染色体区间。扩展此类染色体区间的边界以包含将与一个或多个QTL连锁的标记。换句 话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记（包括限定区间边界的末端标记）可用 作镰孢属穗霉菌抗性标记。每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含一个以上的QTL。 相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示 与一个以上的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分 离，有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，完 成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。
[0264] 如下所述区间示出了与镰孢属穗霉菌抗性共分离的标记簇。所述标记簇位于染色 体上一个相对小的区域中，表明在这些染色体区域中存在一个或多个QTL。绘制QTL的区 间包括了与镰孢属穗霉菌抗性共分离的标记。区间由多个标记的末端限定，其中区间包括 了在区间内作图的标记以及限定了末端的标记。由限定了区间的端点的末端标记描述的区 间，将包括末端标记和任何位于这段染色体区域的标记，这些标记是目前已知的或未知的。
[0265] 对于3号染色体上的QTL，一段间隔可被和限定并且包括PHM12969和PHM18211。 对于4号染色体上的QTL，区间可被和限定并且包括PHM10892和PHM10262。任何一个未予 位于这些区间的标记能用作镰孢属穗霉菌抗性标记。
[0266] 染色体区间也可通过与QTL标记连锁（表现出连锁不平衡）的标记限定，r 2是关 联性研宄中连锁不平衡（LD)的常见量度。如果在3号染色体上位于PHM12969和PHM18211 的区间中的标记基因座与3号染色体上另一个靠近的标记基因座之间的r 2LD值大于 1/3 (Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299_309 (2002))，这个基因座与另一个就 是连锁不平衡的。
[0267] 标iP,等位基闵和单倍塑组合
[0268] 本发明的标记也可为一个或多个标记基因座上的等位基因的组合。下面描述的等 位基因能组合用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株。
[0269] 本文中，已经鉴定了位于3号染色体上QTL的有利的单核苷酸多态性等位 基因（即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关的），包括：位于PHM12209. 11的"C"、位于 PHM12209. 20 的"T"、位于 PHM12209. 21 的"C"、位于 PHM12209. 22 的"G"、位于 PHM12209. 23 的 "C"、位于 PHM9905. 11 的 "A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、位于 PHM2204. 105 的 "A"、位于 PHM13926. 25 的 "C"、位于 PHM13926. 27 的 "G"、位于 PHM13926. 28 的 "G" 和位于 PHM13926. 32 的 "G"。
[0270] 本文中，已经鉴定了位于4号染色体上QTL的有利的单核苷酸多态性等位基因 (即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联），包括：位于PHM10892. 3的"C"、位于PHM939. 47的 "G" 和位于 PHM939. 48 "A"。
[0271] 本文中，技术人员将预期本文鉴定的3号和4号染色体上的标记中和周围可能有 额外的多态性位点，其中一个或多个多态性位点与单体型的一个或多个多态性位点的等位 基因存在连锁不平衡（LD)。在不同多态性位点上的两个特定等位基因据称处于LD，如果 在其中一个位点上存在等位基因，则易于推测在相同染色体上的其它位点上存在等位基因 (Stevens，Mol. Diag. 4 :309-17 (1999)) 〇
[0272] 标iP,辅助诜择
[0273] 分子标记可用于许多植物育种应用中（例如参见Staub等人（1996)Hortscience 31 :729_741;Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter. 1:3-8)。受关注的主 要领域之一是使用标记辅助选择（MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表 型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植物种群中选择性状的有用工具。当表型难以测 定（例如很多病害抗性性状），或表型发生在植物发育的晚期（例如籽粒特征）时，尤其如 此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种 群，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标 记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假 阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本 身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为"完美标记"。
[0274] 当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域（G印ts. (2002). Crop Sci;42:1780-1790)。这被称为"连锁累赘"。在供体植物与受体植物极不相关的情 况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该"连锁累赘"也可导致产量 减少或其它负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。有时这也被称为"产量累 赘"。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不 能控制该区域或重组断点的大小（Young等人（1998)Genetics 120 :579-585)。在经典育种 中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组（Tanksley等人（1989). Biotechnology 7:257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因 连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受 关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植物中，至少一株植物经历交换有 95%的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的lcM基因内进行。标记使得能够明确鉴 定这些个体。对于300株植物的一次附加回交，在基因另一侧的lcM单次减数分裂图距内 有95%的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用 标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代（参见Tanksley等人，上文）。当 基因的确切位置已知时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的种群大小中对重组进行正选 择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检 测重组。
[0275] 包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米 基因作图和MAS。参见，如IBM2 Neighbors图谱，该图谱可在Maize⑶B网站上在线获取。
[0276] 具体实施MAS的关键步骤单元有：（i)界定种群，其中将测定标记-性状的关联 性，这将界定分离的种群、或无规的或有结构的种群；（ii)监控性状相关多态性标记的分 离或关联情况，并用统计学方法决定连锁或关联；（iii)基于统计分析的结果界定一组所 期望的标记；并（iv)使用和/或外推这个信息到当前的育种种质组合中，使得基于标记的 选择决定得以实现。本公开中描述的标记，以及其它标记类型例如SSR和FLP，可用于标记 辅助选择方案。
[0277] SSR标记可以被定义为6个bp或更短的长度相对短串联重复的DNA(Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17:6463-6471 ;Wang 等人（1994)Theoretical and Applied Genetics，88 :1-6)多态性提高由于很可能在DNA复制期间由滑落引起的重复单元数的 改变（Levinson 和 Gutman(1987)Mol Biol Evol 4:203-221)。重复长度的变化可通过 在保守的非重复侧接区域设计PCR引物来检测（Weber和May (1989)Am J Hum Genet. 44: 388-396)。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且 适合高通量自动化（Rafalski等人（1996)在植株中生成和使用DNA。In :Non-mammalian genomic ahalysis ：a practical guide. Academic press，第 75-135 页）。
[0278] 可生成各种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征图可通过 扩增产物的凝胶电泳获取。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由位于 Saint-Jean-sur-Richelieu，Quebec，Canada 的 DNA Landmarks 依据合同规定向公众提供 玉米的SSR服务。
[0279] 也可生成各种类型的FLP标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。 此类FLP标记在很多方面类似于SSR标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复 区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩 增引物产生的片段能够在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失常常发生于玉米中 (Bhattramakki 等人（2002)，Plant Mol Biol 48, 539-547 ;Rafalski (2002b)，supra)。
[0280] SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型当中，SNP是最多的， 因此具有提供最高基因图谱分辨率的能力（Bhattramakki等人2002Plant Molecular Biology 48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上进行检测，即以所谓的"超 高通量"模式进行检测，因为它们不需要大量DNA，并且可直接进行自动化检测。SNP也 具有成为相对低成本体系的前景。这三个因素一起使得SNP对在MAS中的应用具有高度 吸引力。多种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核 酸酶酶解、微测序和编码球。此类方法已经被以下文献叙述：Gut(2001)Hum Mutat 17第 475-492 页；Shi (2001)Clin Chem 47，第 164-172 页；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1， 第95-100页；Bhattramakki和Rafalski (2001)植株中开发和应用单核苷酸多态性标 记。In :R. J. Henry，Ed，Plant Genotyping ：The DNA Fingerprinting of Plants，CABI Publishing，Wallingford。多种可商购获得的技术利用这些方法和其它方法检查SNP， 包括 Masscode. TM. (Qiagen)，Invader. RTM. (Third Wave Technologies)，Snapshot. RTM. (Applied Biosystems), Taqman. RTM. (Applied Biosystems)以及 Beadarrays. TM. (Illumina) 〇
[0281] 许多一起在单条序列内、或跨越连锁序列的SNP可用于描述任何特定基因型的 单倍型（Ching 等人（2002)，BMC Genet. 3 :19 ;Gupta 等人 2001 ;Rafalski (2002b)，Plant Science 162 :329-333)。单倍型可比单个的SNP提供更多信息，并且可描述较多的任何特 定基因型。例如，单个的SNP可以是具有镰孢属穗霉菌抗性的特定品系或品种的等位基因 "T"，但是等位基因"T"也可发生在用于轮回亲本的玉米育种种群中。在这种情况下，单倍型 例如在连锁SNP标记上的等位基因组合可提供较多的信息。一旦已经将唯一的单倍型分配 给供体染色体区域，该单倍型可用于种群或其任何亚群以确定是否个体具有特定基因。参 见例如W02003054229。使用本领域普通技术人员已知的那些自动化高通量标记检测平台使 得这一方法高效和有效。
[0282] 由于插入/缺失多态性的存在，许多PHM标记已经可用作FLP标记用来选择3号和 /或4号染色体上的基因座。PHM标记的引物也可用于将这些标记转化为在相同区域内的 SNP或其它结构上类似或功能上等同的标记（SSR、CAP、插入缺失等）。Rafalski (2002a)描 述了一个非常有成效的 SNP 的转换方法Current opinion in plant biology 5 (2) :94_100 和也Rafalski (2002b)Plant Science 162:329-333。使用PCR时，引物用于扩增来自个体 (优选地自交体）的DNA片段，所述个体代表受关注种群的多样性。将PCR产物在一个或两 个方向直接测序。比对所得的序列并且鉴定多态性。多态性不限于单核苷酸多态性（SNP)， 还包括插入缺失、CAPS、SSR、和VNTR(可变数目串联重复）。具体地讲，针对本文所述的精 细图谱信息，人们可易于使用本文提供的信息来获取在通过本公开列出的引物扩增的区域 内的附加多态性SNP (和其它标记）。可将在所述图谱区域内的标记杂交到BAC或其它基因 组文库，或与基因组序列电子比对，以便在与所述标记的基本近似的位置处查找新序列。
[0283] 除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其它类型的分子标记也广泛使用，包括但不 限于表达序列标签（EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA (RAPD)、和其它 基于核酸的标记。
[0284] 在一些情况下，同功酶特征图和连锁的形态学特征也可间接用作标记。尽管它们 不直接检测DNA差异，它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测DNA变异的标记远 远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性（Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1：3-8)〇
[0285] 序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新 序列靠近本文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和 /或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开中描述，但是位于相似区域 内。这些图谱可在玉米物种中，或者甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的 其它物种，如大米、小麦、大麦或高粱。
[0286] 一般来讲，MAS使用多态性标记，这些标记已被鉴定为具有与镰孢属穗霉菌抗性 共分离显著的可能性。此类标记被推断在图谱上接近赋予镰孢属穗霉菌抗性的单个或多 个基因，并被考虑作为期望性状的指示，故被定义为QTL标记。植株用于测试QTL标记中 有利等位基因的存在，并且在一个或多个基因座包含期待的基因型的植株预期将传递期望 的基因型以及表型给它们的子代。这意味着鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植 株，可通过鉴定具有本文描述的任何一个标记基因座的一个特异等位基因，其中包括3号 染色体基因座位，PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、PHM10091 和 PHM18211，以及 4 号染色体基因座，PHM2015、PHM10326、PHM497、PHM4483、PHM5273PHM939、 PHM10892、PHM9363、PHM18162、PHM9942、PHM5247、PHM3985、PHM6226 和 PHM10262。
[0287] 此外，本文鉴定的有利的等位基因（即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的）包 括：位于 PHM12209. 11 的 "C"、位于 PHM12209. 20 的 "T"、位于 PHM12209. 21 的 "C"、位于 PHM12209. 22 的 "G"、位于 PHM12209. 23 的 "C"、位于 PHM9905. 11 的 "A"、位于 PHM9905. 13 的 "T"、位于 PHM9905. 35 的 "G"、位于 PHM2204. 88 的 "T"、位于 PHM2204. 105 的 "A"、位 于 PHM13926. 25 的 "C"、位于 PHM13926. 27 的 "G"、位于 PHM13926. 28 的 "G"、"G" 位于 PHM13926. 32、位于 PHM10892. 3 的 "C"、位于 PHM939. 47 的 "G" 和位于 PHM939. 48 的 "A"。
[0288] 本文所述QTL区间可用于MAS以选择展示增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。相 似地，所述QTL区间也可被用于反选择对镰孢属穗霉菌易感的植株。Fusarium任何在QTL 区间内作图的标记（包括间隔的末端）均可用于此目的。3号染色体区间被限定和包含 PHM12969和PHM18211，而4号染色体区间被下列限定并包含下列：PHM10892和PHM10262。 可选择在3号和/或4号染色体区间具有期望的标记等位基因的植株。与镰孢属穗霉菌抗 性密切相关的QTL标记在标记辅助选择中尤其有用。
[0289] 单倍型也可用于MAS中，以将增强的镰孢属穗霉菌抗性引入敏感玉米品系或 品种。与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的3号染色体单倍型可包含下列中的至少一 个：位于 PHM12209. 11 的 "C"、位于 PHM12209. 20 的 "T"、位于 PHM