幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测试剂盒，尤其涉及一种幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori，简称HP)，由年巴里?马歇尔（Barry J. Marshall)和罗宾?沃伦（J. Robin Warren)于1983年首次从胃炎患者的胃黏膜中分离 得到。研宄显示由HP引起的炎症可导致萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生，最终演变为 胃腺癌。
[0003] HP的全基因序列已经测出，其中尿素酶基因有四个开放性读框，分别是UreA、 UreB、UreC和UreD。UreA和UreB编码的多肽与尿素酶结构的两个亚单位结构相当。幽门 螺杆菌的尿素酶极为丰富，约含菌体蛋白的15%，活性相当于变形杆菌的400倍。尿素酶催 化尿素水解形成"氨云"保护细菌在高酸环境下生存。
[0004] HP含有VacA和CagA两种基因，分别编码空泡毒素和细胞毒素相关蛋白，根据这两 种基因的表达情况，又将HP菌株分成两种主要类型：1型和II型。I型含有CagA和VacA 基因并表达其中一种或两种蛋白，即VacA基因中间区域型M1、M2与信号序列型S1、S2的组 合（Sl/Ml、S1/M2、S2/M1、S2/M2)需与CagA基因同时存在，I型与胃疾病密切相关。II型 不含CagA基因，不表达两种蛋白，其毒性较弱，感染后一般无明显临床症状。
[0005] 根据第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告，检测Hp感染的方法有侵入性和 非侵入性两类。侵入性方法依赖胃镜活检，包括快速尿素酶试验（RUT)、胃黏膜直接涂片染 色镜检、胃黏膜组织切片染色镜检、细菌培养、基因检测方法。而非侵入性检测方法不依赖 内镜检查，包括13C或14C-尿素呼气试验（UBT)、粪便Hp抗原（HpSA)检测（依检测抗体可 分为单抗和多抗两类）等。以上的检测方法仅限于检出是否有HP感染，均未对HP进行分 型检测。
[0006] 根据第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告和文献数据筛选出5个常用于治 疗的抗生素（克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、氟喹诺酮类、四环素）。根据查找的文献资料总 结出上述抗生素耐药基因和耐药位点如表1。
[0007] 表1各治疗药物耐药突变位点
[0008]
【主权项】
1. 一种用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒包括：用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和PCR反应液；所述PCR 反应液包括：PCR反应液I、PCR反应液II、PCR反应液III和PCR反应液IV ; 所述PCR反应液I包括分型扩增引物： 引物 VacAS-F2 :SEQ ID NO :1 ; 引物 VacAS-R2 :SEQ ID NO :2 ; 引物 VacAM-F2 :SEQ ID NO :3 ; 引物 VacAM-R2 :SEQ ID NO :4 ; 所述PCR反应液II包括分型扩增引物： 引物 UreA-F2 :SEQ ID NO :5 ; 引物 UreA-R2 :SEQ ID NO :6 ; 引物 CagA-F2 :SEQ ID NO :7 ; 引物 CagA-R2 :SEQ ID NO :8 ; 所述PCR反应液III包括耐药突变扩增引物： 引物 16S-F2 :SEQ ID NO :9 ; 引物 16S-R2 :SEQ ID NO :10 ; 引物 rdxA-F2 :SEQ ID NO :11 ; 引物 rdxA-R2 :SEQ ID NO :12 ; 引物 PBP1-F2 :SEQ ID NO :13 ; 引物 PBP1-R2 :SEQ ID NO :14 ; 所述PCR反应液IV包括耐药突变扩增引物： 引物 23S-F2 :SEQ ID NO :15 ; 引物 23S-R2 :SEQ ID NO :16 ; 引物 gyra-F2 :SEQ ID NO :17 ; 引物 gyra-R2 :SEQ ID NO :18 ; 所述PCR反应液I、PCR反应液II、PCR反应液III和PCR反应液IV还分别含有内控引物 1对： 引物 0 -gl〇bin-F2 :SEQ ID NO :19 ; 引物 0-gl〇bin-R2:SEQ ID N0:20。
2. 根据权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒，其特 征在于，所述核酸膜条包括用于幽门螺旋杆菌分型检测的分型膜条和用于幽门螺旋杆菌耐 药检测的耐药膜条； 所述分型膜条包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，所述核酸探针包括： 用于幽门螺旋杆菌分型检测的核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO :21-26 ; 内参照核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO :50 ; 所述耐药膜条包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，所述核酸探针包括： 用于幽门螺旋杆菌耐药突变检测的核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO :27-49;内参 照核酸探针，其碱基序列如：SEQ ID NO :50。
3. 根据权利要求2所述的用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的试剂盒，其特
【专利摘要】本发明涉及基因检测试剂盒，尤其涉及一种幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和PCR反应液；所述PCR反应液包括：PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ和PCR反应液Ⅳ；所述PCR反应液还分别含有内控引物1对。本发明的幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒能在一次试验中，区分HP的2个分型，并检测与5个治疗药物耐药相关的9个热点突变位点的15种突变类型，用VacA基因和CagA基因进行分型，为病情的判断提供参考依据；耐药突变检测的突变类型更多更全面，可以快速、全面地评价患者感染的HP发生基因耐药的情况。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公开号】CN104846097
【申请号】CN201510263242
【发明人】裘惠良, 郑银娜, 邹耀东, 田洁
【申请人】杭州千基生物科技有限公司, 杭州美联生物科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月21日