水稻育性调控构建体及其转化事件和应用的制作方法

水稻育性调控构建体及其转化事件和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物分子生物学和育种领域。具体地，本发明的实施方案涉及含有制种技术事件和位于转基因序列侧翼的植物基因组DNA的转基因水稻植物。更具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建水稻雄性不育系、保持系的方法以及转化事件，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种转化事件，一种水稻转化事件7R-949D，一种水稻转化事件7R-1425D，一种用于检测水稻转化事件的引物，一种用于检测水稻转化事件的试剂盒，具体地，利用该试剂盒鉴定插入的T-DNA和植物基因组DNA的结合区域并进一步鉴定转化事件的种子及其它组织的方法，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。
【专利说明】水稻育性调控构建体及其转化事件和应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及植物分子生物学和育种领域。具体地，本发明的实施方案涉及含有制种技术事件和位于转基因序列侧翼的植物基因组DNA的转基因水稻植物。更具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建水稻雄性不育系、保持系的方法以及转化事件，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种转化事件，一种水稻转化事件7R-949D，一种水稻转化事件7R-1425D，一种用于检测水稻转化事件的引物，一种用于检测水稻转化事件的试剂盒，具体地，利用该试剂盒鉴定插入的T-DNA和植物基因组DNA的结合区域并进一步鉴定转化事件的种子及其它组织的方法，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。

【背景技术】
[0002]水稻杂交育种中常用的是“三系”和“两系”杂交。“三系”杂交需要有特定的恢复系和保持系，育种程序和生产环节复杂，选育新不育系及新组合的周期长、效率低，种质资源的利用率低于5%。另外，三系杂交稻杂种优势较弱，不育细胞质较单一，存在某种毁灭性病虫害暴发的潜在危险。“两系”杂交水稻由于不受恢复系、保持系之间关系的制约，亲本的遗传多样性得到明显改善，选育出高产杂交稻组合的速度明显加快，促进了超级杂交稻的研究和生产。但目前“两系”杂交中采用的不育系多为“光温敏”不育系，其育性受环境中的温度和光照影响。这些环境因素的不稳定会直接影响杂交种子的纯度和数量，加大制种风险，严重时会使企业和农民造成重大经济损失，限制“两系”杂交稻的大面积推广。而且利用目前技术所能选用的两系杂交稻不育系十分有限，例如粳稻品种中几乎没有很好的两系杂交组合，限制了品种资源的充分利用。因而，培育不受环境影响且可自主繁殖的稳定不育系已成为限制“两系”杂交技术广泛应用的技术瓶颈。
[0003]因而，目前的水稻杂交技术仍有待改进。
[0004]外源基因在植物中的表达是受其在植物基因组中的插入位点影响的，这有可能是由于插入位点周围的染色质结构(如异染色质的结构)或附近的转录调节元件(如增强子)的调节引起的(Weising et al., Foreign genes in plants:transfer, structure,express1n, and applicat1ns.(1988)Ann.Rev.Genet22:421-477)，例如，可以观察到在外源基因转化得到的插入位点不同的众多株系之间，外源基因的表达水平存在较大的差别，也可以观察到外源基因在不同转化株系中存在时空的表达差异，且这种差异不是人为选用的启动子等表达调控元件构建的表达框造成的。同时，外源基因在植物基因组的不同位置的整合会对植物的整体表型造成影响，比如，外源基因在植物基因组中的插入会使插入位点处的植物内源基因的表达收到影响。因此，在转化事件的创制过程中，有必要生产成千上万的独立转化株系，通过筛选大量的转化株系，鉴定得到符合产业化要求的一个最优化事件，具备合乎要求的外源基因整合位点和表达水平/模式，同时对植物的其它表型不造成影响。进一步，可以通过回交转育的常规育种方法，将该最优化事件的外源基因通过杂交转育到其他遗传背景的品种中去，而这些杂种的子代被赋予了最初转化体的转基因表达特性，同时，还保持了原有品种的各种优良性状。
[0005]在植物或种子或其子代或有性杂交的子代中，特异性检测特定转化事件的存在或不存在是非常重要的，事件特异性检测方法可以鉴定插入的外源DNA和受体基因组之间独特的接合(junct1n)，这不仅涉及转基因自身，还涉及其在宿主植物或种子的基因组中的插入整合位置。此外，用于检测特定事件的方法对于植物食品的上市前许可和标签的规定、或环境监测及监测田地中作物的性状等也是非常有帮助的。


【发明内容】

[0006]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效构建新型稳定的隐性水稻雄性不育系和充分利用水稻种质资源用于杂交育种、提高杂交种纯度的手段。
[0007]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人以纯合隐性核雄性不育水稻突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育水稻突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是水稻育性恢复基因、花粉失活基因和颜色标记筛选基因。其中，育性恢复基因可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系:其中，育性恢复基因0sCYP704B2(对应野生型的水稻MS26基因)可使转化受体育性恢复；花粉失活基因Zm-AAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因DsRed(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。
[0008]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雄性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的母本。由此，可以有效地用于水稻杂交，得到的杂交种也为非转基因。
[0009]由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。
[0010]在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，因此能够进行自体受精，可以得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子，两者各占50%。其中，不携带外源基因的种子可以作为水稻雄性不育系。从而，可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0011]在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。
[0012]在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。在本发明的第六方面，本发明提出了一种转化事件。根据本发明的实施例，所述转化事件是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的，其中，所述构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雄性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的母本。由此，可以有效地用于水稻杂交。由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。
[0013]在本发明的第七方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-949D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-949D的基因组中包含选自SEQ ID NO: 13、14、17、18和53的至少一种DNA序列。由此，根据本发明的实施例,本发明提出了一种植物,其中,所述植物包含水稻转化事件7R-949D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO: 13、14、17、18和53的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。
[0014]在本发明的第八方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-1425D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-1425D的基因组中包含选自SEQ ID NO:15、16、19、20和54的至少一种DNA序列。由此，根据本发明的实施例,本发明提出了一种植物,其中,所述植物包含水稻转化事件7R-1425D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO: 15、16、19、20和54的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。
[0015]在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的引物。根据本发明的实施例，用于检测水稻转化事件7R-949D的引物，其特征在于，所述引物包含选自SEQ ID NO:13、14、17、18、53或其互补序列的至少一种。用于检测水稻转化事件7R-1425D的引物，其特征在于，所述引物包含选自SEQID N0:15、16、19、20、54或其互补序列的至少一种。
[0016]在本发明的第十方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所述的引物。
[0017]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

【专利附图】

【附图说明】
[0018]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0019]图1为根据本发明一个实施例的植物表达载体p7R的结构示意图。其中，自右边界，依次包含了 PG47启动子:=ZM-BTl导肽::ZM_AA1基因::IN2_1终止子表达框，0sCYP704B2基因表达框，和END2启动子::DsRed(r)基因::PINII终止子表达框。
[0020]图2显示了根据本发明一个实施例的可育花粉粒和败育花粉粒(不可育)的I2-1K染色结果，其中7R-949D表示7R-949D的染色结果；7R-142?表示7R-1425D的染色结果。
[0021]图3是转化事件7R-949D中的T-DNA插入位点及整合方式示意图。在该转化事件的基因组中，整合了 2个T-DNA，分别为图示的T-DNAl和T-DNA2。
[0022]图4是转化事件7R-949D中T-DNA插入序列与邻近基因位置关系及验证引物示意图，其中SP3为根据T-DNA序列设计的引物，A949B-L-1和A949B-R为根据插入位点侧翼的基因组序列设计的引物，其中引物A949B-L-1和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为981bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID N0:74所示；引物A949B-R和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为540bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示。
[0023]图5是转化事件7R-1425D中的T-DNA插入位点及插入方式示意图。在该转化事件的基因组中，整合了 I个T-DNA，其右边界为RB，左边界为LB。
[0024]图6是转化事件7R-1425D中T-DNA插入序列与邻近基因位置关系及验证引物示意图。其中7RB-3和SP3为根据T-DNA序列设计的引物，A1425RB-2和A1425LB-2为根据插入位点侧翼的基因组序列设计的引物，其中引物A1425RB-2和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为864bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 76所示；A1425LB_2和SP3进行PCR扩增获得的片段大小为954bp，其具体的核苷酸序列如SEQ ID N0:77所示。
[0025]图7是转化事件7R-949D中T-DNA上探针位置及酶切位点示意图，7A显示了目的基因上探针序列位置及Hind III酶切位点；7B显示了色选基因上探针序列位置及EcoR I酶切位点。
[0026]图8是转化事件7R-1425D以0sCYP704B2为探针的预期杂交片段大小及Hind III酶切位点示意图。
[0027]图9是转化事件7R-1425D以Zm-AAl和DsRed(r)为探针预期杂交片段大小及EcoR I酶切位点示意图。
[0028]图10是转化事件7R-949D T2、T3和T4代植株以目的基因为探针的Southernblot结果，其中电泳泳道1、7和13:分子量标准；2、8和14:阳性对照(质粒DNA) +武运粳7号DNA - BamHI ;3、9和15:阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI) ;4、5和6:7R-949D - Hind II1-T2 代 3 个独立的转基因单株;10、11 和 12:7R-949D - Hind II1-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18:7R-949D - Hind II1-T4代3个独立的转基因单株。
[0029]图11是转化事件7R-949D T2、T3和T4代植株以色选基因为探针的Southernblot结果，其中电泳泳道1、7和13:分子量标准；2、8和14:阳性对照(质粒DNA) +武运粳7号DNA - BamHI ;3、9和15:阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA-BamHI) ;4、5和6:7R-949D - EcoR 1-T2 代 3 个独立的转基因单株;10、11 和 12:7R-949D - EcoR 1-T3 代 3个独立的转基因单株；16、17和18:7R-949D-EcoR I_T4代3个独立的转基因单株。
[0030]图12是转化事件7R-1425D Τ2、Τ3和Τ4代植株以0sCYP704B2基因为探针的Southern blot结果，其中电泳泳道1、7和13:分子量标准；2、8和14:阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA - BamHI ;3、9和15:阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA - BamHI )；
4、5 和 6:7R-1425D - Hind II1-T2 代 3 个独立的转基因单株;10、11 和 12:7R-1425D - HindII1-T3代3个独立的转基因单株;16、17和18:7R-1425D - Hind II1-T4代3个独立的转基因单株。
[0031]图13是转化事件7R-1425D T2、T3和Τ4代植株以Zm-AAl基因为探针的Southernblot结果，其中电泳泳道1、7和13:分子量标准；2、8和 14:阳性对照(质粒DNA) +武运粳7号DNA - BamHI ;3、9和15:阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA - BamHI) ;4、5和6:7R-1425D -EcoR I_T2 代 3 个独立的转基因单株;10、11 和 12:7R-1425D - EcoR 1-T3 代3个独立的转基因单株；16、17和18:7R-1425D-EcoR 1-T4代3个独立的转基因单株。
[0032]图14是转化事件7R-1425D T2、T3和T4代植株以DsRed (r)基因为探针的Southern blot结果，其中电泳泳道1、7和13:分子量标准；2、8和14:阳性对照(质粒DNA)+武运粳7号DNA - BamHI ;3、9和15:阴性对照(武运粳7号ms26/ms26突变体DNA - BamHI )；
4、5 和 6:7R-1425D -EcoR 1-T2 代 3 个独立的转基因单株;10、11 和 12:7R-1425D - EcoR1-T3代3个独立的转基因单株；16、17和18:7R-1425D - EcoR 1-T4代3个独立的转基因单株。
[0033]图15是RT-PCR鉴定T2代转化事件7R-949D3个目标基因表达模式图，其中根为苗期根；茎为苗期茎；叶为苗期叶；P3期为颖花原基分化期幼穗；P6期为花粉母细胞减数分裂时期幼穗；P8期为花粉成熟期幼穗；种子为籽粒成熟期的种子；突变体为武运粳7号ms26/ms26 ;野生型为武运粳7号；空白对照为以水为扩增模板；阳性对照为以转化体基因组DNA为扩增模板。
[0034]图16是RT-PCR鉴定T2代转化事件7R-1425D3个目标基因表达模式图，其中根为苗期根；茎为苗期茎；叶为苗期叶；P3期为颖花原基分化期幼穗；P6期为花粉母细胞减数分裂时期幼穗；P8期为花粉成熟期幼穗；种子为籽粒成熟期的种子；突变体为武运粳7号ms26/ms26 ;野生型为武运粳7号；空白对照为以水为扩增模板；阳性对照为以转化体基因组DNA为扩增模板。
[0035]图17显示了根据本发明一个实施例，水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，通过转基因所得到的转化体通过自交得到不育系的示意图，其中受体(ms/ms)指纯合隐性核雄性不育转基因受体材料；保持系含有纯合隐性核雄性不育位点和转基因杂合位点，因此为可育；不育系含有纯合隐性核雄性不育位点且不含转基因，因此为雄性不育；保持系产生的花粉一半含有转基因，一半不含有转基因；保持系结实产生50%的不育系种子和50%的保持系种子。
[0036]发明详细描述
[0037]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0038]本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
[0039]除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。
[0040]术语“事件”指包括异源DNA的原始转化体和该转化体包括但不限于通过自交或杂交或无性繁殖产生的子代。通过用异源DNA，即，包括目标转基因的核酸构建体对植物细胞进行转化，由转基因插入到特定植物基因组中产生的植物群体的再生，和选择以对特定基因组位置的插入为特征的特定的植物，来产生转基因“事件”。因而，术语“事件”还指通过在转化体和另一个包括异源转基因DNA和侧翼基因组DNA的品种之间进行有性的异型杂交生产的子代。术语“事件”还指来自原始转化体的、包含插入的DNA和紧密邻近于插入的DNA的侧翼基因组序列的DNA，期待着将其转移到子代中，该子代作为包括插入的DNA的一个亲本系(例如，原始转化体和自交或无性繁殖的子代)与不含有该插入的DNA的亲本系进行有性杂交的结果 ，接受了包括目标转基因的插入DNA。
[0041]术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0042]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人以水稻核隐性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至不育系:育性恢复基因0sCYP704B2可使转化受体育性恢复，花粉失活基因Zm-AAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，荧光色选基因DsRed(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。
[0043]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到水稻植株例如水稻纯合隐性雄性不育植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系。另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交之中的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0044]在本文中，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体(有时也称为表达载体、遗传载体或载体)呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本发明的实施例，可以采用Ti载体，例如可以采用将第一和第二表达盒设置在表达载体P7R的T-DNA之左右边界之间。由此，可以通过农杆菌介导的转化方法将第一和第二表达盒转化至受体植株，例如水稻ms26隐性核雄性不育突变体中。由此，可以获得不含除草剂抗性标记基因和抗生素抗性标记基因的水稻转化株系。如此获得的转化株系有如下特点:(I)转化位点在各世代始终处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因仅通过雌配子传递至下一代，不会通过花粉漂移到环境中；(2)转化体自交可结实，所结可育种子(带荧光标记)与不育种子(不带荧光标记)的比例为1:1，可育株(带有外源基因)用作保持系，可以通过自交方便地、源源不断地生产不育系和保持系，不育株(不含转基因成分)在生产上用作杂交制种的亲本；(3)因为不育株不含转基因，因此用其生产的杂交种子不含转基因，用此杂交种生产的水稻商品粮食更不含转基因，从而消除了转基因生物安全的隐患。该新型杂交育种体系为充分利用水稻杂种优势提供了切实可行的技术新突破。
[0045]在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
[0046]根据本发明的实施例，水稻雄性不育恢复基因的类型并不受特别限制。在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因编码具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的蛋白质。即，可以采用的水稻雄性不育恢复基因为0sCYP704B2，由此，可以将其作为水稻受体ms26纯合突变体(完全雄性不育)的野生型育性恢复基因。0sCYP704B2基因编码的蛋白属于细胞色素P-450家族，在花药发育的P8到PlO阶段的绒粘层和小孢子中特异表达。该基因突变后会导致绒粘层膨胀，花粉外壁残缺而发育终止及花药角质层终止发育，从而导致植株雄性不育，而雌性育性正常。进一步的化学成分分析发现，在该基因缺失突变体的花药中，几乎检测不到角质单体，进而发现该基因的功能是催化产生含有16和18个碳链的羟基脂肪酸。
[0047]根据本发明的具体实施例，在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。与野生型的0sCYP704B2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)相比，SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列引入了三个单核苷酸突变，但不改变其编码的氨基酸序列，这三个单核苷酸突变在0sCYP704B2基因编码区上的位置及具体突变分别为:238位核苷酸A突变为C ；240位的核苷酸G突变为C ；243位的核苷酸G突变为C。发明人惊奇地发现，利用该SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列能够便于在各种分子鉴定中区别外源基因与内源基因，并且能够更有效地使水稻mS26/mS26不育受体植株的育性得到恢复。水稻受体ms26纯合突变体是经过辐射诱导所得，突变是由3103bp缺失(包含0sCYP704B2大部分片段)导致(缺失区段物理位置:ensembl plants oryza japonica groupvers1n64.6 (MSU6) chromosome3:3, 701, 319-3，704, 421)。大片段缺失突变使回复突变的概率极低，因此不育性状稳定，从而保障了不育系的稳定性，降低杂交制种风险。
[0048]在本发明的一个实施例中，所述第一表达盒还可以进一步包括:第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子特异性启动子；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。根据本发明的实施例，第一启动子和第一终止子的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，对于0sCYP704B2基因，可以采用0sCYP704B2的内源启动子、ORF区及终止区的序列，均为野生水稻基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够进一步显著地提高表达相应蛋白的效率，进而能够提高利用构建体构建不育系的效率，并且能够更有效地使水稻ms26/ms26不育受体植株的育性得到恢复。
[0049]根据本发明的实施例，花粉失活基因的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因编码具有如SEQ ID NO:21所不氣基酸序列的蛋白质。由此，可以编码Zm-AAl所编码的α-淀粉酶。α _淀粉酶属于糖基水解酶。该基因是从授粉10天后的玉米胚和胚乳的cDNA文库中分离得到，其功能是催化水解多糖分子(例如淀粉)的(1-4)-a -D-葡萄糖苷。玉米内源的Zm-AAl基因主要在萌发的种子的盾片组织中表达，玉米花粉中检测不到该基因的表达。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因具有如SEQ IDNO:9所不的核昔酸序列。由此，可以进一步提闻表达相应蛋白的效率。根据本发明的实施例，第二表达盒进一步包括:第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为花粉特异性启动子；以及第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。由此，可以更有效的提高相应基因的表达效率。另外，根据本发明的实施例，在第二表达盒中还可以进一步包括编码导肽的序列，由此，第二表达盒可以有效地编码具有导肽的花粉失活蛋白，由此，可以使得目的基因(花粉失活基因)能够被靶向定位到特定的细胞器中。例如，根据本发明的实施例，编码导肽的序列具有如SEQ ID Ν0:36所示的核苷酸序列(来自于玉米的brittle-Ι基因的编码导肽(TP)的序列)。由此，可以有效地将所表达的蛋白靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。进而，根据本发明的具体实施例，该基因在玉米花粉特异性启动子PG47驱动下，与来自于玉米的brittle-Ι基因的编码导肽(TP)的序列及终止子IN2-1组成表达框，可在发育后期的成熟花粉中特异性表达淀粉酶，并靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。
[0050]另外，根据本发明的实施例，构建体还可以进一步包括:第三表达盒，所述第三表达盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码筛选基因，所述筛选基因为发光基因。由此，便于通过筛选基因的表达来确定植物及其部分是否含有构建体所引入的基因。
[0051]根据本发明的实施例，可以采用选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因的至少一种作为筛选基因。在本发明的一个实施例中，可以采用红色荧光蛋白作为筛选基因。红色突光蛋白基因(DsRed),来源于礁珊瑚(Discosoma sp.),是表达框内唯一非粮食作物来源的基因序列。红色荧光蛋白最大吸收波长为558nm，最大发射波长为583nm。将DsRed编码的氨基酸序列通过与过敏原及毒蛋白序列比对显示，相似性极低，无毒性及致敏性。DsRed常用作遗传转化的筛选基因，从未发生过转基因生物安全事题。在本发明的一个实施例中，所述筛选基因具有如SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。由此，可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强DsRed基因在水稻中的表达。SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列与野生型DsRed基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示)相比，具有两个单核苷酸突变，命名为DsRed(r)。这两个单核苷酸突变分别为:由第21位碱基C转换为G、由第315位碱基G转换为C。发明人惊奇地发现，可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强红色荧光蛋白基因在水稻中的表达。
[0052]在本发明的一个实施例中，所述第三表达盒进一步包括:第三启动子，所述第三启动子与所述第三核酸分子可操作地相连，所述第三启动子为愈伤组织或种子特异性的启动子；第三终止子，所述第三终止子与所述第三核酸分子可操作地相连。在本发明的一个实施例中，所述第三启动子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第三终止子具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，DsRed(r)的开放读码框连接于来自玉米且为愈伤组织和种子(胚和胚乳)特异性启动子END2和来自马铃薯的终止子Pin II之间，重组成DsRed(r)基因表达盒(END2::DsRed(r):: PINlD0含有该表达框的水稻种子在荧光激发下呈现非常容易辨认的红色，因此该表达框在本发明中用于辨认和分选保持系和不育系种子。
[0053]由此，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的构建体，以非转基因隐性核雄性不育水稻(mS26/mS26)作为转化的受体，进行遗传转化，得到整合含有以下紧密连锁的三个外源基因DsRed(r)，Ms26，Zm_AAl的水稻保持系，Ms26即0sCYP704B2育性基因。外源基因的插入与内源雄性不育位点(mS26/mS26)是非连锁的，因此得到的转基因水稻保持系含有独立的纯合的ms26隐性不育位点及杂合的外源基因(包括0sCYP704B2基因)整合位点。
[0054]由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。在本发明的一个实施例中，所述水稻细胞、组织或器官来自水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，本发明的水稻细胞、组织或器官，可以有效地用于构建雄性不育株。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该水稻细胞、组织或器官，不再赘述。
[0055]由此，在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图17，该方法包括:将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源基因处于杂合状态，因此第二水稻植株中有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)。进而培育所得到的第二水稻植株，通过第二水稻植株即转化体的自交受精，可以得到不携带外源基因的种子，从而构建水稻雄性不育系。根据本发明的实施例，第一水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。另外，根据本发明的实施例，可以通过荧光检测进行分拣的步骤，即通过检测水稻种子是否携带发光基因，例如是否发出荧光来进行分拣，区分其是否携带外源基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0056]在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0057]在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。在本发明的一个实施例中，所述水稻植株为水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。
[0058]在本发明的第六方面，本发明提出了一种转化事件。根据本发明的实施例，所述转化事件是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。在本发明的一个实施例中，所述转化事件为选自7R-949D和7R-1425D的至少一种。在本发明的一个实施例中，通过农杆菌介导法引入所述构建体。
[0059]根据本发明的实施例，本发明利用农杆菌转化法将紧密连锁的0sCYP704B2、ZM-AAl及DsRed (r)基因转化到水稻中，获得了遗传稳定的7R-949D和7R-142?转基因水稻株系。采用TAIL-PCR技术，对Tl代植株T-DNA插入位置的旁侧序列进行了扩增，获得旁侧序列；将获得的旁侧序列进行测序分析，并与数据库(MSU Rice GenomeAnnotat1n Project Release7,发布时间 2011 年 10 月 31 日，ftp://ftp.plantb1logy.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotat1n_dbs/pseudomolecules/vers1n_7.0/)中水稻基因组序列进行比对，发现7R-949D和7R-1425D的T-DNA插入位点分别定位在第3号染色体短臂近着丝粒处(物理位置为Chr3:14，746，015-14，746，027)和第I号染色体长臂远端(物理位置为Chrl:42，215，016-42，215，095)，两者均未插入水稻内源基因内部；而后，对接合区域进行PCR扩增以验证外源T-DNA插入位置并初步推测T-DNA整合方式，即以旁侧序列及T-DNA侧序之间为靶序列进行PCR扩增，结果与预期相符，进一步证实了 T-DNA插入位点的正确性，并且显示7R-949D为反向串联的双拷贝整合，而7R-1425D内T-DNA为单拷贝插入。
[0060]由此，在本发明的第七方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-949D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-949D的基因组中包含选自SEQ ID NO: 13、14、17、18和53的至少一种DNA序列。另外，根据本发明的实施例,本发明提出了一种植物,其中,所述植物包含水稻转化事件7R-949D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO:13、14、17、18和53的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。在本发明的第八方面，本发明提出了一种水稻转化事件7R-1425D。根据本发明的实施例，该水稻转化事件7R-1425D的基因组中包含选自SEQ ID NO: 15、16、19、20和54的至少一种DNA序列。另外，根据本发明的实施例,本发明提出了一种植物,其中,所述植物包含水稻转化事件7R-1425D。即在该植物的基因组中包含了选自SEQ ID NO: 15、16、19、20和54的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。
[0061]另外，本发明还提供了一种转基因检测方法及其组合物，用于检测来自水稻事件7R-949D的植株或种子，或来自该转基因植株的部分或种子的产物的转基因/基因组DNA连接区的检测。转化事件7R-949D，其完整外源插入序列为如SEQ ID NO:53所示，其T-DNA区与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列(又称嵌合DNA分子)如SEQ ID NO:17所示，其中第1-10位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA，第11-20位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列；与3’端侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO:18所示，其中第1_10位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列，第11-20位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA。在本发明中，上述连接序列还可以在SEQ ID NO: 17和18的基础上，包括更长的基因组DNA序列和外源插入的T-DNA序列，更具体的，所述外源插入T-DNA序列与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO:13所示 ，其中SEQID NO: 13的第884-903位核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示；所述外源插入T-DNA序列与插入位点的3’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO:14所示，其中SEQ ID NO: 14的第497-516位核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示。所有这些序列以及包含这些序列的植物和种子构成本发明的一个方面。由此，本发明提供了一种新的DNA序列，该序列来自转化事件7R-949D的DNA转基因/基因组区域的SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 14或其互补DNA分子。在其基因组中包含SEQID NO:13, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 14或其互补DNA分子的水稻植株和种子均在本发明的保护范围之内。
[0062]本发明还提供了一组PCR引物用于转化事件7R-949D的DNA检测，其中，该一组PCR引物包含第一 PCR引物和第二 PCR引物，其中第一 PCR引物包含SEQ ID N0:13的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二 PCR引物来自SEQ ID NO:13的5’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，这些核酸分子作为引物分子在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第一 PCR引物包含SEQ ID N0:14的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二 PCR引物来自SEQ ID NO:14的3’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，该一组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第一 PCR引物和第二 PCR引物均来自SEQ ID N0:53,包含序列SEQ ID NO:53的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，该一组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。通过使用上述引物进行PCR获得的扩增产物，可以用于检测出水稻转化事件7R-949D。所述DNA扩增产物中包含部分或全部的SEQ ID N0:13、14、
17、18或53所示的DNA序列。
[0063]本发明还提供了一种转基因检测方法及其组合物，用于检测来自水稻事件7R-1425D的植株或种子，或来自该转基因植株的部分或种子的产物的DNA转基因/基因组连接区的检测。转化事件7R-1425D，其完整外源插入序列如SEQ IDNO:54所示，其外源插入T-DNA序列与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO:19所示，其中第1_10位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA，第11-20位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列；外源插入T-DNA序列与插入位点的3’端侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO:20所示，其中第1-10位的核苷酸序列为外源插入的T-DNA序列，第11-20位的核苷酸序列为水稻内源基因组DNA。在本发明中，上述连接序列还可以在SEQ ID NO: 19和20的基础上，包括更长的基因组DNA序列和外源插入的T-DNA序列，更具体的，所述外源插入T-DNA序列与插入位点的5’侧翼序列构成的连接序列可以如SEQ IDNO:15所示，其中SEQ ID NO: 15的第817-836位核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示；所述外源插入T-DNA序列与插入位点的3’侧翼序列构成的连接序列如SEQ ID NO:16所示，其中SEQ ID NO: 16的第398-417位核苷酸序列如SEQ IDN0:20所示。所有这些序列以及包含这些序列的植物和种子构成本发明的一个方面。由此，本发明提供了一种新的DNA序列，该序列来自转化事件7R-1425D的DNA转基因/基因组区域的SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 54或其互补DNA分子。在其基因组中包含SEQ ID N0:15或SEQ ID NO: 16或其互补DNA分子的水稻植株和种子均在本发明的保护范围之内。
[0064]本发明还提供了一组PCR引物用于转化事件7R-142?的DNA检测，该组PCR引物包括第三PCR引物和第四PCR引物。其中第三PCR引物包含SEQ IDNO: 15的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第四PCR引物来自SEQ ID NO:15的5’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，这些核酸分子作为引物分子在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第三PCR引物包含SEQ ID NO:16的T-DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第四PCR引物来自SEQ ID NO:16的3’侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的的类似长度的连续多核苷酸，该组PCR引物作为引物分子在一起进行PCR扩增时是有效的。或是第三PCR引物和第四PCR引物均来自SEQ IDN0:54，包含序列SEQ ID NO:54的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，该组PCR引物在一起进行PCR扩增时是有效的。通过使用上述引物进行PCR获得的扩增产物，可以用于检测水稻转化事件7R-1425D。所述扩增产物中包含部分或全部的SEQ ID N0:15、16、19、20或54所示的DNA序列。
[0065]在本文中所使用的术语“引物”是分离的多核酸，其通过核酸杂交与互补的目标多核酸链退火形成引物和目标多核酸链的杂交体，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶沿目标多核酸链延伸。本发明的引物对涉及它们用于扩增目标多核酸分子的扩增的用途，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。
[0066]本发明的引物可以在严格条件下与目标DNA序列杂交。可使用任何常规的核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自7R-949D事件或7R-1425D的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其他核酸分子特异性杂交。如此处使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构并且有足够长度以在高严格条件下维持这种结构，则称为两个核酸分子能相互特异性地杂交。如果核酸分子显示出完全的互补性，则称核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如此处使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，称为分子显示出“完全的互补性”。如果分子的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持相互的退火，称两个分子是“最低度互补的”。类似地，如果分子的相互杂交具有足够的稳定性以允许它们在常规的“高严格”条件下保持相互的退火，称所述分子是“互补的”。Sambrook et al., 1989, and by Haymes etal.(1985)描述了常规的严格条件。因而从完全互补性的偏离是可允许的，只要这种偏离不完全地排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子作为引物或探针，仅需在序列中充分的互补，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0067]如此处使用的，基本上同源的序列是在高度严格条件下与其相比较的核酸序列的互补物特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)约45°C，之后是在50°C用2.0XSSC洗涤，对本领域的技术人员是公知的。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格的约2.0 X SSC、50 V到高度严格的约0.2 X SSC、500C。此外，洗涤步骤中的温度可以从低度严格条件的室温下约22°C，升高到高度严格条件的约65°C。温度和盐度可以都变化，或者温度或盐浓度保持不变而另一个变量发生改变。在优选的实施方式中，本发明的核酸将在中度严格条件下，例如在约2.0XSSC和约65°C下特异性地杂交需要扩增的核酸分子。
[0068]关于使用特定的扩增引物对进行目标核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”是允许引物对仅与目标核酸序列杂交的条件，具有相应的野生型序列(或其互补物)的引物将与所述目标核酸序列结合，优选的在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物，扩增子。
[0069]术语“特异于(目标序列)”是指引物在严格杂交条件下仅与包含目标序列的样品中的目标序列杂交。
[0070]如在此使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板的部分的目标核酸序列的核酸扩增的产物。 例如，为了确定产自有性杂交的植物是否含有转基因事件7R-949D，或采集自田间的样品是否包含7R-949D，或植物提取物是否包含7R-949D。从植物组织样品或提取物中提取的DNA可以使用包括引物对的核酸PCR扩增方法，所述引物对包括来源于邻近插入的异源转基因DNA的插入位点的基因组区域的引物，和来源于插入的异源转基因DNA的第二引物，来产生对于事件DNA的存在是诊断性的扩增子。扩增子具有一定长度并具有序列，所述序列对所述事件也是诊断性的。扩增子的长度可根据引物对加上一个核苷酸碱基对、或加上约五十个核苷酸碱基对，或加上约两百五十个核苷酸碱基对，或加上约三百五十个核苷酸碱基对或更多的组合长度而变化。
[0071]做为选择，引物对可以来源于插入的T-DNA两侧的侧翼基因组序列，以获得包括整个T-DNA插入核苷酸序列的扩增子。来自植物基因组序列的引物对的成员可以选自距插入的转基因T-DNA分子一定距离内，该距离可以从一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对间变化。术语“扩增子”的使用要特别排除可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚物。
[0072]可以通过本领域已知的各种核酸扩增反应方法的任一种，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现核酸扩增。各种扩增方法是本领域已知的，这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明的实践中。可以提供多种技术来检测这些方法产生的扩增子。一个这种方法是 Genetic Bit Ananlysis (Nikiforov, et al.，1994),其中设ii DNA 寡核苷酸，其覆盖邻近的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA转基因序列。将寡聚核苷酸固定在微孔平板的孔中。在对目标区域进行PCR之后(使用T-DNA插入序列中的一个引物，和邻近侧翼基因组序列中的一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡聚核苷酸杂交并充当模板，用于利用DNA聚合酶和特异于期待的下一个碱基的标记的ddNTP进行单碱基延伸反应。读出过程可以是基于荧光的或基于ELISA的信号。信号指示了由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸导致的插入物/侧翼基因组序列的存在。
[0073]另一种方法是Winge (2000)描述的Pyrosequencing技术。在这个方法中设计一寡核苷酸，其覆盖邻近的基因组DNA和插入物DNA接点。使寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物(一个引物在插入的序列中，一个在侧翼基因组序列中)杂交，在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷酸5’磷酸和萤光素的情况下孵育。分别地添加DNTPs，测量产生光信号的掺入。光信号指示了由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸导致的转基因插入物/侧翼序列的存在。
[0074]Chen等(1999)描述的荧光偏振是可以用于检测本发明的扩增子的一种方法。使用这种方法设计一寡核苷酸，其覆盖基因组侧翼和插入的DNA接点。使寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物(一个引物在插入的DNA序列中，一个在侧翼基因组DNA序列中)杂交，在存在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的情况下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。利用荧光计测量偏振的变化可以测量掺入。偏振的变化指示了由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸导致的转基因插入物/侧翼基因组序列的存在。
[0075]Taqman? (PE Applied B1systems, Foster City, CA)被描述为一种对DNA序列的存在进行检测和定量的方法，可以根据厂家提供的说明完全理解。简要地，设计一寡核苷酸探针，其覆盖基因组侧翼和插入的DNA接点。在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下，FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中以及一个在侧翼基因组序列中)进行循环。FRET探针的杂交引起FRET探针上荧光部分从淬灭部分裂解和释放。荧光信号指示了由于成功的扩增和杂交产生的侧翼基因组/转基因插入物序列的存在。
[0076]在如Tyangi et al.(1996)中描述的,Molecular Beacons已经被用于序列检测中。简要地，设计一 FRET寡核苷酸探针，其覆盖侧翼基因组和插入物DNA接点。该FRET探针的独特的结构造成其含有二级结构，该二级结构使荧光和淬灭部分保持邻近。在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下，FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中以及一个在侧翼基因组序列中)进行循环。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对目标序列的杂交引起探针二级结构的消除和荧光部分与淬灭部分的空间分隔，产生荧光信号。荧光信号指示了由于成功的扩增和杂交产生的侧翼基因组/转基因插入物序列的存在。
[0077]其他描述的方法，例如microfluidics提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备(W0/06024023)对于检测本发明的DNA分子也是有用的。
[0078]由此，在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的引物。根据本发明的实施例，该引物包括选自SEQ ID N0:13、14、15、16及其互补序列的至少一种。由此，可以通过PCR反应有效地对水稻转化事件进行检测，尤其是可以有效地检测水稻转化事件7R-949D和7R-142?的至少一种。在本发明的第十方面，本发明提出了一种用于检测水稻转化事件的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所述的引物。
[0079]在本发明的第十一方面，本发明提出了一种用于制备杂交水稻的方法。根据本发明的实施例，该方法采用水稻雄性不育系，该水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0080]在本发明的第十二方面，本发明提出了水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该用途，不再赘述。
[0081]在本发明的又一方面，本发明还提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括采用水稻纯合隐性雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因；将母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，利用本发明的方法，可以在MS26纯合隐性雄性水稻不育系的基础上，发展更多的不同遗传背景的不育系。根据本发明的实施例，利用常规回交育种方法，所有不同类型的水稻都可以创制成相应的智能不育系(即可以源源不断地生产相应的不育系品种)，使杂种优势资源利用达到95%以上。
[0082]本发明还提出了一种含有特定外源DNA序列的转基因水稻的组合物和方法，所述特定外源DNA序列通过水稻转化的方法引入受体植株中，并获得在本文中被称为“事件7R-949D”或“7R-949D”或“949D”或“事件949D”的事件。转化的植株或种子也可以称为“水稻7R-949D”或“水稻949D”等。本发明还提供了用于鉴定由事件7R-949D所衍生出的子代或是含有所述事件DNA的植株的材料和方法。
[0083]本发明提出了含有特定外源DNA序列的转基因水稻的组合物和方法，所述特定的外源DNA序列通过水稻转化的方法引入受体植株中，并获得在本文中被称为“事件7R-949D”或“7R-1425D”或“142?”或“事件1425D”的事件。转化的植株或种子也可以称为“水稻7R-1425D”或“水稻1425D”等。本发明还提供了用于鉴定由事件7R-142?所衍生出的子代或是含有所述事件DNA的植株的材料和方法。
[0084]本发明的实施例中还提出了一种特异的侧翼序列，所述“侧翼序列”又称为“旁侧序列”，在本发明中，所述侧翼序列可用于开发生物样品中的事件7R-949D和7R-142?的特异性鉴定方法。在一些实施方案中，还公开了 7R-949D和7R-1425D的左边界和右边界的侧翼区域序列，这些侧翼序列可用于设计特定的引物和探针。本发明还提供了基于上述特异性引物和探针，对生物样品中是否包含7R-949D和7R-142?进行鉴定的方法。
[0085]根据本发明的实施方案记载，本发明还提供了检测样品中与事件7R-949D和7R-1425D对应的DNA是否存在的方法。具体地，所述方法包括:Ca)将包含DNA的样品与DNA引物接触，所述DNA引物与从包含事件7R-949D或7R-1425D的植株中提取出的基因组DNA进行核苷酸扩增反应时，可以产生用于鉴定事件7R-949D或7R-1425D的特定扩增子；
(b)进行核酸扩增反应，产生扩增子；(c)检测鉴定所述扩增子。
[0086]含有事件7R-949D和7R-1425D中特定的外源插入序列与插入位点处的基因组旁侧序列所构成的连接序列的DNA分子，及与所述DNA分子同源或互补的序列，均在本发明的保护范围之内。
[0087]本发明实施方案中还提出了一种包含事件7R-949D中特定的侧翼序列或连接序列，具体如SEQ ID NO: 13、14、17或18所示的DNA分子，和包含事件7R-1425D中特定的侧翼序列或连接序列，具体如SEQ ID NO: 15、16、19或20所示的DNA分子。本发明实施方案中包括DNA序列，所述DNA序列由一条转基因插入序列和一条来自插入位点处的侧翼水稻基因组DNA组成，所述DNA序列可用于设计引物，所述引物可扩增出用于检测植物或植物材料中是否含有事件7R-949D或7R-1425D的扩增子产物。
[0088]本发明的实施方案中进一步提出了一种含有事件7R-949D的外源插入T-DNA区(其核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示)的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，和含有事件7R-1425D的外源插入T-DNA区(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 54所示)的至少11个或更多个核苷酸的DNA序列，或上述DNA序列的互补序列，以及与7R-949D的SEQ ID NO: 13,
14、17或18所示的侧翼水稻基因组DNA序列具有相似长度的DNA序列或其互补序列，或是与7R-1425D的SEQ ID NO: 15、16、19或20所示的侧翼水稻基因组DNA序列具有相似长度的DNA序列或其互补序列。上述DNA序列可作为DNA扩增中的引物序列。由上述引物所产生的扩增子可分别用于检测事件7R-949D或7R-1425D。因此，本发明的实施方案也包括由DNA引物产生的扩增子，所述DNA引物与7R-949D或7R-1425D的转基因T-DNA区或其特定的侧翼序列同源或互补。
[0089]本发明的实施方案中还提出了一种检测样品中对应于事件7R-949D或7R-1425D的DNA分子的方法，所述方法包括:(a)将从植物中提取出的DNA样品与DNA探针接触，所述探针包含在严谨杂交条件下能与从事件7R-949D或7R-1425D中提取的DNA杂交但在严谨杂交条件下不与对照植株DNA杂交的分子；(b)使样品和探针处于严谨杂交条件；(c)检测探针与DNA的杂交情况。更具体的，本发明实施方案中还提供了检测样品中对应于7R-949D或7R-142?的特定DNA分子的方法，所述方法包括(a)将探针与样品接触，所述样品为从水稻植株中提取出的DNA，所述DNA探针分子选自事件中特定的序列如连接序列的部分序列，所述DNA探针分子在严谨杂交条件下可以与事件7R-949D或7R-142?的DNA杂交，并且在严谨杂交条件下不能与对照水稻植株的DNA杂交；(b)使样品和探针处于严谨杂交条件下； (c)检测探针和DNA的杂交情况。
[0090]本发明实施方案进一步提供了一种生物样品中事件7R-949D或7R-1425D的DNA的检测试剂盒。所述试剂盒包含可用于PCR鉴定程序的第一引物和第二引物，所述第一引物可以特异性识别事件7R-949D或7R-142?的左边界或右边界侧翼序列，所述第二引物可以特异性识别事件7R-949D或7R-1425D中的外源插入DNA序列。本发明实施方案还提出了另一种检测生物样品中事件7R-949D或7R-142?的试剂盒，所述试剂盒包含一条特异性探针，所述特异性探针具有对应于以下序列或与以下序列互补的序列:与事件7R-949D或7R-1425D的特异性区域具有80%-100%的相似性的序列。对应于特异性区域的探针序列包含事件7R-949D或7R-1425D的部分5’或3’侧翼部分序列。
[0091]本发明实施方案还提出了一种为了其他目的而使用本发明已述及的实施方案中的方法和试剂盒，所述其他目的包括但不限于以下:鉴定植物、植物材料或产品中的事件7R-949D或7R-1425D，所述产品包括但不限于含有或源自植物的食品或饲料产品(新鲜的或加工过的)；为了区分出转基因材料和非转基因材料中的转基因材料；以及为了确定包含水稻事件7R-949D或7R-1425D的植物材料的质量。所述试剂盒还可以含有为了实施检测方法所必需的其他试剂和材料。
[0092]另一方面，本发明还提供了一种生产含有事件7R-949D或7R-142?的子代植株的方法。所述子代植株可以是自交或杂交植株。在其他实施方案中，本发明提出了一种用于事件7R-949D或7R-1425D的标记辅助育种的方法。另一方面，本发明还提出了一种包含事件7R-949D或7R-1425D的稳定转化的水稻植株。
[0093]创制种子生产技术事件7R-949D和7R-1425D的多核苷酸序列连在同样的DNA载体上，所述多核苷酸序列插入到水稻基因组的特定位置后获得事件7R-949D和7R-1425D。在已述染色体位置上携带7R-949D事件的植物含有如SEQ ID NO: 13、14、17或18所示的基因组/转基因插入序列构成的连接序列，在已述染色体位置上携带7R-142?事件的植物含有如SEQ ID NO: 15、16、19或20所示的基因组/转基因插入序列构成的连接序列。具有事件7R-949D或7R-142?的基因组插入位点的特性是可以增强育种效率，并且使利用分子标记在育种群体及其子代中追踪转基因插入序列成为可能。本发明还提供了用于水稻事件7R-949D或7R-1425D的植物、植物部分、种子和谷类产品的鉴定、检测和使用的多种方法和组合物。
[0094]在一些实施方案中，创制水稻7R-949D或7R-142?事件的多核苷酸序列还可以通过基因工程的方法进行分子聚集(molecular stack)。在其他实施方案中,所述分子聚集体还可以进一步包含至少一条其他的转基因多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可以赋予制种技术其他的特性或赋予转化植株其他植物性状。
[0095]在某些实施方案中，可以将目的多核苷酸序列进行任意组合创建分子聚集体，并转化植物以创制出具有所需性状组合的植株，以实现植物性状的聚集。本发明中所述的“性状”，是指特定DNA序列或DNA序列群组表达后所呈现出的表型。所述生成的组合还可以包括任何一个或多个目的多核苷酸序列的多个拷贝。所述性状聚集组合可以通过任何一种方法创制，包括但不限于通过传统方法进行植物育种，或是通过遗传转化的方法获得。如果序列是通过植物遗传转化来聚集的，则目的多核苷酸可以在任意时间、以任意方向进行组合。所述性状可以通过转化表达盒提供的目的多核苷酸序列在共转化操作步骤中引入。例如，如果要引入两条序列，那么两条序列可以包含在不同的转化表达盒(反式)中，或包含在同一个转化表达盒(顺式)中。所述序列的表达可以由同一个或是不同的启动子驱动。在某些情况，可能希望引入抑制目的多核苷酸序列表达的转化表达盒。也可以通过将抑制表达盒或过表达盒进行任意组合，以产生具有所需性状组合的植株。本领域技术人员还应该意识到，多核苷酸序列还可以通过位点特异性重组系统在所需的基因组位置进行聚集。上述技术参见专利 W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855 和 W099/25853，以上全部在此通过引用并入。
[0096]需要说明的是，根据本发明实施例的构建体及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。【具体实施方式】述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

【具体实施方式】
[0097]下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0098]实施例1:载体构建
[0099]通过装配下述DNA元件，构建如图1所示的被称为p7R的表达载体:
[0100]I)以pCAMBIA1300载体为基础，利用Xmn I和Bgl II酶切去除pCAMBIA1300质粒上的潮霉素抗性基因和花椰菜花叶病毒35S启动子序列；
[0101]2)基因表达盒 END2 =DsRed(r) -PINII,DsRed(r)基因(SEQ ID NO:1)的开放读码框连接于END2启动子(SEQ ID NO:2)和PINII终止子(SEQ ID NO:3)之间，重组成DsRed (r)的基因表达盒(END2 =DsRed(r) =PINII)；
[0102]3)0sCYP704B2基因，目标基因0sCYP704B2及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中0sCYP704B2基因的启动子序列如SEQ ID NO:7所示，其终止子序列如SEQ ID NO:8所示，0sCYP704B2基因的基因组DNA序列如SEQ ID NO:5所示，其核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0103]4)基因表达盒PG47 =ZM-BTl =ZM-AAl:IN2-1,目标基因ZM-AAl (其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)的开放读码框连接于启动子PG47 (其核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示)、转运肽ZM-BTl (其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)的下游，终止子IN2-1 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)的上游。
[0104]具体地，载体p7R的构建流程具体描述如下:
[0105]第一步，从玉米愈伤组织的c DNA中扩增花粉失活基因ZM-AAl和编码导肽的ZM-BTl，从玉米基因组DNA中扩增获得PG47启动子。其中，用于扩增ZM-AAl的扩增引物为:
[0106]F3:CGGTACCCGGGGATC |Λ0ΛΤ(:τ| CAAGGAAAAGACGTTATGCAG (SEQ ID NO:37)，方框内为Bgl II酶切位点，
[0107]R3:AAGGTCGTCCGGGCGGCCTGCGGCCTGGTCCAGGCAC(SEQ ID NO:38)，其中下划线标示的核苷酸序列为15bp的重叠序列；
[0108]用于扩增ZM-TP的扩增引物为:
[0109]F4:CGCCCGGACGACCTTGGGATCG (SEQ ID NO:39)；
[0110]R4:ATGGCGGCGACAATGGCAGTGAC (SEQ ID NO:40)；
[0111]用于扩增PG47启动子的引物为:
[0112]F5:CATTGTCGCCGCCATGGTGTCGTGATCGATGCTTTAT (SEQ ID NO:41),
[0113]R5:CGACTCTAGAGGATCTGCACCGGACACTGTCTGGTGGCSEQ ID NO:42)，其中下划线标示的核苷酸序列为15bp重叠序列)。
[0114]采用In-Fus1n的方法将扩增所得到的ZM-AA1基因，ZM-BT1导肽，PG47启动子三个片段连入BamHI酶切开的双元载体pCAMBIA1300上，得到中间载体A。
[0115]第二步，PCR扩增人工合成的红色荧光蛋白基因PINI1-DsRed (r)序列，其中人工合成的PINI1-DsRed(r)序列为如SEQ ID NO:43所示，其扩增引物为:
[0116]Fl:ATTAACGCCGAATTGGCCGCATTCGCAAAACACACC (SEQ ID NO:44)，
[0117]Rl:CAAGAACTAGTAACCATGGCCTCCTCCGAGAACGTGA(SEQ ID NO:45)，其中斜体下划线标示的核苷酸序列为15bp的重叠序列。
[0118]从玉米基因组DNA中扩增END2序列，其扩增引物为:
[0119]F2:CTCGGAGGAGGCCATGGTTACTAGTTCTTGGGGGACG(SEQ ID NO:46)，
[0120]R2:
[0121 ] CTTTTCCTTGAGATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCAGCTTCGCTTAGTTTTTAGT (SEQIDN0:47)，其中斜体下划线标示的核苷酸序列为15bp的重叠序列。
[0122] 采用In-Fus1n的方法将扩增得到的PIN I1-DsRed(r)片段与来自玉米且为愈伤组织和种子(胚和胚乳)特异性启动子END2片段同时连入Xmn I与Bgl II酶切的中间载体A，得到中间载体B。
[0123]第三步，人工合成IN2-1的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO:48所示。用EcoR I与BglII双酶切人工合成的IN2-1序列，其中，人工合成的IN2-1序列如下所示:
[0124]^gatcl, gacaaagcagcattagtccgttgatcggtggaagaccactcgtcagtgttgagttgaatgt
ttgatcaataaaatacggcaatgctgtaagggttgttttttatgccattgataatacactgtactgttcagttgttgaactctatttcttagccatgccaagtgcttttcttattttgaataacattacagcaaaaagttgaaagacaaaaaaaaaaacccccgaacagagtgctttgggtcccaagctactttagactgtgttcggcgttccccctaaatttctccccctatatctcactcacttgtcacatcagcgttctctttcccctatatctccacgtcgacgcggccaaatcctgaggatctggtcttcctaaggacccgggatatcggacgggggatccactagttctagagcggccgggtaccgagctcgaattaa-
tt [ggcgcgcc gtttaaac:tegcga| tcgatAagggcaattccagcacactggcggccgttactagcga |g;iaHc[ (SEQ ID N0:48)，其中下划线序列为IN2-1序列，其余序列为载体连接区序列，方框标示的序列依次分别为:Bgl II, Asc I, Nru I和EcoR I酶切位点，其中Bgl II酶切位点后五个碱基在IN2-1序列上，另外有Asc I，Nru I和EcoR I三个酶切位点在载体连接区序列上。酶切人工合成的IN2-1序列所在的质粒，连入同时用EcoR I与Bgl II双酶切的中间载体B，得到中间载体C。
[0125]第四步，将0sCYP704B2基因分为两段，分别是CYPl和CYP2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:60和SEQ ID N0:61所示。从水稻基因组DNA中，分别扩增CYPl和CYP2。
[0126]其中，CYPl的扩增引物为:
[0127]F6:CGA \fCGCGh\ TTGGTCGAACACGAGGTAGGCG (SEQ ID NO: 49)，方框内为 Nru I 酶切位点；
[0128]R6:TCGAAGGACCGCACCGTGACC jfCGA<j, ATG (SEQ ID NO: 50)，方框内为 Sal I 酶切位点，下划线标识的碱基是为了区分水稻内源的0sCYP704B2基因序列，并且提高表达效率而特意引入的三个SNP ；
[0129]CYP2的扩增引物为:
[0130]F7:CAT jGTCGAC) GGTCACGGTGCGGTCCTTCGA(SEQ ID NO: 51)，方框内为 Sal I 酶切位点，下划线标识的是为了区分水稻内源CYP序列，并且提高表达效率而特意引入的三个SNP ；
[0131 ] R7:ATT^GCGCGCCf GTTTAAACAGGTGGAAGACAAGGTGGTGAGG (SEQ ID NO: 52)，方框内为Asc I酶切位点
[0132]将所得到的两个扩增产物，连T-载体测序正确后，再分别用Nru I与Sal I，以及Sal I和Asc I双酶切，同时连入用Nru I和Asc I双酶切的中间载体C，即得到7R载体，也称为P7R。
[0133]实施例2:水稻转化
[0134]利用热激法将质粒p7R转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化(Hiei, et al.Efficient transformat1n of rice mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.(1994)Plant J6(2):271-282,通过参照将其并入本文)。具体的转化受体材料为水稻ms26完全雄性不育纯合突变体，该突变体是经过辐射诱导所得，突变是由3103bp缺失(包含0sCYP704B2大部分片段)导致(缺失区段物理位置:ensembl plants oryza japonica group vers1n64.6 (MSU6) chromosome3:3，701，319-3，704，421)。大片段缺失突变使回复突变的概率极低，因此不育性状稳定，从而保障了不育系的稳定性，降低杂交制种风险。利用农杆菌将质粒P7R转化水稻受体材料，利用载体中的DsRed (r)基因编码的红色荧光蛋白作为筛选标记，通过3_4轮的愈伤荧光筛选切割后，分化得到转基因植株，该构建体经过水稻转化得到阳性转基因材料1000株以上，进一步通过插入位点、拷贝数、载体骨架污染等分析后，结合田间观察到的花粉失活效果、结实率、种子分离比例等结果，从中优选出两个转基因事件7R-949D和7R-1425D。
[0135]实施例3:转化事件的花粉育性检测
[0136]对实施例2中所得到的两个转基因事件7R-949D和7R-142?进行观察分析发现，本发明所得到的转基因植株和非转基因对照植株之间没有观察到明显的形态上的不同。
[0137]以转化受体品系对应的野生型非转基因水稻品种武运粳7号(可育，下面简称为CKl)和转基因水稻对应的非转基因水稻品系武运粳7号ms26突变体(不育，下面简称为CK2)为对照，进行花粉可染率检测。
[0138]在水稻开花晚期，从大田的转基因水稻、CKl及CK2小区各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数(图2显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒)。分别计算转基因水稻、CKl及CK2花粉可染率各材料3次重复的平均数的标准差。在CKl正常可育和CK2正常不育的前提下，通过X2测验，分析转基因水稻的花粉可染率与理论值(50%)有无显著差异。
[0139]结果显示，7R-949D株系T2代植株上的花粉(T3代基因型)的可染率如下表1所示。本试验利用I2-KI染色法对随机抽取的17个植株的花粉分离比例(3次重复的平均数)进行了调查，从表1中可以看出，可育对照(CKl)的可育率在98.6%~100%之间；不育对照(CK2)可育率为O ;通过X 2-检验(自由度为1)，17个71?-9490单株中，除单株9的卡方值(7.454)微高于临界值(3.81)外，其它16朵花朵中可育花粉与不育花粉分离比例均在P ^ 0.05水平，符合1:1的比例。
[0140]7R-1425D株系T2代植株上的花粉(T3代基因型)的可染率如表2所示。随机抽取的17个植株，计算3次重复的平均数。从表2中可以看出，可育对照(CKl)的可育率在95.0.1%~99.8%之间；不育对照(CK2)可育率为O ;通过X2-检验(自由度为1)，17个7R-949D单株中，除单株3的卡方值(6.426)高于临界值(3.81)外，其它16朵花朵中可育花粉与不育花粉分离比例均在P < 0.05水平，符合1:1的比例。
[0141]该结果表明，转化事件7R-949D和7R-142?中的T-DNA外源基因在各世代均处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因(可育)，一半含有外源基因(不育)，且ZM-AAl表达框可以有效地分解花粉中的淀粉，从而使含有外源基因的花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。该设计使得上述两个转化事件中，含有ZM-AAl基因的转基因花粉全部失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因也不能通过花粉漂移到环境中。
[0142]表1:转化体7R-949D T2代植株上花粉I2-KI染色分析
[0143]

【权利要求】
1.一种水稻转化事件SPT-7R-949D，其特征在于，所述转化事件中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的5’端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO: 13或17所示，所述外源插入序列的3’端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO: 14或18所示。
2.权利要求1所述的水稻转化事件SPT-7R-949D，其特征在于，所述转化事件的基因组中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID N0:53所示。
3.用于鉴定生物样品中事件SPT-7R-949D的方法，其包括: a)设计特异性识别外源T-DNA插入序列SEQID NO:53或其互补序列的第一探针或第一引物；和 b)设计特异性识别SEQID NO:13或14的侧翼部分序列的第二探针或第二引物检测SPT-7R-949D的特异区； 其中第一和第二探针或引物所检测的单核苷酸片段少于100，OOObp0
4.权利要求3所述的方法，进一步包括利用至少两条引物进行聚合酶链式反应，从所述生物样品中扩增鉴定SPT-7R-949D事件的DNA片段，其中所述的第一引物特异性识别外源T-DNA插入序列SEQ ID NO:53或其互补序列，第二引物特异性识别SEQ ID NO:13或14的侧翼部分序列。
5.一种检测生物样品中事件SPT-7R-949D或其子代的方法，包括: (a)从所述生物样品提取DNA样品； (b)提供DNA引物对，其中所述的第一引物特异性识别外源T-DNA插入序列SEQIDNO:53或其互补序列，第二引物特异性识别SEQ ID NO:13或14的侧翼部分序列； (c)提供DNA扩增反应条件； (d)进行DNA扩增反应，获得DNA扩增子；和 (e)检测所述DNA扩增产物，其中所述的DNA扩增子在所述DNA扩增反应中的检出表明事件SPT-7R-949D的存在。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的DNA扩增子包括部分或全部的选自SEQIDNO: 13、14、17、18或53的序列，所述DNA扩增子的检出表明事件SPT-7R-949D的存在。
7.一种检测事件SPT-7R-949D中外源插入DNA分子的方法，所述方法包括:将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性检出SPT-7R-949D转化事件的DNA，表明SPT-7R-949D事件的存在，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO:53所示的部分序列。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的多核苷酸探针其核苷酸序列如SEQID NO: 55或56所示。
9.一种水稻转化事件SPT-7R-1425D，其特征在于，所述转化事件中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的5’端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO: 15或19所示，所述外源插入序列的3’端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO: 16或20所示。
10.权利要求9所述的水稻转化事件SPT-7R-1425D，其特征在于，所述转化事件的基因组中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示。
11.用于鉴定生物样品中事件SPT-7R-1425D的方法，其包括:a)设计特异性识别外源T-DNA插入序列SEQID NO:54或其互补序列的第一探针或第一引物；和 b)设计特异性识别SEQID NO:15或16的侧翼部分序列的第二探针或第二引物检测SPT-7R-949D的特异区； 其中第一和第二探针或引物所检测的单核苷酸片段少于100，OOObp0
12.权利要求11所述的方法，进一步包括利用至少两条引物进行聚合酶链式反应，从所述生物样品中扩增鉴定SPT-7R-142?事件的DNA片段，其中所述的第一引物特异性识别外源T-DNA插入序列SEQ ID NO:54或其互补序列，第二引物特异性识别SEQ ID NO:15或16的侧翼部分序列。
13.一种检测生物样品中事件SPT-7R-1425D或其子代的方法，包括: (a)从所述生物样品提取DNA样品； (b)提供DNA引物对，其中所述的第一引物特异性识别外源T-DNA插入序列SEQIDNO:54或其互补序列，第二引物特异性识别SEQ ID NO:15或16的侧翼部分序列； (c)提供DNA扩增反应条件； (d)进行DNA扩增反应，获得DNA扩增子；和 (e)检测所述DNA扩增产物，其中所述的DNA扩增子在所述DNA扩增反应中的检出表明事件SPT-7R-1425D的存 在。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的DNA扩增子包括部分或全部的选自SEQIDN0:15、16、19、20或54的序列，所述DNA扩增子的检出表明事件SPT-7R-1425D的存在。
15.一种检测事件SPT-7R-1425D中外源插入DNA分子的方法，所述方法包括:将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性检出SPT-7R-1425D转化事件的DNA，表明SPT-7R-142?事件的存在，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO:54所示的部分序列。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的多核苷酸探针其核苷酸序列如SEQIDNO:57、58 或 59 所示。
17.权利要求1或9所述的转化事件在育种中的应用。
18.包含事件SPT-7R-949D 和 SPT-7R-1425D 的植物。
19.由权利要求18所述的植物产生的种子。
20.一种水稻品种，其特征在于所述水稻品种在其第3号染色体短臂上的第.14，746，015-14, 746，027 的物理位置上，含有一个 0sCYP704B2 基因。
21.—种水稻品种，其特征在于所述水稻品种在其第I号染色体长臂的第.42，215，016-42, 215，095 的物理位置上，含有一个 0sCYP704B2 基因。
【文档编号】C12Q1/68GK104067944SQ201310347764
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年3月25日
【发明者】邓兴旺, 王海洋, 周君莉 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司, 铁岭先锋种子研究有限公司