一种半滑舌鳎雌性特异表达基因csw2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种半滑舌鳎雌性特异蛋白CSW2，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:2；编码上述的雌性特异蛋白CSW2的核苷酸序列为SEQ?ID?NO:1。本发明的CSW2基因的体外重组蛋白能够明显升高半滑舌鳎鱼苗雌性相关基因foxl2和P450芳香化酶的表达水平，具有刺激雌性相关基因表达的生物活性；同时具有降低雄性相关基因SOX9表达水平的生物活性。将CSW2重组表达产物作为饲料添加剂使用后将具有刺激雌性性腺发育的作用，具有提高雌鱼比例的效果。因此，本发明筛选的CSW2基因在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。
【专利说明】—种半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于水产生物技术中的功能基因筛选与应用【技术领域】，具体涉及一种半滑舌鳎雌性特异表达基因，即半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2的筛选、克隆、体外重组表达及其表达产物的活性分析。
【背景技术】
[0002]半滑舌鳎(Cynoglossus semiIaevis)是一种近海温水性大型底栖鱼类,其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖主导鱼类之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体生长缓慢、个体小等原因，致使增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。因而开展半滑舌鳎雌、雄特异基因的筛选鉴定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鳎性别决定机制、探索雌、雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。
[0003]许多鱼类在生长速率上存在性别差异。例如，罗非鱼雄性个体生长比雌性个体快30%以上；大马哈鱼雌性个体比雄性个体生长快30%以上。同样，许多海水鲆鲽鱼类的雌性个体生长也比雄性个体快许多。例如，半滑舌鳎、牙鲆和条斑星鲽等鲆鲽鱼类的雌性个体比雄性个体生长快30-100%以上。目前美国、日本、德国、法国、加拿大等国家纷纷投巨资以大马哈鱼、罗非鱼和青鏘等为材料开展鱼类性别特异基因筛选和性别决定机理的研究(Lee et al., 2004; Devlin and Nagahama, 2002; Matsuda et al., 2002; Nanda etal.，2002)，研究结果在Nature，PNAS等国际顶尖刊物上发表论文多篇。其中最为成功的是日本科学家以青鏘为材料筛选到青鏘雄性决定基因Y染色体特异的功能基因DMY，论文在Nature上发表(Matsuda et al.，2002)。不过，随后的研究表明，DMY只在青鏘和另一种亲缘关系很近的弓背青鏘中发现，而在其它亲缘关系远的鏘科鱼类以及其它鱼类中未见DMY 雄性决定基因(Matsuda et al.,2003 ； Volff et al., 2003; Kondo et al.，2003)。因而，迄今为止，只在青鏘和弓背青鏘等极少数鱼类克隆到雄性决定基因(DMY)，而在其它鱼类尚未见有关性别决定基因克隆的成功报道。另外，上述鱼类的性别绝大多数为XY决定类型，即雄鱼为XY型，雌鱼为XX型，而半滑舌鳎为ZW性别决定型，即雌性具有特异的W染色体，而雄性性染色体同型(ZZ)(周丽青等，2005)。而有关鱼类雌性特异或决定基因的筛选与克隆，特别是半滑舌鳎雌性特异基因的筛选与克隆目前国内外尚未见报道。因此，鱼类性别特异/决定基因，特别是半滑舌鳎雌性特异表达基因或决定基因的筛选与克隆以及性别决定分子机制的研究是目前国内外上急待攻克的重要科学问题，也是建立半滑舌鳎性别控制和全雌苗种培育技术的重要基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种半滑舌鳎雌性特异表达基因，并构建了该基因的体外重组表达载体，对该基因进行体外重组表达，获得重组表达产物，鉴定重组表达产物的生物活性及基因的功能，为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种研制提供基因资源和技术方法。[0005]本发明的半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2，其氨基酸序列为SEQ ID N0:2。上述的雌性特异基因CSW2，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ；
[0006]本发明的另一个方面涉及用于重组表达CSW2蛋白的重组质粒，所述的重组质粒中插入了序列为SEQ ID NO:1的DNA片段。
[0007]本发明再一个方面涉及CSW2蛋白在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例中的应用。
[0008]本发明的CSW2蛋白作为饲料添加剂，用于刺激半滑舌鳎雌性性腺发育。
[0009]本发明的CSW2基因的体外重组蛋白能够明显升高半滑舌鳎雌性相关基因foxl2和P450芳香化酶的表达水平，具有刺激雌性相关基因表达的生物活性；同时具有降低雄性相关基因S0X9表达水平的生物活性，因而具有刺激雌性性腺发育的活性。将CSW2重组表达产物作用于半滑舌鳎鱼苗后将具有刺激雌性性腺发育、具有提高雌鱼比例的效果。因此，本发明筛选的CSW2基因在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】:
[0010]图1:半滑舌鳎不同组织中CSW2基因的表达水平分析；
[0011]A:半定量PCR分析结果，上面的DNA条带为CSW2表达水平，下面的DNA条带为actin作为内参；B:适时定量PCR分析结果。
[0012]图2:半滑舌鳎不同发育时期精巢(斜线柱)和卵巢(黑色柱)中CSW2基因的表达水平分析；4d:4 天，7d:7 天，25d:25 天，48d:48 天，62d:62 天，5m:5 个月，In:1年，2n:2年。
[0013]图3:半滑舌鳎CSW2基因 的重组表达载体质粒图；
[0014]图4:含半滑舌鳎CSW2基因的重组大肠杆菌培养上清液中的总蛋白及纯化后重组蛋白电泳图；其中M:标准蛋白marker ； 1.空载体pet_32a经IPTG诱导后菌体蛋白电泳图，2.CSW2重组表达载体pet-32-CSW2经IPTG诱导后菌体蛋白电泳图，3.纯化后的CSW2重组蛋白电泳图；
[0015]图5:半滑舌鳎重组CSW2蛋白注射后鱼体性腺中foxl2基因在O小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时和96小时的表达分析；
[0016]图6:半滑舌鳎重组CSW2蛋白注射后鱼体性腺中P450基因在O小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时和96小时的表达分析；
[0017]图7:半滑舌鳎重组CSW2蛋白注射后鱼体性腺中sox9基因在O小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时和96小时的表达分析。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0019]一、半滑舌鳎雌性特异基因CSW2的克隆及其序列
[0020]对半滑舌鳎雌、雄鱼分别进行了全基因组测序，通过生物信息学分析，发现ZW雌性个体基因组中具有一个特异的基因CSW2，采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，从半滑舌鳎卵巢中克隆到了雌性特异基因CSW2的cDNA，其全长序列为SEQ ID N0:1，编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0021]半滑舌鳎雌性特异基因CSW2的cDNA序列全长为2043bp，包括669bp的开放阅读框(0RF区域)，编码222个氨基酸，5'非编码区长233bp，3,非编码区长1141bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。
[0022]具体步骤如下:
[0023]1.半滑舌鳎雌性特异基因的筛选与克隆
[0024]本发明专利中的雌性特异基因序列来源于半滑舌鳎基因组测序项目。对半滑舌鳎雌性个体和雄性个体采用SOLEXA测序技术分别进行全基因组测序和组装，采用生物信息学方法对获得的雌鱼基因组序列和雄鱼基因组序列进行比对分析，从中筛选出半滑舌鳎雌性特异候选基因；对这些雌性特异候选基因设计引物，利用这些特异引物对半滑舌鳎雌雄鱼基因组DNA分别进行PCR扩增，发现10个候选基因在雌鱼基因组DNA中存在，而在雄鱼基因组中扩增不出来。将这10个基因命名为雌鱼基因组特异基因。
[0025]2.半滑舌鳎雌性特异基因的序列
[0026]接下来，分析这10个基因组特异基因的编码框，设计扩增cDNA片段的引物，采用这些引物对雌鱼和雄鱼性腺cDNA进行扩增，将在雌鱼性腺中特异表达、而在雄鱼性腺中基本不表达的基因确定为雌性特异表达基因。通过这些方法我们发现了一个在ZW雌鱼性腺中特异表达的I个基因，命名为半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，采用CSW2基因的特异PCR引物(
[0027]CSW2-5 ' GSP:ACTGCTCCCGTTCTTGCTCCTGTTCC，CSW2-3 ' GSP:CGAGACAGGGATGAAGCCATAGCCA)，从半滑舌鳎卵巢中克隆到了雌性特异基因CSW2基因的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:1见序列表。
[0028]cDNA序列获得采取cDNA末端扩增(RACE)，方法按照SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit (Clontech),
[0029]RACE所用的体系以及反应条件:
[0030]50μ1反应体系
[0031]5M-1 IOX BD Advantage 2 PCR Buffer
[0032]1μ1 dNTP Mix (10 mM)
[0033]5μ1 UPM
[0034]1μ1 GSP
[0035]2μ1 3' -RACE-Ready cDNA
[0036]1μ150Χ BD Advantage 2 Polymerase Mix
[0037]35μ1 PCR-grade water
[0038]反应条件如下:
[0039]94°C 30S, 72°C 3min 5 个循环，94°C 30S, 70°C 30S, 72°C 3min 5 个循环，94°C 30S, 68 °C 30S, 72 °C 3min 25 个循环
[0040]5' RACE所用体系及反应条件:
[0041]50μ1反应体系[0042]5M-1 IOX BD Advantage 2 PCR Buffer
[0043]?μ? dNTP Mix (10 mM)
[0044]5μ1 UPM
[0045]?μ? GSP
[0046]2μ1 5' -RACE-Ready cDNA
[0047]?μ150Χ BD Advantage 2 Polymerase Mix
[0048]35M-1 PCR-grade water
[0049]反应条件如下:
[0050]94°C 30S, 72°C 3min 5 个循环，94°C 30S, 70°C 30S, 72°C 3min 5 个循环，94°C 30S, 68°C 30S, 72°C 3min 25 个循环。
`[0051]将3' RACE和5' RACE的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(Omega)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD_18T载体(Takara)连接，挑选阳性克隆提取质粒，3730DNA Analyzer (ABI)测序，测得的序列经CLUSTER分析拼接得到全长序列。而从SEQ ID NO:1的核苷酸两端设计引物进行全长扩增，结果表明没有发生拼接错误。
[0052]半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2的cDNA序列全长为2043bp，包括669bp的开放阅读框(0RF区域)，编码222个氨基酸，5'非编码区长233bp，3'非编码区长1141bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。
[0053]二、半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2在不同组织及不同发育时期表达模式
[0054]1.半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2在不同组织的表达模式:采用半定量和适时定量PCR技术分析了 CSW2基因在半滑舌鳎不同组织(心、肝、鳃、皮肤、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、精巢)的表达情况，发现CSW2只在雌性个体表达，其中在雌鱼卵巢中表达水平最高，在雌鱼垂体、脑表达量较少，其它组织几乎不表达，而在雄鱼精巢等组织中几乎检测不出来表达(图1A和B)。由此证明，CSW2是半滑舌鳎雌性特异表达、且在卵巢中高表达的基因。雌鱼和伪雄鱼遗传性别的鉴定按照已报道的方法进行(Chen S L et al.，2012，Marine Biotechnology, 14(I): 120-128.)。CSW2基因在不同组织的表达检测的具体步骤为:
[0055](I).半滑舌鳎不同组织总RNA的提取及反转录:取250-500克重的半滑舌鳎雌鱼的心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、精巢组织，用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用常规方法通过M-MLV反转录酶(Takara)反转录成cDNA。
[0056](2).实时荧光定量PCR反应条件
[0057]根据半滑舌鳎CSW2基因cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物CSW2-S，CSW2_A(CSW2-S: TAACCTCCCTCAGTTCTTCTCCTAA, CSW2-A: CCTCAGCCAAGGATGTGCC )，对半滑舌鳎雌鱼不同组织(心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢)以及雄鱼精巢中CSW2的表达进行分析。
[0058]实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件:
[0059]20μ1反应体系
[0060]10μ1 SYBR Taq
[0061]0.4Μ-1 primer F
[0062]0.4M-1 Primer R[0063]0.4M-1 Rox RD II
[0064]0.5Μ-1 cDNA(600ng/M-l)
[0065]8.3μ1 H2O
[0066]发现CSW2在卵巢中表达水平最高，在雌鱼其它组织以及雄鱼精巢等各组织中表达均很少(见图1Β)，因此，CSW2是半滑舌鳎雌鱼性腺高表达基因。
[0067]2.半滑舌鳎雌性特异基因CSW2在半滑舌鳎不同发育时期的表达:采用适时定量PCR方法检测了半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2在半滑舌鳎雌鱼和雄鱼不同发育时期(4d、7d、25d、48d、62d、5m、ly、2y) (d为天，m为月，y为年)性腺中的表达情况,发现在卵巢中62天前表达较少，几乎不表达，62天表达明显增强，62天至一年表达量呈现随时间增长而增加趋势，I年龄(Iy)表达量最高，2年龄(2y)表达量稍有降低。在精巢中，在各个发育时期CSW2的表达水平都非常低，甚至几乎检测不到表达，且不同阶段无显著性差异(图2)。由此证明，CSW2基因在半滑舌鳎雌鱼性腺分化和发育过程中起着重要作用，而在雄鱼性腺发育过程中没有起什么作用。
[0068]雌、雄鱼遗传性别的鉴定按照已报道的方法进行(Chen S L et al.，2012，Marine Biotechnology, 14 (I): 120-128.)。CSW2基因在半滑舌鳎不同发育时期表达检测的具体步骤为:
[0069](I)半滑舌鳎不同发育时期雌鱼性腺总RNA的提取及反转录:取半滑舌鳎4d、7d、25(1、48(1、62(1、5111、17、27等不同发育时期的雌雄鱼性腺，用1?應提取试剂盒提取1'0丨&1 RNA,M-MLV反转录酶(Takara)反转录成cDNA。
[0070](2)实时荧光定量PCR反应条件:
[0071]对不同发育时期(4d、7d、25d、48d、62d、5m、8m、10m、ly、2y)雌鱼性腺的cDNA 进行实时突光定量PCR分析,反应体系及反应条件如下:
[0072]20μ1反应体系
[0073]10μ1 SYBR Taq
[0074]0.4Μ-1 primer F
[0075]0.4M-1 Primer R
[0076]0.4μ1 Rox RD II
[0077]0.5Μ-1 cDNA(600ng/M-l)
[0078]8.3μ1 H2O。
[0079]结果表明CSW2基因随着鱼体生长和雌性性腺发育的进行，卵巢中CSW2的表达水平从4(1、7(1、25(1、48(1、62(1、5111、17和2y逐渐升高，在I年龄时达最高，在二年龄时表达量稍有降低(图2)。
[0080]3.半滑舌鳎鱼苗和成鱼的遗传性别鉴定:
[0081]从半滑舌鳎鱼苗或成鱼上采取0.1g大小的尾鳍组织，按照常规的酚氯仿方法提取基因组DNA，随后采用中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林实验室建立的半滑舌鳎性别连锁微卫星标记和建立的遗传性别鉴定方法(Chen S L et al.，2012，MarineBiotechnology, 14:120-128)进行半滑舌鳎鱼苗和成鱼的遗传性别鉴定。
[0082]三、半滑舌鳎雌性特异表达基因CSW2重组表达载体的构建及其在大肠杆菌的重组表达和表达产物的分离纯化[0083]采用常规PCR技术，扩增了 CSW2基因的开放阅读框ORF区域，并将其克隆到pET-32a(+)表达载体上，构建了 CSW2原核表达载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21中，进行了 CSW2基因的体外重组表达，获得了重组表达产物，重组表达产物经过GE公司His-tag亲和层析柱纯化后，获得了纯化的CSW2重组蛋白，重组蛋白分子量为47kd左右。实现上述目标的具体方案如下:[0084]1.CSW2重组表达载体的构建方法:
[0085]对PET_32a(+)载体序列和CSW2基因ORF区序列进行酶切位点分析，并设计带酶切位点特异引物 PET-32-CSW2S, PET-32-CSW2A (PET-32-CSW2S:GCCGATATCATGGAGCAGGAGGAACAGGA,
[0086]PET-32-CSW2A: GCCGAATTCTCACTCTGTGCATGTCATCCTG)
[0087]上游5'端含EcoRV酶切位点，下游3'端含EcoRI酶切位点。以卵巢cDNA为模板进行PCR反应，扩增CSW2编码区。将PCR产物纯化后与克隆载体pMD18-T连接，将阳性克隆进行测序。将测序正确的克隆质粒与PET-32a ( + )同时用EcoRI和EcoRV进行双酶切，琼脂糖电泳回收CSW2片段与表达载体质粒，按照连接酶说明书，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PET-32a-CSW2 (图3)，转化大肠杆菌TOPlO感受态，将检测阳性克隆进行测序，测序正确的克隆提取质粒。再将PET-32a-CSW2质粒转化表达感受态BL21(DE3)细菌，同时添加30%甘油到2-3毫升感受态细菌菌种中于_80°C冷冻保存作为保种菌。
[0088]2.重组蛋白的诱导表达与表达产物的初步分析
[0089]取5μ1保种的菌体接种到ImL新鲜的LB培养基中(含100 μ g/mL氨节青霉素)，37 °C，200r/min过夜培养，将过夜培养的菌体1%接种到IOmL新鲜的LB培养基中(含100 μ g/mL氨苄青霉素)，37 °C，250r/min培养至0D600达到0.6-0.8时，在对照组(PET-32a)和实验组(PET-32a-CSW2)菌液中加入IPTG诱导，使IPTG终浓度为1mmol/L，28°C，200r/min继续培养6h，在0、1、2、3、4、5和6h分别取样ImL,将采集的样本在4°C，12000r/min 条件下离心 5min，菌泥用 200 μ L 的 PBS 缓冲液(NaCl 137mmol/L, KCl
2.7mmol/L, Na2HP04 10mmol/L, KH2P04 2mmol/L)洗三次，每次漂洗后 12000r/min 离心211^11，加入3(^1^的？85混匀，在加入等体积的21上样缓冲液(111101/1 pH 6.8 Tris-HCl, 1%溴酚蓝，0.154gDTT, 10%SDS, 10%甘油)处理，沸水浴5min裂解菌体，收集裂解菌液样品进行12%SDS-PAGE电泳检测，发现在CSW2重组表达载体pet-32_CSW2经IPTG诱导后的菌体蛋白中有I条分子量为38.75KD的蛋白带(图4中的2)，而在空载体pet_32a对照组中则无此条蛋白带(图4中的3)。
[0090]3.重组蛋白的分离纯化
[0091]将上述保种菌在37°C条件下大量(250mL)培养至菌体密度达到0D600为0.6，加入IPTG终浓度为lmmol/L 28°C诱导6h后，4°C 12000r/min离心5min收集菌体，按照Ig湿菌体/IOmL 裂解缓冲液(20mM/L Na3P04，(λ 5M NaCl，20mM/L 咪唑，DNaseI 10U, 200 μ L50mM/L, 200ul lOmg/L溶菌酶)的比例重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎，4°C，12000r/min离心IOmin收集上清，将上清用0.45 μ L的过滤器过滤，将过滤的上清收集备用。应用HisTrap HP (GE公司)亲和层析柱进行分离纯化，具体操作如下:
[0092]首先，用5mL蒸馏水洗ImL柱子一次，随后5ml结合缓冲液(20mM/L Na3P04,0.5MNaCl,20mM/L咪唑)洗柱子，再将收集的预处理的上清过柱子，流速为l_2mL/min，用5mL结合缓冲液洗柱子，再用5mL的洗脱缓冲液(20mM/L Na3P04,0.5M NaCl,500mM/L咪唑)洗脱一次，最后用5mL的结合缓冲液再生柱子。收集经过亲和层析后纯化的重组蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳检测，观察到重组蛋白分子量为47KD左右(图4)。
[0093]4.蛋白浓度测定
[0094]采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的蛋白进行定量分析，具体操作按照说明书进行。
[0095]四、半滑舌鳎CSW2重组表达产物生物活性的测定及其应用潜力
[0096]将CSW2重组表达纯化产物注射到100-200克重的半滑舌鳎雄鱼精巢，检测了重组CSW2蛋白对性腺foxl2，p450和sox9等性别相关基因表达水平的影响，发现注射CSW2重组表达产物后6-48小时内，雌性相关基因foxl2的表达水平逐步升高，在24小时达到最高，随后逐渐下降，至96小时，恢复到正常水平(图5)。雌性相关基因p450也在6-48小时内表达水平升高，在48小时达到最高，至96小时，恢复至正常水平(图6)。与此相反，雄性相关基因sox9的表达水平从注射后6-24小时内表达下降，至24小时达最低，随后逐渐升高，至96小时，恢复正常水平(图7)。
[0097]具体检测方法如下:实现上述目标的具体方案为:
[0098]取100-200克重的一龄半滑舌鳎雄鱼40尾，其中4尾取性腺，作为O小时对照。取18尾鱼注射重组CSW2蛋白(150ul，lug/ul)，另18尾注射失活重组CSW2蛋白(沸水浴5min, 150ul, lug/ul)作为对照组。实验组与对照组分别在注射后6h，12h，24h，36h，48h，72h，96h取性腺迅速投入液氮中，随后转入_80°C保存备用，每个组每个时间点采样3尾。根据NCBI中报道的半滑舌鳎性别相关基因Foxl2 (GQ402462), P450 (EF134716.1)和Sox9a(GQ402461)等序列设计定量引物
[0099]Foxl2-S:TGGTTGGAAGTGCGTGGG,
[0100]Foxl2-A:GAGAGGAAGG`GCAACTACTGGA ；
[0101]P450-S: ACGGGCTGAAATCGCAAG,
[0102]P450-A: GGTGAGGATGTGACCCAGTGT;
[0103]Sox9-S:CGATTCCCCTGCGTCCA,
[0104]Sox9-A: GCTTCAGTTCGGCTTTATTGG.[0105]对注射重组蛋白后的性腺实时定量PCR检测各基因表达变化。将各基因不同时间表达量进行独立样本T检验，用SPSS 17统计软件进行显著性差异分析，将有显著性差异的组用*标出。
[0106]由此表明，本发明获得的CSW2基因的体外重组蛋白能够明显升高雌性相关基因foxl2和P450基因的表达水平，具有刺激雌性相关基因表达及雌性性腺发育的生物活性，同时CSW2基因的体外重组蛋白还可以降低雄性相关基因S0X9的表达水平，即具有抑制雄性性腺发育的生物活性。将CSW2重组表达产物作为饲料添加剂使用后将具有刺激雌性性腺发育的作用，具有提高雌鱼比例的效果，因此，在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。
【权利要求】
1.一种半滑舌鳎雌性特异性蛋白CSW2，其氨基酸序列为SEQ ID N0:2。
2.—种半滑舌鳎雌性特异性基因，所述的基因为权利要求1所述的雌性特异蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列为SEQID NO:1。
4.一种重组质粒，所述的重组质粒用于表达权利要求1所述的蛋白。
5.一种权利要求1所述的半滑舌鳎雌性特异基因CSW2的体外重组蛋白，所述的重组蛋白用于升高半滑舌鳎雌性相关基因foxl2和P450芳香化酶的表达水平，降低雄性相关基因S0X9的表达水平的活性,刺激雌性性腺的发育。
6.权利要求1所述蛋白在半滑舌鳎性别控制或提高雌性鱼苗比例中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103509099SQ201310347678
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】陈松林, 胡乔木, 杨长庚, 邵长伟, 王娜, 刘洋, 王凯琳, 刘珊珊 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所