水稻转录因子Os04g08740基因CDS序列的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os04g08740基因CDS序列的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os04g08740融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如增加水稻籽粒宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s04g08740基因CDS序列的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s04g08740基因⑶S序 列的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003] 在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖 器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚 珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过 程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。
[0004] 禾谷类作物的产量很大程度上取决于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性状的基因调 控是重要的研究领域。近年来，已经通过基因克隆、QTL等技术手段揭示了至少8个基因在 控制粒型方面具有重要作用。SGl基因编码一个功能未知的蛋白，主要在水稻根和发育的 穗中表达，该蛋白的过量表达出现短粒和矮化表型。SGl降低了对油菜素内酯BR的应答， 通过减少细胞增殖从而降低诸如种子、穗轴节间等器官的伸长。SGLl是一个类SGl蛋白， 具有与SGl类似的功能，通过RNAi下调SGl及其同源基因SGLl的表达，水稻粒长和穗轴的 节间较野生型变长（Nakagawa等，2012)。GS3位点是控制水稻粒重和粒长的主效QTL，同时 也是控制水稻粒宽和籽粒充实度的微效QTL(Fan,Xing等，2006 ;Mao,Sun等，2010)。PGLl 是一个非典型的不结合DNA的碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)，过量表达PGLl增加了籽 粒长度和重量。APG是PGLl的拮抗性互作因子，两者都定位在核内。PGL1/APG介导的籽粒 长度增加是由于内颖细胞长度增加引起的。APG和PGLl不影响已知籽粒长度调控基因GS3 和SRS3的表达。PGLl-APG代表了一个新的籽粒长度和重量调控途径，APG是一个负向调节 子，其功能受到PGLl的抑制（Heang等，2012)。Mi3(t)基因，来源于籼型水稻Y34,该基因 能使粒长缩短35. 7%?47. 4%，千粒重降低45. 9%?62. 4%，它主要控制籽粒长度，产生小粒 (刘明伟等，2005)。张启发等（YiboLi,ChuchuanFan,QIfaZhang,etal. (2011)Natural variationinGS5playsanimportantroleinregulatinggrainsizeandyieldin rice.NatureGennetics)研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶，是控制籽 粒大小的正调节因子，过表达GS5可使水稻籽粒明显变大；转录因子在调控籽粒大小方面 起着非常重要的作用，0sWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，0sWRKY78突变体可 以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)类转录因子能通过调控外稃和 内稃细胞的长度影响谷粒的大小。此外，控制水稻籽粒性状的基因还有gGL7和gGL7-2。但 Orphan家族的基因在影响籽粒大小方面的研究尚未见报道。总之，控制水稻籽粒发育是一 个复杂过程，涉及到多基因多条途径的协调控制，目前发现调控该性状的基因不多，调控籽 粒发育的分子机理尚未阐明，因此，寻找控制籽粒性状发育的基因和新的发掘手段对作物 改良并提高作物产量具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s04g08740基因⑶S序列的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种组成型水稻转录因子，即融合蛋白 (VP16)4-Linker-0s04g08740。
[0007] 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，将4个VP16功能域基序融合在一起 可构成一类增强子，增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16)4，即VP64是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 4所示。
[0008] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 9所示，编码该Linker的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的0s04g08740为水稻转录因子0s04g08740,其氨基酸序列 如SEQIDNo. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻转录因子0s04g08740基因的⑶S序列为：SEQIDNo. 1所示的核苷酸 序列。
[0010] 本发明还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因，以及在严格条件下，可与该 基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。
[0011] 本发明还提供含有编码所述组成型水稻转录因子的基因的载体、工程菌及细胞 系。
[0012] 所述载体的构建方法如下：
[0013] (1)在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s04g08740基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向 引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGGTC TCAATTGTTTTGAAGGACTC-3' 。
[0014] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR， 获得0s04g08740基因完整的CDS序列。
[0015] (3)将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列。
[0016] (4)以植物双元表达载体pCambial301_UbiN(图6)左右边界包含的序列为骨架 序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64-Gateway表达单兀、35S promoter-asRED表达 单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5所示。
[0017] (5)通过LR反应将0s04g08740基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有 VP64编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录 因子VP64-Linker-0s04g08740 基因的表达载体ubi:VP64-0s04g08740,其全序列如SEQID No. 6所示。
[0018] 上述表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿 孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,MethodforPlantMolecular BiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第 411-463 页；Geiserson和Corey，1998,Plant MolecularBiology,2ndEdition)。
[0019] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为：采用农杆菌介导的方法， 将上述表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化 后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0020] 本发明还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因在改良水稻籽粒性状(例如增 加水稻粒宽及千粒重）中的应用。
[0021] 本发明还提供了用于扩增水稻转录因子0s04g08740基因⑶S序列的引物对，包括 正向引物F: 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物R: 5'-CAAGAAAGCTG GGTCTCAATTGTTTTGAAGGACTC-3' 。
[0022] 本发明进一步提供水稻转录因子0s04g08740基因⑶S序列在调控水稻籽粒性状 中的应用。利用转录因子激活基序VP64(SEQIDNo. 10)与水稻转录因子0s04g08740融合 构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中， 从而改良转基因水稻籽粒的性状。
[0023] 前述的应用，是将水稻转录因子0s04g08740基因的⑶S序列构建到转录因子激活 基序VP64编码基因（SEQIDNo. 4)的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。优 选将水稻转录因子0s04g08740基因的CDS序列通过Gateway系统转录因子激活基序VP64 编码基因的下游。
[0024] 本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻 转录因子0s04g08740融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基 因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如水稻籽粒宽度增加。对于详细阐明 调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此 在生产实践中也具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1中nVP64-hyg_asRED载体图谱。
[0026] 图2为本发明实施例1中ubi:VP64-0s04g08740载体图谱。
[0027] 图3为本发明实施例3中PCR检测VP64-0s04g08740转基因阳性株系，其中WT为 野生型水稻 'kitaake'，V0218H-18、V0218H-20 为VP64-0s04g08740 转基因水稻株系。
[0028] 图4为本发明实施例4中转基因水稻籽粒性状的表型宽度的比较；其中WT为野生 型水稻 'kitaake'，V0218H-18、V0218H-20 为VP64-0s04g08740 转基因水稻株系。
[0029] 图5为本发明实施例4中转基因水稻籽粒性状的数据统计分析结果；其中WT为野 生型水稻 'kitaake'，V0218H-18、V0218H-20 为VP64-0s04g08740 转基因水稻株系。
[0030] 图6为本发明实施例1中pCambial301_UbiN载体图谱。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0032] 实施例1
[0033] 0s04g08740基因CDS序列的获得及植物表达载体的构建
[0034] I0s04g08740基因CDS序列的获得
[0035] 在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s04g08740基因，根据其序列设计PCR扩增引物，正向引物 F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTCAA TTGTTTTGAAGGACTC-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻总cDNA为模板，利用引物F和R进 行PCR，获得0s04g08740基因完整的CDS序列（如SEQIDNo. 1所示)。
[0036] 2植物表达载体的构建
[0037] 将水稻转录因子0s04g08740基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录 因子激活基序VP16编码基因（如SEQIDNo. 4所示）的下游。
[0038] 2. 1将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上
[0039] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮 PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptorattB接头的基因引物（F和R)，而第二轮的 模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptorattB引物（attB5'adaptor: 5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3'adaptor:5'-GTGGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGTC-3'）。将PCR产物克隆到pDONER克隆载体(购自Invitrogen)上，经测序鉴 定得到与目的基因完全相同的序列。
[0040] 2. 2植物表达载体的构建
[0041] 以植物双元表达载体pCambial301_UbiN(图6)左右边界包含的序列为骨架序列， 通过体外重组，将ubipromoter-VP64-Gateway表达单兀、35Spromoter-asRED表达单兀和 35Spromoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQID No. 5所示，载体图谱见图1。
[0042] 表达载体nVP64-hyg_asRED含有Gateway重组系统，pDONR带有目的基因的质粒 作为入门载体（Enteryvector),通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。
[0043] 通过LR反应将0s05g27980基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有VP64 编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因 子VP64-Linker-0s05g27980 基因的表达载体ubi:VP64-0s05g27980,其全序列如SEQID No. 6所示，载体图谱见图2。
[0044] LR反应体系如下：
[0045] 表达载体 1 μ? ( 30-50ng ) 入门载体（pDONR-gene ) 1 μ? ( 30-5Ong ) LR Clonase Enzyme Mix Ιμ? ddH20 2μ1 总体积5μ1
[0046]于25°C反应过夜。用反应体系转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆。
[0047] 实施例2转基因水稻植株的获得
[0048] 取水稻'kitaake'成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将ubi:VP64-0s04g08740转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的 乙酰丁香酮和OD值为0. 7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置 于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每IOd继代一 次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿 色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所 获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。获得20株转基因苗。
[0049] 本实施例中涉及的培养基配方如下：
[0050] 诱导培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0051] 共培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 2后加入植物凝胶 4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS(乙酰丁香酮）100?200μg/mL。
[0052] 筛选培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司）。
[0053] 分化培养基：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/L NAA+2.Omg/LKinetin(激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0054] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0055] 为检测实施例2获得的VP64-0s04g08740转基因水稻株系中ubi: VP64-0s04g08740基因在T2代转基因水稻（V0218H-18、V0218H-20)中的过表达情况，本实 施例在载体与目的基因接头处设计引物（正向引物：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC TTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）进行PCR检测，得到了明 显的特异性条带。由图3可见，扩增出的条带大小在2000bp以上，且引物是在载体与目的 基因接头处设计的，扩增出的片段大小与目的基因（2292bp)基本一致。因此可以说明，实 施例2获得的转基因水稻株系V0218H-18、V0218H-20中含有VP64-0s04g08740融合基因。
[0056] 实施例4转基因水稻表型分析和考种分析
[0057] 将实施例2获得的转基因水稻株系V0218H-18、V0218H-20和野生型水稻种子进行 比较，从表型上可以明显的看出，发现转基因材料的籽粒明显变宽（图4)。考种数据分析表 明（图5)，本发明获得的VP64-0s04g08740转基因水稻籽粒的宽显著大于野生型水稻籽粒。
[0058] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种组成型水稻转录因子，其特征在于，其为融合蛋白（VP16)4-Linker-0s04g08740 ； 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4个VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s04g08740为水稻转录因子 0s04g08740,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个 氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述组成型水稻转录因子的基因。
3. 含有权利要求2所述基因的载体。
4. 含有权利要求2所述基因的工程菌。
5. -种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求 3所述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
6. 权利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性状中的应用。
7. 用于扩增水稻转录因子0s04g08740基因⑶S序列的引物对，其特征在于，包括正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC TCAATTGTTTTGAAGGACTC-3,； 其中，水稻转录因子0s04g08740基因的⑶S序列为： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻转录因子0s04g08740基因CDS序列在调控水稻籽粒性状中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻 转录因子0s04g08740融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基 因转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ IDNo. 10所示。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s04g08740基因 的⑶S序列通过Gateway系统构建到转录因子激活基序VP64编码基因的下游，转化水稻， 从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64编码基因的核苷酸序列如SEQID No. 4所示。
【文档编号】C12N1/21GK104341528SQ201310347536
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】刘斌, 张传玉, 李宏宇, 赵涛, 刘军, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所