通过对生物合成调控基因的遗传操作构建力达霉素高产菌株的方法

专利名称：：通过对生物合成调控基因的遗传操作构建力达霉素高产菌株的方法
技术领域：
：本发明涉及球孢链霉菌C-1027(Str印tomycesglobisporusC-1027)中力达霉素的生物合成基因簇中的调控基因sgcRl，sgcR2，sgcR3(球孢链霉菌C-1027调控基因1，2，3)及由调控基因sgcRl，sgcR2和sgcR3所形成的调控网络。本发明还涉及通过提高基因拷贝数和利用组成型表达的强启动子对正调控基因进行过表达以提高力达霉素产量的方法。本发明还涉及通过这些方法获得的重组菌株。
背景技术：
：力达霉素(lidamycin，又名C-1027)是由我国湖北潜江土壤中发现的球孢链霉菌C-1027所产生[l]。力达霉素是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的物质，比临床上常用的阿霉素强10000倍以上[2]。经过十余年的新药研究和开发，目前力达霉素已经进入临床II期研究[3]，有望发展成为具有我国自主知识产权的新型高效的抗肿瘤药物。力达霉素属于烯二炔类抗生素，由小分子发色团和辅基蛋白组成，发色团具有环状烯二炔结构，是其对肿瘤细胞具有极强杀伤作用的活性中心。烯二炔类抗生素一般分为九元环(如新制癌菌素(neocarzinostatin，NCS)、madurop印tin(MDP)禾口力达毒素)禾口十元环(如calicheamicins、esperamicin禾口dynemicins)两类。條二块类抗生素的作用机制独特，与DNA结合后烯二炔核心重排，导致成环芳构化而形成一个暂时性苯环型的双自由基化合物，不稳定的中间产物促使DNA单链或双链断裂[4，5]。烯二炔类抗生素因其独特的分子结构、极强的抗肿瘤作用和新颖的作用机制在化学、生物学和医学领域均备受瞩目，除力达霉素在我国正在进行临床研究外，1997年新制癌菌素poly(styrene-co-maleicacid)偶联物(商品名SMANCS)在日本上市[6]，已在日本用于肿瘤临床治疗十余年，而2001年Calicheamicin-CD33抗体偶联物(商品名Mylotarg)成为第一个被FDA批准用于肿瘤治疗的单抗导向药物[7]。力达霉素由于其强烈的生物活性，可以发展为新型高效抗肿瘤药物，也可以作为"弹头"，使导向药物小型化、高效化，其研究和应用展示了广阔的前景。虽然力达霉素的抗肿瘤活性极强，但其发色团结构稳定性差、发酵产量低，不利于规模化生产和导向药物的研发。传统的育种方法虽在一定范围内有效，但定向、理性地构建力达霉素的高产菌株需要对其生物合成机制的深入解析。力达霉素生物合成基因簇已得到克隆(GenBank登录号AY048670)。力达霉素生物合成基因簇约75kb，共56个基因。推测其发色团的生物合成过程是首先合成四个结构单元(氨基吡啶糖、e-酪氨酸、氮氧杂萘甲酸和发色团烯二炔核心)，然后再组装在一起[8]。但到目前为止，力达霉素的生物合成机制仅得到初步的解析，研究主要集中在对其生物合成基因簇中生物合成酶的功能解析和生物合成步骤的推定[9，10，11，12，13，14，15，16]，仍有许多细节有待深入研究，尤其是对其生物合成调控机制的研究尚未见报道。链霉菌能产生大量的次级代谢产物，在医药和农业生产中具有重要的价值，约70%的已知抗生素是由链霉菌产生的。大多数抗生素生物合成的分子调控往往处于一个复杂的、多级水平的调控网络之中。通常抗生素生物合成的调控主要在三个水平进行途径特异性(pathway-specific)调控，多效性(pleiotropic)调控和全局性(global)调控[17]。大多数已知的链霉菌抗生素生物合成基因簇中包含有一个途径特异性调控基因，如放线紫红素的途径特异转录激活因子actlI-0RF4[18，19]，链霉素途径特异转录激活因子StrR[20，21]等，对所在的抗生素生物合成基因簇中的基因进行特异的、精细的转录调控。随着越来越多的抗生素生物合成基因簇的克隆和测序，发现一些较大的抗生素生物合成基因簇中存在多个途径特异性调控基因，如柔红霉素[22，23，24，25，26，27]、泰乐菌素[28，29，30，31，32，33]、雷帕霉素[34]等。力达霉素的生物合成基因簇被克隆后，Calicheamicin(AF497482)、新制癌菌素(AY117439)和MDP(AY271660)的生物合成基因簇也陆续获得解析，这3个烯二炔类抗生素的生物合成基因簇中均发现了3个以上的调控基因。众所周知，菌种改良一直是提高抗生素产量的关键。传统的育种方法盲目性大，工作量大，效率低。利用代谢工程方法育种，在代谢分析的基础上设计细胞，进而运用现代分子遗传学的工具来改造细胞，可以理性的，显著的提高产量。代谢工程育种的手段一方面可以改造结构基因，另一方面可以通过过量表达途径特异性的正调控因子或失活负调控因子提高抗生素的产量[35]。对调控基因进行代谢工程的改造中，较多采用过量表达正调控因子的方法，正调控基因往往通过促进多个重要结构基因的表达，最终影响抗生素的产量。过量表达正调控因子的方法是向野生菌株中导入另外的拷贝的调控基因，可以以整合型质粒为载体，将单个拷贝的调控基因整合到基因组上，实现过量表达，也可以通过独立存在的多拷贝质粒为载体，导入多个拷贝的调控基因，还可以通过在表达质粒中调控基因的上游加上促进表达的调控元件(如组成型表达的强启动子等)，使正调控基因最大程度的表达。本发明通过对力达霉素生物合成基因簇中可能的调控基因进行体内外的功能分析，阐明了力达霉素的生物合成调控基因sgcRl、sgcR2和sgcR3的功能，以及sgcRl、sgcR2和sgcR3之间的调控关系，在此基础上通过提高基因拷贝数和利用组成型表达的强启动子对这三个正调控基因进行过表达的方法，提高力达霉素的产量。
发明内容本发明对GenBank中力达霉素生物合成基因簇中被注释为生物合成调控基因的3个0RF进行了生物信息学分析。对这些ORF编码的蛋白进行同源性分析后发现，sgcRl编码的蛋白与已知的调控蛋白StrR(GenBank登录号CAA07385)在全长范围内的一致性为44%，相似性为59%(如图la);sgcR2编码的蛋白与一个AraC/XylS家族的调控蛋白(GenBank登录号ABP55137)在全长范围内一致性为50%，相似性为62%(如图lb);sgcR3编码的蛋白与已知的调控蛋白TylR(GenBank登录号AAF29380)在全长范围内的一致性为33%，相似性为47%(如图lc)。另外，对同为烯二炔类抗生素的C-1027、新制癌菌素，madurop印tin和calicheamicin的生物合成基因簇进行了0RF比对分析，发现在新制癌菌素的生物合成基因簇中存在sgcRl、sgcR2和sgcR3的同源基因，在madurop印tin的生物合成基因簇存在sgcRl和sgcR2的同源基因，calicheamicin的生物合成基因簇中存在sgcR2同源基因，说明这些调控基因在烯二炔类抗生素生物合成中具有重要作用。三个九元环类烯二炔基因簇中，sgcRl，sgcR2和sgcR3及它们的同源基因均围绕在烯二炔聚酮合酶基因(PKSE)及其相关基因附近，并且基因排列组成也非常相似(如图2)，表明这类抗生素生物合成的转录调控具有共性。本发明对基因簇中sgcRl、sgcR2和sgcR3的调控功能进行了研究。首先，通过同源双交换分别对基因簇中调控基因进行基因阻断，分析其对力达霉素生物合成的影响，发现sgcRlR2(sgcRl和sgcR2)、sgcR2和sgcR3阻断后均不产力达霉素，表明sgcRl、sgcR2和sgcR3是正调控基因(如图4)。结构基因sgcAl、sgcC4、sgcD6、sgcE8在野生株、sgcRlR2和sgcR3阻断菌株中进行基因转录水平的分析结果表明，阻断菌株中这些结构基因的表达均明显降低(如图9)，说明sgcRl、sgcR2和sgcR3基因确是正调控基因并通过对力达霉素生物合成途径中的四个结构单元的生物合成基因的转录调控来进行力达霉素生物合成的控制。将sgcRl、sgcR2和sgcR3三个基因分别导入野生菌株进行过量表达，力达霉素的产量获得了不同程度的提高(如图6)，进一步确证了sgcRl、sgcR2和sgcR3为正调控基因。本发明还将sgcRl、sgcR2或sgcR3基因分别转入不同调控基因的阻断菌株，交叉互补分析其对力达霉素生物合成的影响，结果表明sgcRl、sgcRlR2能互补sgcR3的阻断，sgcR3却不能互补sgcRlR2的阻断(如图7)。用实时定量RT-PCR分别对sgcRl、sgcR2和sgcR3在sgcRlR2和sgcR3阻断株中的转录水平进行分析，结果表明，sgcR3阻断株中sgcRl和sgcR2的表达水平均显著降低，而sgcRlR2阻断株中sgcR3的表达未受影响(如图8)。此结果验证了交叉互补实验，表明sgcR3在力达霉素生物合成调控网络中位于sgcRl和sgcR2上游。在大肠杆菌中异源表达并纯化SgcR3蛋白，用凝胶阻滞方法发现SgcR3能结合在sgcRlR2的启动子区，进一步说明SgcR3是通过调控sgcRlR2的转录来调控sgcRl和sgcR2的表达(如图10)。本发明在确证了sgcRl、sgcR2和sgcR3三个基因的正调控作用后，又对它们之间的调控关系进行了深入研究，确定了sgcR3在力达霉素生物合成调控网络中位于sgcRl和sgcR2上游。在此基础上，提出了对力达霉素产生菌生物合成调控基因进行遗传操作来提高菌株生产性能的方法。众所周知，菌种改良一直是提高发酵液中抗生素产量的关键。常规的菌种改良方法采用"随机突变+定向筛选"，是建立在将次级代谢物生成体系作为"黑箱"处理的基础上的，如果要选育代谢途径和参与合成的酶的基因不了解的代谢产物的菌种，采用这种方法是行之有效的。但这种方法的缺点是工作量大，效率低。代谢工程育种指在代谢分析的基础上设计细胞，进而运用现代分子遗传学的工具来改造细胞。如果已知生物合成途径的酶的结构基因和调节基因，就可以进行定向的菌种改良，去掉限速步骤，扩增整条途径或该途径的重要部分从而增加最终产量。代谢工程育种的手段一方面可以改造结构基因，增加结构基因的拷贝数(包括整条途径的扩增，途径片段的扩增或限速步骤酶基因的扩增)，提高产物跨膜输出的速率等。另一方面，从调节的观点来看，代谢工程可从多方面入手来提高次级代谢产物的生产能力，可以通过增加正调节基因的拷贝数来增加抗生素的生成量，也可以去除那些负调节子(阻遏子)，以使该途径实现组成型表达。此外，还可以使调节基因变为可诱导的，从而改变抗生素生成的过程曲线。本发明在深入研究力达霉素生物合成基因簇中三个正调控基因的功能及它们之间的调控关系的基础上，利用增加正调节基因的拷贝数和使用强启动子的方法来过量表达正调控基因，从而增加抗生素的产量。本发明所涉及的增加正调节基因的拷贝数的方法是5指向力达霉素野生株中导入另外的一个或多个拷贝的三个正调控基因的重组表达质粒。这一系列的重组表达质粒均包含sgcRl、sgcR2和sgcR3基因至少其中之一的核酸序列和基因自身的转录及翻译起始和终止信号，基因的上游至少含一种启动子序列。本发明所用的sgcRl、sgcR2和sgcR3基因编码序列为已知序列[8]，根据GenBank中的已知序列设计引物(见引物表)，以力达霉素野生菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增产物包含基因的编码序列及基因自身的转录及翻译起始和终止信号。构建重组表达质粒的载体可以是自主复制性载体，作为一种染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，可以以多拷贝的形式存在，例如，质粒PKC1139。另外，载体也可以是这样一种载体，当引入宿主细胞后，它整合到基因组中并与所整合的染色体一起复制，例如，质粒pSET152。对于自主复制而言，载体可进一步含有使载体能在宿主细胞中自主复制的复制起点，例如包括但不限于允许在链霉菌中复制的pIJ101、pJVl、pSG5、pSGLl的复制起点。本发明的载体优选地含有一种或多种使转化细胞能得到轻易筛选的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，其产物提供抗生素抗性、杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性等等。细菌选择性标记的实例包括但不限于赋予抗生素抗性如用于在大肠杆菌中筛选的氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记或用于链霉菌筛选的硫链丝菌素、阿普霉素抗性等。适当的表达载体的选择取决于待表达的目标基因及所选原核宿主细胞。适用于本发明的表达载体包括但不限于pKC1139，plj680，plj486/487，plj702，pFD666，pSGLl，pSET152，pIJ6902，pIJ8600或它们的衍生物，其它优选的表达载体参见Kiese等，链霉菌遗传学实践[37]。启动子序列即为了核酸序列的表达而由宿主细胞识别的一种核酸序列。启动子序列中含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。对于在力达霉素产生菌中引导本发明的重组表达质粒转录的可用的启动子包括但不限于从下列基因中获得的启动子aphD(氨基糖苷磷酸转移酶基因)，tsr(硫链丝菌素抗性基因)，ermE(红霉素抗性基因)，ssi，vsi(枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因)，STI-II(丝氨酸蛋白酶抑制剂基因)，P-gal(e半乳糖苷酶基因)，vph(紫霉素抗性基因)，tipA(浅青紫链霉菌中tipA基因)等以及突变后的ermE基因的启动子ermE女P。向力达霉素产生菌中引入重组表达载体的方法可以是原生质体转化[37]、电穿孔法[37]或接合法[37]。本发明中采用链霉菌中自主复制的高拷贝质粒pKC1139作为载体，组成型表达的ermE*p及基因自身的启动子作为启动子。在野生菌株中分别导入正调控基因sgcRl、sgcR2和sgcR3中某一个基因或多个基因，配合以基因自身的启动子和/或ermE*p，获得的菌株产量较野生株均有不同程度提高。其中以在ermE*p后表达sgcRl和sgcR2双基因，及在自身启动子后表达sgcR3获得了两株菌株产量最高，命名为球孢链霉菌ER1R2C和球孢链霉菌R3C，分别较野生株提高力达霉素的产量206X和35.7%(如图llb，llc)。图1:SgcRl、SgcR2和SgcR3同源性比对分析，其中，图la为SgcRl、MdpRl、NcsR6和StrR的共有序列比较；图lb为SgcR2、CalR7、MdpR2、NcsR5的共有序列比较；图lc为SgcR3、NcsR7、TyR的共有序列比较。图2:九元环类烯二炔抗生素C-1027、新制癌菌素和madurop印tin的生物合成基因簇ORF比对分析。图3:图3a为sgcR3的阻断菌株构建示意图，图3b、3c分别为以AB臂作探针的Southernblot杂交结果。图4:sgcRl、sgcR2和sgcR3的阻断菌株抑菌活性检测。图5:图5a为sgcRl、sgcR2和sgcR3的过表达质粒的构建示意图，图5b为添加了强启动子ermE*p的sgcRl、sgcR2和sgcR3的表达质粒构建示意图，图5c为各质粒的酶切验证分析图。泳道M:入DNAEcoRI+Hindlllmarker(2，1226bp，5，418bp，4，973bp，4，268bp，3，520bp，2，027bp，1，904bp，1，584bp，1，375bp，947bp，831bp，564bp);泳道1:pKCR3/EcoI+Xbal;泳道2:sgcR3和自身启动子区的PCR扩增片段；泳道3:pKCERlR2/BamHI+EcoRI;泳道4:pKCERl/BamHI+EcoRI;泳道5:pKCRlR2/BamHI+EcoRI;泳道6:pKCR1/BamHI+EcoRI;泳道7:pKCER2/BamHI+EcoRI。图6:sgcRl、sgcR2和sgcR3的过表达菌株的抑菌活性检测。图7:sgcRl、sgcR2和sgcR3的交叉互补菌株的抑菌活性检测。图8:sgcRl、sgcR2和sgcR3在野生株、R1R2K0和R3K0阻断菌株中的表达。图9:sgcAl、sgcC4、sgcD6和sgcE8在野生株、R1R2K0和R3K0阻断菌株中的表达。图10:凝胶阻滞法分析SgcR3蛋白与sgcRl和sgcR2启动子区的结合。泳道1，sgcRl和sgcR2启动子片段；泳道2-6，sgcRl和sgcR2启动子片段+SgcR3蛋白(123ng，153ng，307ng，615ng，1230ng);泳道7，sgcRl和sgcR2启动子片段+SgcR3蛋白(307ng)+200倍未标记的sgcRl和sgcR2启动子片段。图11:高产菌株产量的HPLC分析。具体实施例方式实施例lsgcRl、sgcR2和sgcR3基因编码序列及获得途径sgcRl、sgcR2和sgcR3基因的核苷酸编码序列已知(GenBank登录号AY048670)，本发明按链霉菌操作手册的方法[37]提取力达霉素野生菌的基因组DNA，并以此为模板设计引物扩增sgcRl、sgcR2和sgcR3核苷酸序列，引物见表2。PCR扩增条件为95°C5分钟；95°C50秒，55°C30秒，72°C1分钟，29个循环；72°C4分钟。扩增所得片段克隆到商用载体pGEM-T(美国Promage公司)中进行测序(上海生工公司)，结果表明所得到的片段核苷酸序列与报道中完全一致。sgcRl、sgcR2和sgcR3的基因编码序列分别表示在SEQIDNo.1，SEQIDNo.2和SEQIDNo.3中。实施例2.阻断菌株的构建及其力达霉素产量检测采用同源重组双交换的方法，将基因功能阻断。设计分别包含目的基因上游和下游的两个DNA片段(分别称为前臂和后臂)，PCR方法扩增出两臂(PCR条件一般为95°C5分钟；95°C50秒，55°C30秒，72°C1分钟，29个循环；72°C4分钟)。将硫链丝菌素抗性基因(thiostr印tonresistancegene，tsr)插入两臂之间，并克隆到用于接合转移的自杀性质粒p0J260或温敏型质pKC1139的多克隆位点，转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，接合转移至球孢链霉菌C-1027,两臂会与野生株基因组中同源序列进行重组，重组后硫链丝菌素抗性基因替换基因组中两臂同源区之间的基因，以抗生素抗性筛选获得发生双交换的接合子，即目的基因突变株，基因功能被阻断，阻断菌株经Southernblot验证后命名为球包链霉菌R2K0、R1R2K0和R3K0。以sgcR3阻断株球孢链霉菌R3K0为例说明三个阻断株的构建采用PCR的方法扩增用于双交换的两臂WAB和WCD，WAB和WCD的碱基范围为76，800bp78，205bp和78，713bp80，151bp，位于sgcR3基因的两侧(引物序列见引物表)。以野生菌株总DNA为模板，PfuDNA聚合酶，进行PCR反应，在WAB两段引EcoRI和BglII，WCD两端引入BglII和HindIII。前臂WAB和后臂WCD的PCR产物经过胶回收纯化后，使用T叫DNA聚合酶在产物尾部添加dATP，加A产物分别与pGEM-T相连，连接产物分别转化至E.coliTG1感受态细胞。获得的重组质粒进行酶切验证，正确后对重组质粒中插入片段测序，测序结果与GenBank中报道的序列完全一致。质粒pUC18经EcoRI和HindiII双酶切后回收大片段，与前臂WAB和后臂WCD片段连接，得到重组质粒pUC18WABCD。质粒pUCWABCD经BglII酶切后，与Bcll酶切plj680后回收tsr片段(l.Okb)连接，得到重组质粒pUCWABtsrWCD。质粒pOJ260为带有阿普霉素抗性基因的自杀性质粒，无链霉菌复制子，可通过接合转移的方式导入链霉菌中，只有质粒与基因组发生同源重组后才能在链霉菌宿主中存在。pOJ260经EcoRI和HindIII双酶切后回收大片段，与从质粒pUCWABtsrWCD中切下的前臂WAB、tsr和后臂WCD片段连接，得到重组质粒pOJR3K0(图3a)。质粒p0JR3K0先被转化至E.coliET12567/pUZ8002，再通过接合转移(接合转移的方法详见链霉菌操作手册[37])导入链霉菌中。利用抗生素抗性筛选接合子，能同时在含有硫链丝菌素和阿普霉素的平板中生长的克隆，可能发生了单交换；如果只能在含有硫链丝菌素的平板上生长，在含有阿普霉素的平板中不能生长，则可能发生了双交换。提取获得的抗性验证正确的接合子基因组DNA，分别用不同的内切酶酶切，并用不同的探针进行Southernblot验证。AB臂作为探针，用BamHI酶切，野生株应杂交得到4，176bp条带(图3b泳道1)，突变株应杂交得到4，668bp杂交条带(图3b泳道2)。sgcR3基因缺失部分作为探针，用EcoRV酶切，野生株应杂交得到5，339bp条带(图3c泳道1)，阻断突变株无杂交条带(图3c泳道3)，用Bcll酶切，野生株应杂交得到9，774bp条带(图3c泳道2)，阻断突变株无杂交条带(图3c泳道4)。Southernblot杂交结果与预期一致，阻断株命名为球孢链霉菌R3K0。sgcR2阻断株R2K0和sgcRl，sgcR2双基因阻断株R1R2K0的构建方法与R3K0基本一致。本发明中所用及所构建菌株及质粒见表l，所用PCR引物见表2。表1:菌株和质粒列表菌株和质粒描述*参考文献菌株￡.co"DH5a￡WET12567/pUZ8002￡.co謂21(DE3)"to油/7/jCMCC(B)6350151.g/oto/owC-102751.g/oto/)orwjR2KO&一6—離R1R2KO5*.g/otopo/^sR3KOS,g/oto/wwsERR2C51.g/o力/j/owR3C通用的大肠杆菌宿主[36]用于在大肠杆菌及链霉菌之间进行接合转移的[37]宿主用于蛋白表达的大肠杆菌宿主购自Novagen公司用于力达霉素抑菌活性检测[38]力达霉素产生菌[1]WcW2基因敲除后的突变菌株，Th'本工作构建堪c/W/2基因敲除后的突变菌株，Th'本工作构建^c/W基因敲除后的突变菌株，Th'本工作构建^cW/SI2基因过表达菌株，Am'本工作构建sgc/W基因过表达菌株，Amf本工作构建质粒pUC18pSET152pKC1139pOJ260pKCRlpKCERlpKCER2pKCRlR2pKCERlR2pKCR3通用的克隆载体，Ap「[36]可用于接合转移的链霉菌整合型载体，An/[39]含温敏复制子大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，Am'[39]可用于接合转移的自杀性载体，Am'[39]以pKC1139为基础，包含了1,402bpsgcW/基本工作构建因及启动子区，Am'以pKC1139为基础，包含了1,402bpgcft/基因本工作构建及启动子区，并将其置于wwi^p下游，Am'以pKC1139为基础，包含了1,652bpjgcR2基因本工作构建并将其置于^/￡*下游，Am'以pKCU39为基础，包含了2,461bpsgcWW2基本工作构建因及启动子区，Am'以pKC1139为基础，包含了2，911bp化cW/2基本工作构建因及启动子区，并将其置于enn五tp下游，Am「以pKC1139为基础，包含了2，539bp巧c/3基因'本工作构建及启动子区，Am'^縮写Ap',氨苄青霉素抗性;Am'，阿普霉素抗性；Th',硫链丝菌素抗性。表2:引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各菌株在斜面中培养7-8天后，用接种针挖下约2Xlcm大小的带菌斜面，接种至发酵培养基中，28。C振荡培养48小时。以210X的接种量接种至二级发酵培养基中，28。C振荡培养72168小时。取发酵液离心(3，000rpm，5min)，上清进行抑菌活性检测。将枯草杆菌(CMCC(B)63501)芽孢悬液，以0.4%的接种量接种至检测培养基中。在平板中加入15mL带菌的检测培养基，凝固后将牛津杯轻轻放置培养基上。将发酵液上清180ii1加入牛津杯中，各杯中的液面保持一致，37t:培养过夜，观察抑菌圈的产生情况。结果表明，球孢链霉菌R2K0、R1R2K0和R3K0发酵液无抑菌活性，不产生力达霉素(如图4)。实施例3.sgcRl、sgcR2和sgcR3的过表达研究设计引物，以力达霉素野生菌总DNA为模板，PCR方法扩增包括sgcRl、sgcR2和sgcR3基因核苷酸序列及基因自身的上游启动子区域并在片段两端引入酶切位点，引物见表2。扩增获得的片段首先克隆至pGEM-T载体中，经测序确定正确后，克隆至pKC1139的多克隆位点，获得用于过表达的质粒pKCRl、pKCRlR2、pKCR3，质粒构建图见图5a。同时，又将扩增到的sgcRl、sgcR2和sgcRlR2片段与强启动子ermE*p(450bp[37])片段共同克隆到pKC1139的多克隆位点，并置于强启动子ermE*p下游，得到质粒pKCERl、pKCER2和pKCERlR2。质粒构建图见图5b。将质粒pKCER2(如图6b)、pKCRl(如图6c)、pKCERl(如图6d)、pKCRlR2(如图6e)、pKCERlR2(如图6f)和pKCR3(如图6g)通过接合转移导入到力达霉素野生菌株中，通过酶切验证后(见图5c)，进行发酵实验和抑菌活性检测。结果表明，sgcRl、sgcR2和sgcR3的过表达菌株均较野生菌株(如图6a)不同程度地提高了力达霉素的产量。由此进一步确证了sgcRl、sgcR2和sgcR3为正调控基因。实施例4.sgcRl、sgcR2和sgcR3的调控关系的研究sgcRl、sgcR2禾口sgcR3的交叉互补将质粒pKCR3通过接合转移导入到球孢链霉菌R1R2K0中，将质粒pKCERl、pKCRlR2、pKCERlR2通过接合转移导入到球孢链霉菌R3K0中，通过PCR验证和酶切验证后，进行发酵实验和抑菌活性检测。结果表明，PKCR3导入R1R2K0中，不能恢复力达霉素的产生，而pKCERl、pKCRlR2和pKCERlR2的导入，恢复了R3K0中力达霉素的产生(如图7)。sgcRl、sgcRlR2能互补sgcR3的功能，表明sgcRl、sgcR2处于级联调控中sgcR3的下游位置。阻断菌株中的基因表达研究用实时定量RT-PCR分别对调节基因sgcRl、sgcR2和sgcR3在R1R2K0和R3K0菌株中的转录水平进行分析。结果表明，sgcRl、sgcR2在R3K0菌株中转录水平较野生菌株明显降低，而sgcR3在R1R2K0菌株中转录水平与野生菌株相当(如图8)，验证了交叉互补实验的结果，表明sgcR3的阻断影响了sgcRl和sgcR2的表达，sgcR3在力达霉素生物合成调控网络中位于sgcRl和sgcR2上游。分析结构基因sgcAl、sgcC4、sgcD6和sgcE8在野生株、RlR2K0、R3K0阻断菌株中基因转录水平，结果表明，阻断菌株中这些结构基因的表达均明显降低(如图9)，说明sgcRl、sgcR2和sgcR3基因是通过对力达霉素生物合成途径中的四个结构单元的生物合成基因的转录调控来控制力达霉素的生物合成。凝胶阻滞法分析SgcR3蛋白的靶序列以力达霉素野生株的基因组DNA为模板，扩增sgcR3的编码序列，克隆到质粒11pET-16b，酶切验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌株在LB培养基中37。C培养过夜，1%培养物接种到新鲜LB培养基中继续培养至0D6。。0.6，IPTG诱导6小时后收集菌体。表达产物SgcR3蛋白在N端融合十个组氨酸，在大肠杆菌中的表达后用GE公司的Histag纯化柱纯化，透析、除盐、冷干后于-S(TC保存。设计引物扩增sgcRlR2上游启动子区约450bp片段作为探针，用PIERCE公司的试剂盒进行凝胶阻滞实验。结果显示电泳后出现探针迁移条带(如图10)，表明SgcR3蛋白可在体外特异性结合于sgcRlR2的启动子区。由以上实验结果可知，sgcRl、sgcRlR2能互补sgcR3的功能，sgcR3在力达霉素生物合成调控网络中位于sgcRl和sgcR2上游，可控制sgcRl和sgcR2的表达，SgcR3蛋白通过结合sgcRlR2的启动子区来调控sgcRl和sgcR2的表达。实施例5.高产菌株的HPLC分析从上述构建的菌株中挑选出两株力达霉素产量显著提高的菌株进行HPLC分析。采用强启动子和高拷贝质粒，在野生菌株中导入正调控因子sgcRl和sgcR2，命名为球孢链霉菌ER1R2C。采用自身启动子和高拷贝质粒将sgcR3导入野生菌株，命名为球孢链霉菌R3C。将这两个菌株进行发酵，并分离提取力达霉素发色团，用HPLC法分析其产量。各菌株的发酵液离心(3，OOOrpm，5min)取上清，在4t:100%硫酸铵饱和度沉淀，用0.INHC1调至pH4.O，静置过夜。离心取沉淀，用0.1MpH8.0磷酸钾缓冲液溶解沉淀，乙酸乙酯抽提，真空挥干，溶于甲醇。HPLC分析用瑞典KromasilC-18反相柱(5ym，150X4.6mm，Bohus，SE)，流动相为20mM磷酸钾(pH6.86)/乙腈(50:50，v/v)，流速为1.Oml/min在UV吸收值350nm检测。结果表明，ER1R2C(如图lib)和R3C(如图llc)分别比原株提高力达霉素的产量206%禾口35.7%。参考文献1Hu几，XueYC，XieMY等人，一种新的大分子抗肿瘤抗生素C-1027.I发现、生产菌的分类、发酵禾口生物学活性(Anewmacromolecularantitumorantibiotic,C—1027.I.Discovery,taxonomyofproducingorganism，fermen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1):144—15425GalloMA，WardJ，andHutchinsonCR，在Str印tomycespeucetius中，道诺霉素基因簇外的基因座抑制dnrM的移码突变(ThednrMgeneinStr印tomycespeucetiuscontainsanaturallyoccurringframeshiftmutationthatissuppressedbyanotherlocusoutsideofthedaimorubicin-productiongenecluster)，微生物学(Microbiology)，1996，142(Pt2)269-275260ttenSL，01anoC，andHutchinsonCR，在Str印tomycespeucetius中dnrO基因编码DNA结合蛋白通过控制dnrN假反应蛋白的基因调控道诺霉素的产生(ThednrOgeneencodesaDNA_bindingproteinthatregulatesdaunorubicinproductioninStr印tomycespeucetiusbycontrollingexpressionofthednrNpseudoresponseregulatorgene)，微生物学(Microbiology)，2000，146(Pt6)1457—1468270ttenSL，FergusonJ，andHutchinsonCR，Str印tomycespeucetius中dnrR2基因座调控道诺霉素的产生(RegulationofdaunorubicinproductioninStr印tomycespeucetiusbythednrR21ocus)，细菌学杂志(JBacteriol)，1995，177(5):1216-122428BateN，StratigopoulosG，andCundliffeE，两种SARP编码调控基因在泰乐菌素生物合成中的不同作用(DifferentialrolesoftwoSARP-encodingregulatorygenesduringtylosinbiosynthesis)，分子微生物学(MolMicrobiol)，2002，43(2):449-45829BateN，BignellDR，andCundliffeE，泰乐菌素生物合成相关SARP-helper活性(Regulationoftylosinbiosynthesisinvolving'SARP-helper'activity)，分子微生物学(MolMicrobiol)，2006,62(1):148-15630BateN，ButlerAR，GandechaAR等人，Str印tomycesfradiae中泰乐菌素生物合成基因簇的多个调控基因(MultipleregulatorygenesinthetylosinbiosyntheticclusterofStr印tomycesfradiae)，化学生物学(ChemBiol)，1999，6(9):617-62431BignellDR，BateN，andCundliffeE，泰乐菌素产生的调控与TylP相互作用的配体的作用(Regulationoftylosinproduction:roleofaTylP_interactiveligand)，分子微生物学(MolMicrobiol)，2007，63(3):838-84732StratigopoulosGandCundliffeE，泰乐菌素生物合成基因簇表达分析tylQ产物的关键调控作用(Expressionanalysisofthetylosin-biosyntheticgenecluster:pivotalregulatoryroleofthetylQproduct)，化学生物学(ChemBiol)2002，9(1):71-7833StratigopoulosG，BateN，andCundliffeE，泰乐菌素生物合成的正调控15TylR的关键作用(Positivecontroloftylosinbiosynthesis:pivotalroleofTylR)，分子微生物学(MolMicrobiol)，2004,54(5):1326-133434KuscerE，CoatesN，ChallisI等人，Str印tomyceshygroscopicus中r即H和r即G对雷帕霉素生物合成的正调控作用(Rolesofr即Handr即Ginpositiveregulationofr即咖ycinbiosynthesisinStreptomyceshygroscopicus)，细菌学杂志(JBacteriol)2007，189(13):4756-476335张星元，潘军华，曾嵋涓等人，次级代谢产物菌种改良的策略和手段，无锡轻工大学学报，2002，21(4):428-43336SambrookJ，RussellDW，分子克隆一本实验操作手册，第三版(MolecularCloning:aLaboratoryMa皿al，3rdedn)，冷泉港，纽约冷泉港实验室(ColdSpringHarbor,NY:CoIdSpringHarborLaboratory)200137KieserT，BibbMJ，ButtnerMJ等人，链霉菌遗传操作手册(PracticalStr印tomycesGenetics)诺威治(Norwich)，TheJohnI皿esFoundation;200038ZhaoCY，WangYF，LR等人，微生物法测定力达霉素的效价，中国抗生素杂志2005年9月第30巻第9期535-53739BiermanM，LoganR，0'BrienK等人，用于大肠杆菌和链霉菌之间接合转移DNA的质粒克隆载体(PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStr印tomycesspp)，基因(Gene)1992，116:43-49序列表〈110〉生物技术研究所〈120〉通过对生物合成调控基因的遗传操作构建力达霉素高产菌株的方法〈130>IDC08068〈160>43〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>1080〈212>DNA〈213>sgcRl〈400〉1gtg^^gtgactctgcccaacgcgccgtggagcgatcacgccgtgtcgtacggatcgat60gaactcattcccgccgattccccgcgcctg■cgg^tcgatcgttcccatgtgcagcgc120ctcgcgaccgtgtacgcgtccctgccgccggtcctggtgcaccgcccgaccatgcgggtc180gtcgacggcatgcaccgcatcggcgcggccCgCCtg33ggggctggacacggtcgaggtc240accttcttcg郷gcgccgaggagc郷tgttcctgcgttccgtcgcggcgaacatcacc300aacggcctgccgttgtcggtggccgaccgc■gaccgccgcggcccgcattctggcctcc360C3CCCg3CCCtgtccgaccgcgcggtcgccgcacacgtcggcctcgacgcC33g3CCgtg420gcgggggtecggacgtgttcagccgcgggttctccgctgccaccggggcg480gacggccgcgtccacccgttggaccgcaccgccgaacgcctgcacgcggccgcgctgctg540acccaggacccgggactcccgttgcgctccgtcgtcgagc卿cggggctgtcgctgggc600acggcccacgacgtccgccgtcggctgctgcggggcgaggacccggtcccgcagaaccgg660cagagcgcgatgctggagccgggactcgccccgcagaagaaggcgacggccaagccgccc720gtcggcccggccgcccgtccggtcccgaaggtgccgcccgccgtcgccggcaggccgccg780gtgtcaccgcggtcccgggccccgctggaggcgctgcgcaagctctccaacgacccctcc840ctgcgccactccgaccaggggcgcgaactcatgcgctggctgcacaaccggttcgtcgtc■gacgaggcgtggcgccggcgcgcggacgcggtcccggcccactgcgtcgactcgatggcg960gagctggcgcagcactgctcggacgcctggcaccggttcgccgaggagatggttcggcgc1020cggcacagcgccgcggccgacggctccggactccgcacgactcagccaactcgccgttga1080〈210>2〈211>855〈212>DNA〈213>sgcR2〈400>23tg3CC3Cg3acaccatcgaggacgcggtccgccgggtcgtcgagtecatgcacgtcaac60ctgggtc卿acctcacgatcgatgacatggcgcgcacggcgatgttcagcaagttccat120ttcacccgcatcttccgcgaagtcaccggtacctctcccgggcgtttcctgtccgcctte180cggattcagg3ggCC朋g3gacttctcgtgcacactgcactcagtgtggccgatetcagc240agtcaggtcggctecagcagtgtcggtectttcagttctcgcttcaaggcctgtgtgggg300ctttccccgagcgcctetcgcgacttcggcggggtgC3gCcgggttttccctccgccgcg360gcccgtctcactcccaccgcgcacaatccctccgtgcgcggccgcattcactccgccccg420ggtg織ggcccggaaggatcttcgtgggcctgttccccggcaggatgcgccagggccgc■ccggcgcgctggaccgtcatggagagtcccggggccttcgagctccgggacgtgcccgtg540ggcacctggcacatcctggtccactccttccccgccggacaccggccgcaccagctcgac600tccgaaccgctgttgctcgggcacagcggaccgctcgtggtgcaccccggtgccctgctc660cggccggcggacatcctcctgcgcgcggtggacgccctcgatccaccggtcctgctggcc720cacttcgcgctgg卿gccgcctcacctcgccgtectcaccgtcatcggtagccctccgc780gcatccgcaggg卿gCEltgggttcggc朋ccgcccggtgtccggcgacggtecgcagat840cgagatcgcgggtgEl855〈210>3〈211>1188〈212>DNA〈213>sgcR3〈400>3atggcggcacacgacgtgaggcacgcgcacctgccggtctccgtecttgccgatcagatc60ttcgggcacctgccgagggccgatcagagggcgtgggcccaggcctecctg3CggggCtg120ctgaccaccgacggc朋g朋gtcgatcagacggatggccgccaccgtctcccgttcgccc180accgcgtcgc3gtCg3tgC3ccagttcctcaatgccagcccctgggactgggccccggca240cgtgccgagctg3tg卿tgggtc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