专利名称：一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明属于分子生物学的领域，具体涉及一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织(Oralsquamous cell carcinomas，OSCC)的检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是人类最常见肿瘤之一，也是发展中国家重要的健康问题之一[Weinberg MA，Estefan DJ.Assessing oral malignancies.AmFam Physician.2002，65(7)1379-1384；Mehrotra R，Gupta A，Singh M，et al.Application ofcytology and molecular biology in diagnosing premalignant or malignant oral lesions.Mol Cancer.2006，5(11)1-9]。口腔癌好发于中老年人，且发病率随年龄的增长而增长，但近年来也有年轻化的趋势[Neville B W，Day TA.Oral cancer and precancerous lesions.CA Cancer J Clin.2002，52(4)195-215]，90％的口腔癌为OSCC[Neville BW，Day TA.Oral cancer and precancerouslesions.CA Cancer J Clin.2002，52(4)195-215]。口腔粘膜癌前病变是一种已有形态学上改变的组织，它与外观相应正常的口腔粘膜相比较具有更大的癌变可能。口腔粘膜癌前病变现已知的有口腔白斑(oral leukoplakia)，口腔红斑(oral erythroplakia，OEP)，口腔扁平苔藓(oral lichenplanus，OLP)，口腔粘膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF)，上皮异常增生等。
在我国，OSCC的发病率有上升趋势，白斑、扁平苔藓等癌前病变的癌变率相当高。目前，OSCC的五年生存率为30％，这与30年前相比并没有明显增高[Weinberg MA，Estefan DJ.Assessing oral malignancies.Am Fam Physician.2002，65(7)1379-1384；Neville BW，Day TA.Oral cancer and precancerous lesions.CA Cancer J Clin.2002，52(4)195-215；Caulin C，Nguyen T，Longley MA，et al.Inducible activation of oncogenic K-ras results in tumor formation in the oralcavity.Cancer Res.2004，64(15)5054-5058]。60％的口腔癌被发现时已是晚期[Weinberg MA，Estefan DJ.Assessing oral malignancies.Am Fam Physician.2002，65(7)1379-1384.]。OSCC直到晚期才能被确诊和治疗是口腔癌的诊断率和存活率不能提高的主要原因。降低OSCC死亡率的关键是预防和早期诊断。如能在早期对OSCC进行诊断和治疗，其五年生存率可达80％[Mehrotra R，Gupta A，Singh M，et al.Application of cytology and molecular biology indiagnosing premalignant or malignant oral lesions.Mol Cancer.2006，5(11)1-9]。OSCC的早期检测及判别癌前病变是否已经转变为OSCC对提高病人生存率有重要意义。口腔内的异常增生和病变越早被准确判别为OSCC并得到及时的诊治，患者存活的几率就越大。
发明内容
本发明为了实现口腔磷状上皮细胞癌组织的早期检测及判别，提供了一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒及其使用方法。
本发明采用如下的技术方案实现 一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，其特征在于由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c和试剂III-d。
其中，试剂I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNase Free dH2O、dNTP Mixture、RNase Ihibitor、AMV Reverse Transcriptase XL组成； 试剂II由Tris-HCL+KCL、灭菌蒸馏水、TaKaRa EX Taq HS组成； 试剂III-a为基因GDF-15的PCR引物，试剂III-b为基因BCL-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNNB-1的PCR引物，试剂III-d为基因β-actin的PCR引物。
上述各试剂的配比如下表1～表4所述表1试剂盒的组成 注本表所列试剂的量为10个样本反应 表2试剂I的组份
表3试剂II的组份
表4试剂III的组份 所述的用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下 1)、样本的制备和贮存； 2)、同时进行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作； 3)、GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的琼脂糖凝胶电泳； 4)、使用Kodak Digital Science1D软件对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，将GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相对表达量带入方程“组织性质判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”计算组织性质判定值P； 5)、组织的判定值P与0比较判定该组织是否为口腔磷状上皮细胞癌组织，大于0为非口腔磷状上皮细胞癌组织，小于0为口腔磷状上皮细胞癌组织。
所述的GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作的退火温度为54℃。
本发明具有如下有益效果使用本试剂盒提供的试剂和使用方法可在同一反应中进行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin四个基因的RT-PCR反应，并可同时进行多个组织样本是否为口腔磷状上皮细胞癌组织的判定；判定时间短，准确性高；对于准确检测OSCC、及时阻断OSCC的发展、预防OSCC的转移等具有重要的现实意义。
图1使用本发明方法获得的12例组织RT-PCR电泳图。
图中泳道1、6、7、10、11、15、16、20均为DNA分子量标准，本实例中使用的是DL-2000；泳道2、3、4、5、14、19为口腔磷状上皮细胞癌组织，共6例不同病例的组织；泳道8、9、12、13、16、18为非口腔磷状上皮细胞癌组织，共6例不同病例的组织；bp为base pair的简写，即为碱基对，下方的数字显示为该电泳条带的bp值。
具体实施例方式 一、试剂盒包含的试剂及说明 本发明包括以下试剂共11种，分别为TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c和试剂III-d。其中，TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇为组织总RNA提取试剂，Oligo(dT)15和试剂I为mRNA反转录为cDNA试剂，试剂II为TaKaRa公司PCR操作试剂，试剂III-a为基因GDF-15的PCR引物，试剂III-b为基因BCL-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNNB-1的PCR引物，试剂III-d为基因β-actin的PCR引物。
具体如表1′所示，其中试剂I、试剂III和试剂IV的具体组份见表2′～表4′。表1′本发明试剂盒所包含的试剂 注本表所列试剂的量为10个样本反应 表2′试剂I的组份
表3′试剂II的组份
表4′试剂III的组份 注GDF-15，英文全称是Growth differentiation factor 15，在Genebank中的基因编号是NM_004864；BCL-2，英文全称是B-cell CLL/lymphoma 2，在Genebank中的基因编号是NM_000633；CTNNB-1，英文说明是Cadherin-associated protein beta 1，在Genebank中的基因编号是NM_001904；β-actin，英文全称是Homosapiens actin beta(ACTB)，在Genebank中的基因编号是NM_001101.2。
上述各基因引物可以通过本领域技术人员通过现有基因合成仪合成，其基本信息表述如下 (1)一般信息 (ii)发明名称一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒及其使用方法 (iii)序列数目8 (2)SEQ ID NO1的信息 (i)序列特征 (A)长度22bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO1 CGCTCCAGACCTATGATGACTT 22 (3)SEQ ID NO2的信息 (i)序列特征 (A)长度18bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO2 CCTTGAGCCCATTCCACA 18 (4)SEQ ID NO3的信息 (i)序列特征 (A)长度18bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO3 TGGGATCGTTGCCTTATG 18 (5)SEQ ID NO4的信息 (i)序列特征 (A)长度22bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO4 GCTATTTTATTGGATGTGCTTT 22 (6)SEQ ID NO5的信息 (i)序列特征 (A)长度19bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO5 CCAAGTGGGTGGTATAGAG 19 (7)SEQ ID NO6的信息 (i)序列特征 (A)长度16bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO6 GGGACAAAGGGCAAGA 16 (8)SEQ ID NO7的信息 (i)序列特征 (A)长度19bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO7 AGCGCAAGTACTCCGTGTG 19 (9)SEQ ID NO8的信息 (i)序列特征 (A)长度19bp (B)类型核酸 (C)链性单链 (D)拓扑结构线性 (ii)分子类型寡核苷酸 (xi)序列描述SEQ ID NO8 AAGCAATGCTATCACCTCC 19 二、操作步骤 本步骤包括样本的制备和贮存、RT-PCR反应、琼脂糖凝胶电泳的实验操作和口腔磷状上皮细胞癌组织的判定。
(一)样本的制备和贮存 对疑似白斑组织的确切部位、大小、包膜状况、与周围关系、色泽、形状、质地以及标本数目等登记后，经碘酒、酒精消毒局部后取组织，一般大小为1.5-2×1×0.3cm。对于面积较大的组织可在周边采用“三点法”分别取样，并分别标记。取样深度不超过0.3cm，质量约50-60mg。获取的标本若在短时间检验可贮存于-20℃，若在三日后检验可贮存于-80℃或液氮中备用。
(二)RT-PCR反应 本方法适用于一个组织标本的处理，多个组织标本可同时平行操作。
1、用1.5ml的EP管取一个组织标本，加入1ml的TRIZOL试剂，手动匀浆，于15-30℃孵育3-5min。
2、加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15sec后，15-30℃孵育2-3min。4℃下12,000×g离心15min。
3、将上层水相转移到新EP管中，加入异丙醇0.5ml，混匀后15-30℃孵育10min，于4℃下12,000×g离心10min。
4、移去上清液，加入75％乙醇1ml，适度振荡后，4℃下7,500×g离心5min。
5、小心去除上层溶液后，EP管于通风厨中干燥5-10min。
6、先加入无RNA酶的水20μl，用枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10min。混匀后1μl/支(≤500ng total RNA)分装6支(分别编号为A、B、C和D1、D2、D3)可直接进行以下操作，其余RNA溶液保存于-70℃备用。
7、依次于PCR反应管A、B、C和D1、D2、D3中各加入试剂I 8.5μl后，再加入Oligo(dT)15 0.5μl，将其置于PCR仪内，设置程序如表5所示。表5基因反转录反应条件
8、于第7步的PCR反应管A、B、C和D1、D2、D3中分别再加入试剂II 39μl，A中加入试剂III-a 1μl，B中加入试剂III-b 1μl，C中加入试剂III-c 1μl，D1、D2、D3中各加入试剂III-d 1μl，分别轻轻混匀，按表6所示条件同时进行PCR反应。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
表6标志性基因的PCR反应条件
(三)琼脂糖凝胶电泳 1、试剂配制和准备 常规配制2.0％的琼脂糖凝胶电泳缓冲液等，具体如下 (1)电泳缓冲液(TBE)的配制。先配制0.5mol/L(pH 8.0)的EDTA溶液将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌；再用NaOH调节溶液pH值至8.0(约需4g NaOH)；用蒸馏水定容至200ml；后送至高压灭菌；室温保存。
(2)再配制5×TBE溶液在0.6L蒸馏水中溶解54g Tris碱，加入27.5ml冰乙酸和20ml0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至1L，室温保存。
(3)2.0％琼脂糖溶液的配制。取5×TBE溶液2ml，稀释成20ml 0.5×TBE，溶解0.4g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml Glodview Na核酸染料2μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置30min左右后进行电泳备用。
(4)加样缓冲液(Loading Buffer)的配制常规配制6×Loading Buffer。
2、步骤 (1)取55ml 5×TBE，用dH2O稀释成550ml，取20ml溶解0.4g琼脂糖，沸后稍冷却，加入Glodview Na核酸染料2μl，另外530ml TBE倒入电泳槽中。
(2)琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中。
(3)DL2,000 Marker 2μl加入孔中。
(4)PCR反应产物液A 5μl+1μl Loading Bμffer，再加入PCR反应产物液D1 5μl混合，同时加入一个上样孔中。PCR反应产物液B和C分别与5μl D2、5μl D3混合后，再分别与1μlLoading Bμffer混合，并A、B、C同时进行电泳操作。
(5)接上电源，电压100V，电流20mA进行电泳45min。
(6)紫外灯检测，并用柯达凝胶成像分析系统初步判定A、B和C的bp大小。A的碱基对数量为128bp和501bp；B的碱基对数量为257bp和501bp；C的碱基对数量为247bp和501bp。
(7)用柯达凝胶成像分析系统进行基因的表达量分析。
三、结果分析 本结果分析包括琼脂糖凝胶电泳图的分析方法和口腔磷状上皮细胞癌组织的判定方法。
(一)琼脂糖凝胶电泳图的分析方法 下面，以某基因的RT-PCR结果为例说明对琼脂糖凝胶电泳图的定量分析过程。
1、打开Kodak Digital Science1D软件。
2、从菜单栏中“file”中的“open”打开待处理的文件。
3、将目标文件打开后，软件直接将待处理的图片显示在窗口的中间位置。
4、点整个页面最左侧的方框选择标志，将待处理的范围选中，可适当裁减多余部分，通过“Edit”菜单中的“Crop”来完成。
5、点图片左侧的“find lanes”可显示图片中的各列。若显示的竖线不位于泳带的中间位置可点击图片左侧的箭头图标，将竖线移动至各条带的中间位置。
6、点击“find bands”按钮，软件将会显示出目的基因条带的位置和宽度。可使用“Del键”删除不存在的泳带显示。
7、在菜单栏中，找到“Show”中的下拉菜单，选择“Image Display”。点击后出现对话框，点击对话框右下角的“Auto”键，软件将自动找到最适合的显示对比度。
8、找到菜单中的“show”下拉菜单，点击“Lands/Bands”的次级下拉菜单中的“Lane AnalysisData”。而后，出现表格窗口。
9、点击最新出现的对话框中菜单栏的“Display”，勾选“mean”和“area”。然后点击“确定”，即可出现每个泳带的灰度值和面积值。
10、目的基因相对表达量的计算。例如，GDF-15的电泳图中存在两个电泳条带，分别为小于200bp大于100bp的GDF-15条带(128bp)和基本与500bp平行的β-actin条带(501bp)，经柯达凝胶成像分析系统分析后GDF-15的mean＝101.29、area＝702.00，而β-actin的mean＝107.03、area＝390.00。利用“目的基因表达的灰度值＝mean×area”计算得GDF-15得灰度值为71105.58，β-actin的灰度值为41741.70。再利用“目的基因的相对表达量＝β-actin的灰度值×目的基因表达的灰度值/100”计算得GDF-15的相对表达量为170.35。同样，可计算获得BCL-2和CTNNB-1的相对表达量。此值即可用于进行口腔磷状上皮细胞癌组织的判定。
(二)口腔磷状上皮细胞癌组织的判定方法 将GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相对表达量带入“组织性质判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”即可计算出组织性质判定值P。例如，若GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相对表达量为分别170.35、77.28和74.13，则该组织的性质判定值P＝-16.099+0.044×170.35-0.082×77.28+0.234×74.13＝-16.099+7.4954-6.33696+17.147122＝2.406562。
判定如果判定值P小于0为口腔磷状上皮细胞癌，如果判定值P大于0为暂不能判定为口腔磷状上皮细胞癌。上例中，判定值P＝2.406562>0，所以暂不能判定该组织为口腔磷状上皮细胞癌组织。
方程“组织性质判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”以及判别界值0通过SPSS.11.5统计分析软件的二项判别分析方法获得。
四、方法评价 取12例口腔黏膜组织，经专家进行组织病理学鉴定，分别为正常口腔黏膜组织3例、口腔黏膜白斑组织3例、口腔磷状上皮细胞癌组织6例。采用本发明所示的方法进行操作后，再采用Cross-validated(a)法对本判别方法进行评价，口腔磷状上皮细胞癌组织共6个组织，有5例判断正确，有1例判断错误，总判别符合率为83.3％；非口腔磷状上皮细胞癌组织6个组织，均判断正确，交互判别符合率为(12-1)/12＝91.67％，灵敏度为6/(6+1)＝85.71％，特异度为5/(5+0))＝100％。结果如图1、表7所示。表7采用Cross-validated(a)法对本发明方法进行评价
权利要求
1.一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，其特征在于由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c和试剂III-d，
其中，试剂I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNase Free dH2O、dNTP Mixture、RNase Ihibitor、AMV Reverse Transcriptase XL组成；
试剂II由Tris-HCL+KCL、灭菌蒸馏水、TaKaRa EXTaq HS组成；
试剂III-a为基因GDF-15的PCR引物，试剂III-b为基因BCL-2的PCR引物，试剂III-c为基因CTNNB-1的PCR引物，试剂III-d为基因β-actin的PCR引物。
2.根据权利要求1所述的一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，其特征在于由表1所述配比的试剂组成。
表1
注本表所列试剂的量为10个样本反应
表2试剂I的组份
表3试剂II的组份
表4试剂III的组份
3.根据权利要求1或2所述的用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下
1)、样本的制备和贮存；
2)、同时进行GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作；
3)、GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的琼脂糖凝胶电泳；
4)、使用Kodak Digital Science1D软件对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，将GDF-15、BCL-2和CTNNB-1的相对表达量带入方程“组织性质判定值P＝-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1”计算组织性质判定值P；
5)、组织的判定值P与0比较判定该组织是否为口腔磷状上皮细胞癌组织，大于0为非口腔磷状上皮细胞癌组织，小于0为口腔磷状上皮细胞癌组织。
4.根据权利要求3所述的用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述的GDF-15、BCL-2、CTNNB-1和β-actin基因的RT-PCR操作的退火温度为54℃。
全文摘要
本发明属于分子生物学的领域，具体是一种用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒及其使用方法，实现了口腔磷状上皮细胞癌组织的早期检测及判别。用于口腔磷状上皮细胞癌组织的检测试剂盒，由以下试剂组成TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、试剂I、试剂II、试剂III-a、试剂III-b、试剂III-c和试剂III-d。其使用方法样本的制备和贮存；各基因的RT-PCR操作和琼脂糖凝胶电泳；对琼脂糖凝胶电泳结果进行定量分析，判定组织是否为口腔磷状上皮细胞癌组织。本发明具有如下有益效果可在同一反应中进行四个基因的RT-PCR反应，并可同时进行多个组织样本是否为OSCC的判定；判定时间短，准确性高；对于准确检测OSCC、及时阻断OSCC的发展、预防OSCC的转移等具有重要的现实意义。
文档编号C12Q1/68GK101368211SQ20081016720
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者郭剑津, 张天光, 史培荣, 陈显久, 刘玮玮, 冰 李, 军 解, 勃 牛, 程牛亮, 赵荣瑞, 郭巍伟 申请人:陈显久