专利名称：：一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于利用聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增领域的技术。技术背景利用聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增以及包括PCR扩增的分析众所周知。参见美国专利第4683202、第4683195号和第4965188号，以及通常参见PCRPROTOCOLS,aguidetoMethodsandApplications,Irmis等人编辑，AcademicPress(SanDiego,CA(USA)1990)。通常，聚合酶链式反应必须保证扩增反应的特异性，保真度，扩增片段的长度，通过优化退火温度，引物设计和镁离子浓度使用标准PCR反应体系足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。有研究报告显示调节离子浓度(Na+和K+)或反应组分的量能影响模板的二级结构(LeRudulier，D,etal，Science224;1064(1984);Buche，A，etal，J.Biomolec.Struct.Dyn.8(3);601(1990);Marquet，R,andHoussier，C,J，Biomolec.Struct.Dyn.9(1):159(1991);Buche，A，etal,J.Biomolec.Struct.Dyn.11(1):95(1993);Woodford,K.，etal.，Nucl，AcidsRes.23(3):539(1995);Flock,S.,etal.,Biophys.J.70:1456(1996);Flock，S.,etal.，Biophys..，71:1519(1996);EP0821059A2);还有研究报告显示，在体外，核酸构象和稳定性可以通过往缓冲液内添加一定量的化合物如多糖(Carninci,P.,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci,USA95:520-524(1998))，某些助溶剂如甘油和DMSO(Varadaraj，K.，andSkinner,D.M.，Gene140;1(1994))和其他含N化合物和氨基酸如脯氨酸和甜菜碱(Rees,W.A.,etal.，Biochemistry32:137-144(1993);WO95/20682;DE4411588CI;DE4411594CI;Mytelka,D.S.，etal.，NuclAcidsRes.24(14):2774(1996);Baskaran，N.,etal.，GenomeRes.6:633(1996);Weissensteiner，T.，andLanchbury，J.S.,BioTechniques21(6):1102(1996);Rajendrakumar,C.S.V.,etal，FEBSLetts.410:201-205(1997);Henke，W.，etal.,Nucl.AcidsRes.25(19):3957(1997);)。本发明在常规PCR反应液中添加了一定浓度的甜菜碱和脯氨酸组合，比添加单组分甜菜碱(0.5M)或脯氨酸(0.4M)(W09946400)的特异性，扩增效率高，并能获得保真度较高的DNA及对一些有特殊结构如GC含量高(60%<GC%<74.8%)，有二级结构模板等进行很好地扩增。
发明内容在常规PCR反应液中，通过优化退火温度，引物设计和镁离子浓度足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的或含有二级结构的，就很难扩增，因此在常规PCR反应液中添加了一定浓度的甜菜碱和脯氨酸，能获得保真度较高的DNA并能对一些有特殊结构如GC含量高(60%〈GC%<74.8%),有二级结构模板等进行很好地扩增。本发明解决该技术问题所采用的技术方案是1、设计四对引物APOE(F/R)，JUNB(F/R)，TGF61(F/R)和TGF70(F/R)均以人基因组为模板基因产物大小GC含量引物序列APOE448bp74.8%APOE-F5'TCGGAACTGGAGGAACAACTGACC3'APOE-R5'TCCGGCTGCCCATCTCCTCCATCC3'JUN-B1090bp68.1%JUN-B-F5'GCCGCCCGGATGTGCACTAAAATG3'JUN-B-R5'CCAAGCGAGGGGGTGTCCGTAAAG3'BetalTGF1527bp61.5%TGF-61F5'CCGCGCCCAGCCAAGGTATTT3'TGF-61R5'CGGGGGTGGGGGAGAGTCGTAGAA3'BetalTGF皿5bp70.4%TGF-70F5'CCCCCTATTGCTTGTCTCCCTCTA3'TGF-70R5'AGCCTGACTCTCCTTCCGTTCTG3'2、配制扩增高GC含量片段的专用混合液2XGC-RICHmastermix，该混合液含有40mMTris-HClpH8.0，40mMKC1，3mMMgCl2，1—20%甘油(V/V)，1_2%Tween—20(V/V)，lmMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶，0.1-1M甜菜碱和0.1-1M脯氨酸。在一个优选的实施例中，所述混合液含有10%甘油(V/V)，1.4%Tween_20(V/V),0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸。在另一个优选的实施例中，所述混合液含有20%甘油(V/V)，2XTween—20(V/V)，0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸。3、PCR反应循环的设置<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>72°C5min本发明还涉及上述混合液在扩增高GC含量片段中的应用。图1、琼脂糖凝胶电泳图显示单组分的甜菜碱和脯氨酸终浓度对AP0E和JUNB的扩增1、DNAMARKER;2、1.5M甜菜碱；3、1XCES;4、0,4M脯氨酸5、0.6M薩0;6、1XGCII;7、1XGCI;8、无添加剂9、无添加剂和模板图2、琼脂糖凝胶电泳图显示不同组合的甜菜碱和脯氨酸终浓度对AP0E和JUNB的扩增I、无甜菜碱和脯氨酸；2、0.5M甜菜碱；3、l.OM甜菜碱4、l.函甜菜碱；5、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸6、1.0M甜菜碱和0.3M脯氨酸;7、1.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸8、DNAMARKER;9、无甜菜碱和脯氨酸；10、0.5M甜菜碱；II、l.OM甜菜碱；12、1.5M甜菜碱；13、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸;14、1.OM甜菜碱和0.3M脯氮酸;15、1.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸;A、JUNB;B、APOE图3、琼脂糖凝胶电泳图显示甜菜碱和脯氨酸组合后终浓度对APOE的扩增1、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸；2、0.5M甜菜碱和0.3M脯氨酸3、0.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸；4、0.5M甜菜碱和0.1M脯氨酸5、0.5M甜菜碱和0M脯氨酸；6、DNAMARKER图4、琼脂糖凝胶电泳图显示0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸组合浓度对TGF61和TGF70的扩增1、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸；2、无甜菜碱和脯氨酸3、DNAMARKER;4、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸5、无甜菜碱和脯氨酸；A、TGF70;B、TGF61图5琼脂糖凝胶电泳图显示0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸组合浓度对APOE，JUNB，TGF61和TGF70的扩增1、TGF70;2、TGF61;3、J腦；4、APOE;5、DNAMARKER具体实施例方式实施例1:1、以人基因组DNA为模板(Template),在不同的助熔剂(甜菜碱、CES、脯氨酸、顧N0、GCII、GCI)下扩增APOE(448bp,GC74.8%)片段，反应体系为20Ml(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HC1pH8.0,40mMKC1，3mMMgCl2，1%甘油(V/V)，l%Tween—20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。反应组分甜菜碱(1.5M)IXCES脯氨酸(0.4M)MMNO(0.6M)IXGCIIIXGCI无添加剂无添加剂和模板2XGC-RICHmastermix10W10W10Ml1110Wio1014Pri匿1(10MM)0.4W0.4(40.4W0.4W0.4W0.4>40.4W0.4WPrimer2(10PM)0.4Ml0.4W0.4W0.4W0,4W0.4W0.4W0.4HiTemplate<1<1<1<1M<1化<1化<1化<1鹏O补水辛:20|xl补水至20|ul补水至20|xl补水至2(^1补水至20^1补水至20nl补水至20nl补水至20nl2、PCR反应循环的设置:94°C3min94°C30sec，50°C30sec>30cycles72°C30sec-72°C5min3、结果检测反应结束后取5反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图1)。实施例2:1、以人基因组DNA为模板，不同组合的甜菜碱(Betaine)和脯氨酸(Proline)终浓度对APOE和JUNB的扩增，反应体系为20pl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HC1pH8.0，40mMKC1，3mMMgCl2，5%甘油(V/V)，1.2%Tween_20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、结果检测反应结束后取5pi反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图2)。实施例3:1、以甜菜碱和脯氨酸组合后终浓度对AP0E的扩增AP0E(448bp,GC74.8%)片段，反应体系为20pi(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HClpH8,0，40raMKCl，3mMMgCl2，10%甘油(V/V)，1.4%Tween—20(V/V)'ImMdNTP'0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>>30cycles2、PCR反应循环的设置94°C3min94。C20sec50°C20sec72°C2min.72°C5min3、结果检测反应结束后取5pi反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图3)。实施例4:1、以人基因组DNA为模板，0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸组合浓度对TGF61和TGF70的扩增TGF61和TGF70片段，反应体系为20pi(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。配制的2XGC-RICHmastermix含有40mMTris-HClpH8,0，40mMKC1，3rnMMgCl2,15%甘油(V/V)，1.8%Tween_20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。反应组分0.5Mbetaine0Mbetaine0.4Mproline0Mproline2XGORICHmastermix10Wl(MTGF61VTGF70Pri匿FR(IO赠0,8W0.8WTemplate<1<1ddH20补水至20)il补水至20^12、PCR反应循环的设置94°C3min>30cycles3、结果检效果(见图4)。实施例5:94。C30sec50°C30sec72°C30sec72°C5minJ:反应结束后取5pi反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结1以人基因组DNA为模板，0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸组合浓度对APOE，JUNB，TGF61和TGF70片段，反应体系为20pl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。酉己制的2XGC—RICHmastermix含有40mMTris—HClpH8.0，40mMKCl，3mMMgCl2，20%甘油(V/V)，2%Tween—20(V/V)，ImMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。反应组分0.5Mbetaine0.5Mproline2XGC-RICHmastermix10WAPOE，JUNB,TGF61和TGF70PrimerFR(IO刚)0.8WTemplate<1Mdd恥补水至20nl2、PCR反应循环的设置94。C3min30cycles94°C30sec50°C30sec72°C30sec72°C5min反应结束后取5^反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见3、结果检效图5)。根据上述实施例的结果可以看出，本发明的扩增高GC含量片段的专用混合液能协助高GC含量的DNA模板解链，提高引物结合的特异性，从而有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。应用该缓冲液可以提高核酸扩增保真度，复杂模板的扩增。权利要求1、一种扩增高GC含量片段的专用混合液2×GC-RICHmastermix，其特征在于该混合液含有40mMTris-HClpH8.0，40mMKCl，3mMMgCl2，1—20％甘油，1—2％Tween—20，1mMdNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02UpfuDNA聚合酶，0.1-1M甜菜碱和0.1-1M脯氨酸。2、根据权利要求1的混合液，其特征在于所述混合液含有10%甘油，1.4XTween—20，0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸。3、根据权利要求1或2的混合液，其特征在于所述混合液含有20%甘油，2%Tween—20,0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸。4、一种权利要求1或2或3的混合液在扩增高GC含量片段中的应用。全文摘要本发明属于核酸扩增领域的技术。优化的扩增高GC含量片段的专用缓冲液，用于一般PCR方法无法实现的高GC含量和具有复杂二级结构DNA模板的扩增。优化的高GCPCR缓冲液系统能协助高GC含量和具有复杂二级结构DNA模板解链，提高引物结合的特异性，从而有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。应用该缓冲液可以提高核酸扩增保真度，复杂模板的扩增。文档编号C12P19/00GK101392282SQ20081016757公开日2009年3月25日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者萍俞,李晓晨申请人:天根生化科技(北京)有限公司