从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸-α-酮戊二酸盐的工艺的制作方法

专利名称：从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸-α-酮戊二酸盐的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种精氨酸-酮戊二酸盐的制备技术。
背景技术：
L-精氨酸-α-酮戊二酸盐，英文名称为 L-Arginine-alpha-Ketoglutarate，简称 AAKG，白色或淡黄色晶体，易溶于水、HCl和NaOH溶液，微溶于乙醇，不溶于丙酮、
乙醚等。L-精氨酸_ α -酮戊二酸盐是目前国际市场上销量日益增加的一种氨基酸盐类保 健品，作为功能性营养强化剂和护肝药物，主要用于体格增强补剂，促进肌肉的快速增 长和恢复，促进肝细胞对营养和能量的吸收，维护肝功能正常等作用。其主要生理机制 在于AAKG物能够在短期内促进一氧化氮的水平，促进和扩张肌肉运动，进而促进肌肉 的快速增长和恢复，增强力量和精力。
AAKG有1 1和2 1 (L-精氨酸α -酮戊二酸)两种配比的盐，即单精氨酸酮戊 二酸盐(MAAKG)和双精氨酸酮戊二酸盐(DAAKG)，两种AAKG理化性质接近， 但功能和应用领域上也有一定差异。MAAKG主要作用是增加血液的一氧化氮水平， 刺激血管舒张，促进训练后的肌肉生长，作为保健品运动强壮剂在美国市场上很受青睐 (http://www.mims.com/)。DAAKG是一种拥有多种生理作用的有机酸盐，对肝硬化 病人给予高剂量的DAAKG，其肝脏脱毒功能得到增强，血浆氨、血清酚浓度得到显著 降低，其氧化分解作用得到增强。这种作用在治疗氨中毒或用于强化肝脏解毒功能的动 物模型试验中也得到证明，治疗组的存活率相对于控制组较高，而且较少出现昏迷。法 国瑞法兰药厂的DAAKG护肝药物Euligen (商品名优力康)，已在药理分析、毒理学鉴 定、动物肝组织再生、动物体内解毒等的实验基础上，进行了一系列的临床研究，证明 了 DAAKG在肝脏疾病及其并发症，酒精中毒及其并发症等方面有显著疗效。早在1977年就有研究报道，给予肝硬化病人高剂量的精氨酸α-酮戊二酸，能增 强他们的肝脏解毒能力(Muting et al. Munch Med Wochenschr, 1977)。 目前，关于AAKG 的临床应用和代谢机制的研究不断深入。美国专利USP 2005/0085498 Al介绍，动物实 验表明，补充AAKG可以增长骨骼肌中精氨酸和谷氨酰胺的水平，同时起到刺激免疫系 统功能的作用。一项针对儿童补充AAKG (15g/d)的研究还显示，AAKG能够提升合 成生长素的水平、促进包括胰岛素样生长因子(IGFl)、谷氨酰胺及谷氨酸盐等氨基酸代 谢作用，补充5个月后在增长速率提高显著。同样，AAKG能够促进术后病人的生长素 和胰岛素的分泌，其中间代谢产物谷氨酰胺和脯氨酸也可以促进创伤复愈。在一项针对 AAKG抗分解代谢的研究中，具有高分解代谢和代谢增进的14名多发性创伤病人参与了 实验，受试组每天给予AAKG 20g，显示出在蛋白质转化、胰岛素、生长素以及谷氨酰 胺、脯氨酸、精氨酸等自由氨基酸的血液水平方面同样得到显著的最高。另外针对健康 男性的研究表明，每天给予IOg的AAKG剂量，其胰岛素水平升高20 30%，而单独补充精氨酸或α-酮戊二酸的研究组别中未观察到这种升高。体外细胞培养表明，AAKG 能够显著诱导人成纤维细胞的增长，这种细胞与肌纤维细胞相似，其作用有显著的量效 关系，而相应的精氨酸或α _酮戊二酸没有这种特性(USP 2005/0085498 Al)。此外，AAKG在水溶液中，可解离形成精氨酸和α-酮戊二酸，因而也可以作 为α-酮戊二酸或者精氨酸的供体，在某种情况下，作为精氨酸或α-酮戊二酸的替代品 进行应用。精氨酸是人体内不可缺乏的条件性必需氨基酸和合成蛋白质、肌酸的重要原 料，是生物体尿素循环的重要中间代谢产物，也是一氧化氮的前导物。而α-酮戊二酸 对蛋白质的代谢有着很强的调控作用，并是推动三羧酸循环的重要物质和产能载体。(美 国专利 USP 7645742; USP 6905707 ； USP 7,645,742)
在AAKG的生产上，主要有三种方式一是直接混合法，即按照摩尔比分称取L-精 氨酸、α-酮戊二酸，以1:1或者2:1进行混合。这种产品是精氨酸和酮戊二酸的简单混 合，二者之间没有盐键结合，产品质量受原料的品质、混合的均勻度影响较大，一般药 品或食品生产不采用该法；二是溶解_冻干法，分别配制一定浓度的L-精氨酸、α -酮 戊二酸溶液，按照一定的摩尔比进行混合，再将溶液进行冷冻干燥成为AAKG，该法中 两种物质形成稳定的有机酸盐，但冻干过程能耗大，一般只适合于AAKG注射剂生产； 中国专利 200710063477.4, 200710063478.9, 200710063479.3 均涉及了上述两种方法。三是 结晶法，是在溶液混合后，对溶液进行浓缩或加入有机溶剂，降低AAKG的溶解度，析 出AAKG结晶，经洗涤干燥后获得AAKG产品，该法制备的产品纯度高，产品质量能够 保证，但过程复杂，成本也偏高(CN 101591271A)。上述三种方法制备AAKG所需的L-精氨酸和α -酮戊二酸，都必须达到原料药 的指标要求，尤其是前两种方法，制备过程不能够去除原料带入的杂质，因而对产品的 质控提出较高的要求。而结晶方法的生产过程，成为制备AAKG的优选方法。CN101591271A描述了 L-精氨酸α -酮戊二酸盐结晶制备方法，采用市购L-精 氨酸和α-酮戊二酸原料配制溶液混合结晶制备，众所周知目前市场销售的L-精氨酸是 从毛发(一般为猪毛、人发)酸水解提取分离而得，α-酮戊二酸是石油基原料化学合 成产品。这两种原料来源都存在有生物安全的疑虑。L-精氨酸和α-酮戊二酸，又如 CN101011372A所描述的，由市售化学合成品、毛发提取物原料来源的α -酮戊二酸-精 氨酸盐制剂作为原料药，但药物原料不一定适宜于保健食品。

发明内容
本发明的目的在于为克服上述AAKG产品及其制备工艺的缺点，提供了一种从 发酵来源的L-精氨酸、α-酮戊二酸原料制备AAKG的方法，并且是直接用发酵液中的 L-精氨酸与发酵液中的α-酮戊二酸作为制备AAKG的原料，而不是用其提取精制的结 晶制品。本发明，所需原料L-精氨酸和α-酮戊二酸是以植物来源的淀粉葡萄糖为碳 源，用非转基因的野生型微生物进行代谢发酵而得到的发酵产物，简称发酵液，将发酵 液中的α-酮戊二酸与发酵液中的L-精氨酸按一定比例混合、螯合成盐，利用通用的 化工分离技术单元和设备，直接结晶制备L-精氨酸-α-酮戊二酸盐，制备的工艺包括 发酵液预处理、螯合、浓缩、结晶、溶解脱色、重结晶和晶体干燥等技术单元，L-精氨
5酸发酵液预处理，去除菌体和大分子杂质，加入同步进行净化处理的一定量的α-酮戊 二酸发酵滤液进行混合，即螯合，经真空蒸发浓缩，再采用降温结晶方式获得L-精氨酸 α-酮戊二酸盐的粗品，粗品经溶解脱色，并进行有机溶剂重结晶，最终经干燥获得高纯 度的L-精氨酸α -酮戊二酸盐。本发明，所述的发酵液预处理技术单元，是将L-精氨酸发酵液，或α-酮戊二 酸发酵液分别按照公知的方法进行絮凝、过滤或离心，除去菌体和较大固体粒子，获得 澄清滤液的过程。所述的絮凝操作是采用硫酸铝、CaCl2、聚丙烯酰胺、壳聚糖等絮凝剂 或其他无机铝盐、铁盐、钙盐、高分子絮凝剂。所述过滤操作，是采用板框过滤、真空 过滤或带式过滤等设备进行过滤，尤其适合规模化制备工艺；所述的离心操作是采用离 心分离设备进行固液分离，尤其适合小试制备过程。本发明，所述的螯合技术单元，是根据滤液中L-精氨酸的含量，加入一定量的 α-酮戊二酸发酵液，或α-酮戊二酸溶液进行反应的过程。α-酮戊二酸的加入摩尔含 量，是体系中L-精氨酸摩尔量的0.3 1.5倍。本发明，所述的浓缩技术单元，是对含有L-精氨酸、α-酮戊二酸的溶液进行 浓缩的过程，使AAKG达到过饱和状态。优选的浓缩设备是真空浓缩、二效浓缩或多效 浓缩装备，溶液浓缩到L-精氨酸原溶液体积的15% 50%。本发明，所述的结晶技术单元，是将浓缩液放置在温度_5°C 15°C下进行结 晶，或使用结晶锅，通过冷却液进行溶液冷却，结晶过程控制在4 50 h。结束后采用 过滤或离心收集晶体。本发明，所述的溶解脱色技术单元，是将上述晶体重新溶解在2 5倍重量份 的去离子水中，搅拌使其充分溶解后，加入颗粒活性碳进行脱色。活性碳加入量相当于 AAKG晶体质量的0.5% 3.0%，搅拌并将溶液加热至40 90°C，并维持20 60分钟， 再通过板框过滤，收集AAKG滤液。本发明，所述的重结晶技术单元，是在上述AAKG滤液中，缓慢加入溶液体积 的1 4倍的亲水性有机溶剂，室温或冰箱静置8 50 h进行重结晶，采用过滤收集晶 体，并以少量的冷的新鲜溶剂洗涤2 3次。所述的亲水性有机溶剂，包括乙醇、甲醇、 丙酮、异丙醇、甘油、乙腈等，其中优选的溶剂为乙醇或丙酮。本发明，所述的晶体干燥技术单元，是采用真空干燥、热风循环烘箱或气流干 燥等设备进行晶体干燥，其干燥温度50°C 150°C。本发明，所述发酵液预处理、螯合、浓缩、结晶、溶解脱色、重结晶、晶体干 燥等技术单元，可适当进行增加、减少、调整或组合。本发明制备AAKG的原料L-精氨酸、α-酮戊二酸，都是发酵来源产品， 以植物来源的淀粉葡萄糖为碳源，用非转基因微生物(自行筛选改良的野生菌，CN 03112896.3； CN 200310106298.6)进行代谢发酵，得到的发酵产物L-精氨酸或α -酮 戊二酸纯度高、质量稳定。更重要的是，非毛发来源氨基酸、非石油基原料化学合成来 源的α-酮戊二酸制备的AAKG，用于保健食品等，不存在有生物安全和食品安全的疑虑。 本发明直接用发酵液中的L-精氨酸与发酵液中α-酮戊二酸作为AAKG的原 料L-精氨酸、α-酮戊二酸，而不是用其结晶制品。这可以避免与发酵法精制精氨酸或α-酮戊二酸的后提取有较多的重复操作。从发酵液中提取L-精氨酸或α-酮戊二酸一 般都需要采用絮凝、过滤、树脂吸附、洗脱、浓缩、结晶、干燥等步骤进行制备。本发 明直接用发酵液按一定比例混合(螯合)、浓缩结晶制备，能够对L-精氨酸或α-酮戊 二酸的生产过程、AAKG的制备过程进行衔接和改进，能够有缩短生产环节、降低生产 成本、提高质控水平等良好效果。本发明提供的直接从发酵液制备AAKG结晶的方法，与现有技术相比，还具有 如下显著的优点(1)直接从L-精氨酸发酵液和α-酮戊二酸发酵液进行制备，将 AAKG的生产有机整合到发酵产物的后提取过程，因而整体流程缩短，生产成本显著降 低；(2)去除了发酵精氨酸和发酵α-酮戊二酸制备过程中的精制步骤，减少了能耗物 耗和废水生成量；(3)工艺具有较大的灵活性，通过参数的适当调整，可实现两种或 多种配比的AAKG生产；(4)产品质量易于控制，采用低温结晶、有机溶剂重结晶工 艺，并利用活性碳进行脱色，能够有效保证AAKG的纯度。


图1为实施例L-精氨酸α -酮戊二酸盐HPLC分析图谱。
具体实施例方式本发明提供了一种以植物来源的淀粉葡萄糖为碳源，用非转基因菌株进行微生 物代谢发酵(分别参考专利CN 03112896.3方法和专利CN 200310106298.6方法)，得到 含L-精氨酸或含α-酮戊二酸的代谢产物的发酵液，并从其发酵液中直接制备L-精氨 酸-α-酮戊二酸盐结晶的工艺，主要由发酵液预处理、螯合、浓缩、结晶、溶解脱色、 重结晶、晶体干燥等技术单元构成。现从技术优化、提高产品质量、降低技术成本角 度，对发明内容提出的技术参数进行说明。发酵液预处理单元目的是去除除去菌体和较大固体粒子，通过添加絮凝剂，能 够进一步降低发酵液中大分子物质的含量，CaCl2絮凝一般可以达到良好的絮凝效果。在 规模化制备工艺中，过滤操作可以选择板框过滤、真空过滤或带式过滤等设备，在小试 工艺中，可以采用离心机进行固液分离。酸化之前，应分别测定两种发酵滤液中L-精氨酸和α-酮戊二酸的含量，通常 情况下，发酵液中L-精氨酸含量在4% 6% (质量体积百分比，后同)，α-酮戊二酸 含量在3% 4%。应根据制备目标产物进行优化，制备MAAKG时，加入的α-酮戊二酸 摩尔量，应为L-精氨酸的摩尔量的0.8 1.5，优化的范围在0.95 1.05。制备DAAKG 时，加入的α-酮戊二酸摩尔量，应为L-精氨酸的摩尔量的0.2 0.8，优化的范围在 0.35 0.55。对含有L-精氨酸、α-酮戊二酸的混合溶液进行浓缩，使AAKG达到过饱和状 态，理想的浓缩设备应该选择真空浓缩方式，多效真空浓缩装置更适合较大规模的制备 过程，小试制备适宜采用薄膜浓缩或旋转蒸发仪。以混合之前的L-精氨酸和α-酮戊二 酸原溶液体积为标准，应浓缩到该体积的15% 50%，适宜的浓缩体积是20% 25%， 浓缩量较大，结晶回收率较高，但纯度较低；浓缩量较小，则晶体析出量较少，结晶操 作时间需要适度延长，但析出的晶体纯度一般较高。
此外，螯合操作还可以调整到浓缩操作后进行，但应避免在浓缩完成后，因加 入α-酮戊二酸溶液而使体系体积变多。结晶的适宜温度在_5°C 15°C，优选温度为5°C 10°C。在大生产中采用结晶 锅操作，通过冷却液进行体系降温时，应控制降温速率，优选的降温速率在2°C 5°C/ ho 结晶时间控制在4 50 h，优选的时间是20 30h。晶体重新溶解在2 5倍质量体积的去离子水中，优选为3倍体积水；加入颗 粒活性碳的量，应根据晶体纯度适度调整，优选的加入量为0.5% 1.5%，适宜的脱色温 度60°C 90°C，维持30 60min较为适宜，再通过板框过滤，收集滤液，在小批量生产 中，可以选择离心或真空抽滤获得AAKG滤液。重结晶采用有机溶剂体系进行，优选的溶剂为乙醇或丙酮，优选的加入体积为 2倍，重结晶时间8 30 h，晶体析出后，过滤获得晶体，并以少量的冷的新鲜溶剂洗 涤2 3次，一般为50%以上的乙醇或丙酮，洗涤溶剂应先行预冷至结晶温度(5°C IO0C)，以降低对AAKG的溶解度。重结晶操作也可以不使用有机溶剂，直接在水相中进行重结晶，也可以使 AAKG的纯度适当提高，可以根据产品的质量指标要求确定。采用水相进行重结晶，晶 体溶解使用2倍质量体积水，可适度加热提高溶解速度。一般采用真空干燥进行晶体干燥，温度60°C 90°C，优选为70°C 75°C，大规 模生产可以采用其气流干燥设备。本发明内容未对母液处理和溶剂回收进行规定，具体实施阶段可采用本领域通 用的或改进的措施，以提高产率，减少排放。为进一步阐述本发明的工艺思想，现通过具体实施案例予以说明。实施案例一单精氨酸酮戊二酸MAAKG的制备
在5 L精氨酸发酵液中加入CaCl2粉末25g，搅拌使之充分溶解，静置2h，再通过大 容量离心机(SOOOr/min，10 min)分批离心，收集滤液得4.6 L。经测定其中L-精氨 酸含量为45.0 g/L，计算出溶液中共含有L-精氨酸1.19 moL按类似的方法将α -酮戊 二酸发酵滤清液进行预处理，并计算mol量。按照mol比L-精氨酸α -酮戊二酸=1 1计算，搅拌情况下，缓慢添加α -酮 戊二酸发酵滤清液到L-精氨酸发酵滤清液中，使之完全混合。采用旋转蒸发仪进行混合 液浓缩，水浴温度65°C，获得浓缩液1200 mL，为混合前L-精氨酸和α -酮戊二酸发酵 滤清液的26.1%。放入5°C冰柜，静置20h，溶液中有大量晶体析出。通过真空抽滤，收集粗品结晶物272.3 g (干重)，计算回收率为71.5%，通过 HPLC测定，粗品纯度为92.0% (不含结晶水，下同)，L-精氨酸α-酮戊二酸摩尔 比为 1 1.11。取粗品270 g溶解在500mL去离子水中(粗品质量体积的2.5倍水)，按照粗品 质量的0.5%加入粉末活性炭(100目)，搅拌脱色，并升温至701保持401^11。然后真 空抽滤，去除活性炭。待滤液冷却至室温后，缓慢加入3倍体积的乙醇，室内放置50 h进行重结晶。 真空抽滤收集晶体，并以85% (体积百分比)乙醇10 15 mL淋洗结晶3次，继续抽干 20 min 30 min。转移结晶物至表面皿，置入真空干燥箱，70°C干燥48h。
干燥后重结晶产品质量239.6g，HPLC测定的产品纯度为99.2%，其中L-精氨 酸α -酮戊二酸摩尔比为1:1.06。重结晶收率达到88.0%，AAKG总收率为62.9%。实施案例二双精氨酸酮戊二酸DAAKG的制备
在5 L精氨酸发酵液中加入1.0%壳聚糖盐酸(1.0%)溶液25mL，搅拌并静置1.0 h，真空抽滤，收集滤液得4.2 L。经测定其中L-精氨酸含量为52.0 g/L，计算出溶液中 共含有L-精氨酸1.25 moL α -酮戊二酸发酵按同样方法获取发酵滤液。取含91.6 g α-酮戊二酸的发酵滤液(按照L_精氨酸α -酮戊二酸=1 0.5摩 尔比添加)，搅拌情况下，缓慢加入到L-精氨酸发酵液中，使之完全混合。采用旋转蒸 发仪进行混合液浓缩，水浴温度65°C，获得浓缩液1680 mL，相对于混合前L-精氨酸和 α-酮戊二酸发酵滤清液的40%。放入0°C冰箱，静置48h，溶液中有晶体析出。真空抽滤收集粗品结晶物，折合干重为190.3 g (干重)，计算回收率为61.4%， 通过HPLC测定，粗品纯度为88.6%, L-精氨酸α -酮戊二酸摩尔比为1.92 1。取粗品185 g溶解在370 mL去离子水中(粗品质量体积的2.0倍水)，按照粗品 质量的0.5%加入粉末活性炭(100目)，搅拌脱色，并升温至70°C保持40min。然后真 空抽滤，去除活性炭，滤液350 mL。待滤液冷却至室温后，缓慢加入1400 mL丙酮(滤液体积的4倍)，0°C冰箱下 放置8h，待结晶析出后，真空抽滤收集晶体，并以0°C冷丙酮10 15 mL淋洗结晶3 次，继续抽干20min 30min。转移结晶物至表面皿，置入真空干燥箱，70°C干燥24h 为DAAKG产品。重结晶产品质量165.1g，HPLC测定的产品纯度为98.7%，其中L-精氨酸 α -酮戊二酸摩尔比为1.99 1。重结晶收率达到86.7%，AAKG总收率为53.3%。实施案例三中试规模下的AAKG制备技术
L-精氨酸发酵液5 Μ3，精氨酸含量为48 g/L。加入CaCl2粉末25 kg，搅拌使之充 分溶解，静置2h，采用板框过滤设备(过滤面积约25.0 m2)进行过滤，并对滤渣进行洗 涤。收集澄清滤液4350 L。用于与精氨酸成盐反应的α-酮戊二酸也采用发酵液，其预处理过程与L-精氨 酸相似，澄清滤液中α-酮戊二酸含量为39.2 g/L。以生产MAAKG为例，按照L-精氨酸α -酮戊二酸=1 1摩尔比添加，将 α-酮戊二酸发酵滤清液加入到L-精氨酸滤清液中，搅拌均勻，混合发酵液共8.82 Μ3。采用二效真空浓缩设备，浓缩至1500 L，浓缩液量为原L-精氨酸滤液和α-酮 戊二酸滤液混合液体积的34.5%。使用结晶锅对上述浓缩液进行结晶，通入冷却水，当滤液温度冷至30°C时，控 制冷却速率，以每小时2°C速率缓慢降温至5°C，结晶锅搅拌速率10 15r/min，养晶时 间10h。采用板框过滤，分离粗晶体。粗晶体折合干重342.7Kg，粗品纯度为88.6%， 其回收率为79.1%。粗品复溶于600 L去离子水中，加入粉末活性炭(100目)1500 g，搅拌并升温 至70°C脱色60min，板框过滤去除活性炭，滤液装入结晶罐，通冷凝水冷却至室温，缓 慢加入1800 L 96% (ν/ν)乙醇。通冷却水降温至15°C，静置12 h待结晶析出。真空 抽滤，并以96% (ν/ν)乙醇洗涤结晶，真空下抽干，结晶物于50°C干燥。获得重结晶AAKG 222.4 kg。上述工艺为MAAKG的制备工艺，产品总收率约为57.3%，产品纯度>99.0%。 若母液经处理回用，实际收率在70%以上。实施案例四α-酮戊二酸加入量对结晶产品纯度和产率的影响
为研究α-酮戊二酸加入量对结晶产品纯度和产率的影响，分别取IOOmL L-精氨 酸滤液，加入不同量的α-酮戊二酸，按“实施案例一”中浓缩和结晶方法操作，通过 HPLC测定，各批次MAAKG纯度及产率如下。表1 α -酮戊二酸加入比例对结晶产率和纯度的影响
权利要求
1.一种从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_ α “酮戊二酸盐的工艺，其特征在于 所需原料L-精氨酸和α-酮戊二酸是以植物来源的淀粉葡萄糖为碳源，用非转基因的 野生型微生物进行代谢发酵而得到的发酵产物，简称发酵液，制备的工艺包括发酵液预 处理、螯合、浓缩、结晶、溶解脱色、重结晶和晶体干燥，L-精氨酸发酵液预处理，去 除菌体和大分子杂质，加入同步进行净化处理的一定量的α-酮戊二酸发酵滤液进行混 合，即螯合，经真空蒸发浓缩，再采用降温结晶方式获得L-精氨酸α-酮戊二酸盐的 粗品，粗品经溶解脱色，并进行有机溶剂重结晶，最终经干燥获得高纯度的L-精氨酸 α-酮戊二酸盐。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_α -酮戊二酸盐的工 艺，其特征在于所述的发酵液预处理工艺是将L-精氨酸发酵液和α-酮戊二酸发酵液 分别进行絮凝、过滤或离心，除去菌体和较大固体粒子，获得L-精氨酸和α _酮戊二酸 澄清发酵滤液的过程，所述的絮凝操作是采用硫酸铝、氯化钙、聚丙烯酰胺、壳聚糖等 絮凝剂或其他商品化的无机铝盐、铁盐、钙盐、高分子絮凝剂；所述的过滤操作，是采 用板框过滤、真空过滤或带式过滤等设备进行过滤，尤其适合规模化制备工艺；所述的 离心操作是采用离心分离设备进行固液分离，尤其适合小试制备过程。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_α -酮戊二酸盐的 工艺，其特征在于所述的螯合工艺，是根据滤液中L-精氨酸的含量，加入一定量的 α -酮戊二酸发酵滤液，或α -酮戊二酸溶液进行螯合反应的过程，α -酮戊二酸的加入 摩尔含量，是体系中L-精氨酸摩尔量的0.3 1.5倍。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_α -酮戊二酸盐的工 艺，其特征在于所述的浓缩工艺，是对含有L-精氨酸和α -酮戊二酸的螯合溶液进行 浓缩的过程，使AAKG达到过饱和状态，优选的浓缩设备是真空浓缩、二效浓缩或三效 浓缩装备，溶液浓缩到L-精氨酸和α -酮戊二酸原溶液混合液体积的15% 50%。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_α -酮戊二酸盐的工 艺，其特征在于所述的结晶工艺，是将浓缩液放置在温度_5°C 15°C下进行结晶，或 使用结晶锅，通过冷却液进行溶液冷却，结晶过程控制在4 50 h，结束后采用过滤或离 心收集晶体。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_α -酮戊二酸盐的工 艺，其特征在于所述的溶解脱色工艺，是将上述晶体重新溶解在2 5倍重量份的去离 子水中，搅拌使其充分溶解后，加入颗粒活性碳进行脱色，活性碳加入量相当于AAKG 晶体质量的0.5% 3.0%，搅拌并将溶液加热至40 90°C，并维持20 60分钟，再通 过板框过滤，收集AAKG滤液。
7.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸_α -酮戊二酸盐的工 艺，其特征在于所述的重结晶工艺，是在上述AAKG滤液中，缓慢加入溶液体积的 1 4倍的亲水性有机溶剂，室温或降温进行重结晶8 50 h，过滤收集晶体，并以少量 溶剂洗涤2 3次，所述的亲水性有机溶剂，包括乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、甘油和乙 腈，其中优选的溶剂为乙醇或丙酮。
8.根据权利要求1所述的从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸-α-酮戊二酸盐的工 艺，其特征在于所述的晶体干燥工艺，是采用真空干燥、热风循环烘箱或气流干燥设备进行晶体干燥， 其干燥温度50°C 150°C。
全文摘要
本发明属生物制药技术领域，涉及一种从发酵来源的L-精氨酸、α-酮戊二酸原料制备AAKG的方法，并且是直接用发酵液中的L-精氨酸与发酵液中α-酮戊二酸作为AAKG的原料，而不是用其提取精制的结晶制品。从发酵液中直接结晶制备L-精氨酸-α-酮戊二酸盐(AAKG)的工艺，主要由发酵液预处理、螯合、浓缩、结晶、溶解脱色、重结晶、干燥等技术单元构成。L-精氨酸发酵液经预处理，加入一定量的α-酮戊二酸发酵滤液进行螯合，经真空蒸发浓缩，再采用降温结晶获得粗品，粗品经有机溶剂重结晶获得高纯度的产品。本发明具有产品纯度高、流程短、质控容易、减排效果显著等优点。AAKG主要用于体格增强补剂，促进肌肉的快速增长和恢复，促进肝细胞对营养和能量的吸收，维护肝功能正常等作用。
文档编号C07C277/08GK102020593SQ201010565020
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者史劲松, 孙志浩, 方佳茂, 李少平, 许正宏, 陈伟滨 申请人:广东环西生物科技股份有限公司