调节HGFβ链和C-MET的相互作用的制作方法

专利名称：调节HGFβ链和C-MET的相互作用的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及分子生物学以及生长因子调节领域。更具体地，本发 明涉及HGF/c-met信号途径的调节物，以及所述调节物的用途。
背景技术：
肝细胞生长因子(HGF)，也已知为分散因子(SF),是Met的配体(Bottaro et al., 1991)， Met是原癌基因编码的受体酪氨酸激酶(Cooper et al,, 1984a&b)。 HGF与Met的结合诱导细胞内激酶结构域的磷酸化，导致一系 列复杂细胞内途径的活化，导致多种细胞类型的细胞生长，分化和迁移； 多个最近公开的综述提供了全面的综述(Birchmeier et al,, 2003; Trusolino and Comoglio， 2002; Maulik et al., 2002)。除了其在胚胎发育和组织再生中的 根本重要性，HGF/Met信号途径也在浸润性肿瘤生长以及转移中起作用并 由此可代表感兴趣的治疗耙(Birchmeier et al.， 2003; Trusolino and Comoglio, 2002; Danilkovitch-Miagkova and Zbar， 2002; Ma et al., 2003)。
HGF属于纤溶酶原相关的生长因子家族并包含含有N-末端指结构(N) 以及四个Kringle(Kl-K4)结构域的69 kDa a-链以及与来自Clan PA(S)/家族 SI的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的蛋白酶结构域非常相似的34 kDa p-链 (Nakamura et al" 1989; Donate et al.， 1994; Rawlings et al" 2002)。与凝血酶原和其它丝氨酸蛋白酶酶原 一样，HGF作为单链前体形式分泌(scHGF) 。 scHGF 结合细胞表面上或细胞外基质中的疏酸乙酰肝素蛋白聚糖，诸如syndecan-l (Derksen et al.， 2002)。疏酸乙酰肝素蛋白聚糖结合N结构域(Hartmann et al.,
1998) ,其对与位于K1中的氨基酸一起的高亲和力Met结合有贡献(Lokker etal.， 1994)。尽管scHGF能以高亲和力结合Met,它不能活化受体(Lokkeret al., 1992; Hartmann et al.， 1992)。获得HGF信号活性有赖于scHGF在 Arg494-Va1495的蛋白水解(活化)，所述蛋白水解导致成熟HGF这种二硫 键连接的a/|3异源二聚体形成(Lokker et al.， 1992; Hartmann et al., 1992; Naldinietal.， 1992)。 HGF (HGF卩-链)的蛋白酶样结构域缺乏催化活性，因为 它缺乏所需的Asp [cl02]-His [c57]-Ser [cl95](所有方括号中均为标准糜蛋 白酶原编号)催化三联体，所述催化三联体可在所有具有Gln534 [c57]和 Tyr673 [cl95]的丝氨酸蛋白酶中发现(Perona and Craik， 1995; Hedstrom， 2002)。
由于其在调节HGF活性中的重要性，该过程必须由HGF转化酶及其相 应的生理抑制物严格控制。scHGF活化通过糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在体 外介导，所述糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包括肝细胞生长因子活化物(HGFA) (Miyazawa et al.， 1993), matriptase/MT-SPl (Takeuchi et al. 1999; Lin et al.，
1999) ,尿激酶型纤溶酶原激活物(Naldinietal., 1992)，因子XIIa (Shimomura et al., 1995),因子XIa (Peek et al., 2002)和血浆激肽释放酶(kallikrein)(Peek et al.,2002)。与scHGF类似，这些蛋白酶作为无活性前体产生；它们的酶活性 也由其它活化蛋白酶以及Kunitz-和serpin-型抑制物严格调节。
已经描述了丝氨酸蛋白酶及其活化过程(Donateetal., 1994)。在丝氨酸 蛋白酶中，酶原的活化切割导致所谓的"活化结构域"的构象重排，导致 适当形成的活性位点以及底物/抑制物相互作用区。活化结构域构成三个表 面暴露的环(其分别称为[cl40]-, [cl80]-和[c220]-环)以及新形成的N末端 插入疏水袋子中(Huber and Bode, 1978)。在同源配体/受体对巨噬细胞刺激 蛋白(MSP)/Ron中，丝氨酸蛋白酶样MSP |3-链为受体结合提供主要的能量 (Wang etal" 1997; Miller and Leonard, 1998),这与HGF/Met系统相反，在该 系统中Met的高亲和力受体结合位点在HGF a-链中(Lokker et al.， 1994; Okigaki etal" 1992)。
本发明所引用的所有参考文献，包括专利申请和公开，的全部内容包含在本文作为参考。

发明内容
凝血酶原-相关的生长因子肝细胞生长因子(HGF)结合其受体酪氨酸激 酶Met (本文也称为c-Met或c-met)，其参与肿瘤的进展，组织再生以及浸润 性肿瘤生长。HGF蛋白酶-样(3链的成功表达和纯化(在本文描述)，使得能 够明确确定HGF具体为HGF P-链与c-Met的相互作用的性质，其导致对 c-Met活化机制的更为清楚的理解。本发明中在经验上证明，丝氨酸蛋白酶 -样HGF |3-链本身与Met结合。反之，HGF |3的酶原-样形式的Met结合弱 得多，提示加工时构象改变导致的最佳相互作用。细胞迁移，Met磷酸化， HGF-依赖性细胞增殖和Met结合试验中检测的一组(3-链突变体显示，全长 HGF突变体的生物活性降低至少部分由于HGF P-链与Met的结合所致。功 能结合位点包括'活化结构域'和'活性位点区，，类似于丝氨酸蛋白酶的底 物加工位点。数据表示活化的(但不是酶原样形式的)p链可包括与另一 分子诸如另一HGFP链的最佳作用所需的界面，从而实现最大/最佳c-met 活化。本文所述的突变分析提供了设计跨效力镨抑制野生型HGF p链相互 作用的HGF突变体的基础。所述突变体的实例在本发明描述。这些突变体 能够与野生型HGF竟争与c-met的结合，但是实现c-met相关生物功能的能 力降低。这在完全和基本抑制HGF/c-met轴是不需要的情况下是尤其有利 的；这一点尤其受至!j关注，因为HGF和c-met 在正常细胞和组织中遍在表 达。这些突变体也可用作治疗病理疾病的优选治疗剂，其中需要降低的但 不是完全缺乏的HGF/c-met生物活性。本发明的方法和组合物总体基于这 些发现，其将在下文更详细描述。显示HGF p链以及其与c-met的相互作 用可为设计针对与异常和不需要的HGF/c-met途径的信号相关的病理疾病 的预防和/和治疗性方法中的更大调整的独特的并且是有利的靶。因此，本 发明提供了鉴定和利用能够调节HGF p链与c-met的结合来调节HGF/c-met 途径，以及用于调节HGF/c-met信号相关生物/生理活性的物质的方法，组 合物，试剂盒以及制 品0
因此， 一方面，本发明提供筛选(或鉴定)选择性结合活化的肝细胞 生长因子卩链的物质的方法，所述方法包括(a)比较(i)候选物质与活化的 HGF p链(如下文更详细描述的)的结合，与(ii)所述候选物质与参比HGF卩链的结合，其中所述参比卩链不能特异性和/或实质性结合c-met;由此选 择(或鉴定)与活化的HGF(3链的结合亲和力高于与参比HGF卩链的结合 亲和力的候选物质作为与活化的HGF p链选择性结合的物质。 一些实施方 案中，参比P链包含在单链HGF多肽之中。 一些实施方案中，参比p链在 其N-末端融合于HGFa链的部分C末端区域，其中C末端区的位置494(对 应野生型人HGF)是除精氨酸以外的氨基酸(例如谷氨酸)。 一些实施方案 中，HGF a链的部分C末端区域由人HGF残基479-494的氨基酸序列组成或 基本由其组成。
另一方面，本发明提供筛选阻断c-met活化的物质的方法，所述方法包 括筛选与c-met结合(优选，但不必然为特异性地)并阻断HGF p链与c-met 特异性结合的物质。一些实施方案中，所述物质与HGF |3链竟争结合c-met。 一个实施方案中，所述物质包含与野生型HGF (例如，人)|3链，例如，包含 氨基酸残基495(Val)-728(Ser)的人|3链(例如，如上所述的野生型HGF |3 链)具有至少约60°/。， 70%， 80%, 90%, 95%, 99%序列相似性或同一性的氨 基酸序列或由所述序列组成或基本由所述序列组成。其中所述物质包含所 述氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成或基本由所述氨基酸序列组成的一 些实施方案中，位置604和/或561是除半胱氨酸以外的氨基酸。这些实施 方案中的一些中，所述物质基本上不能够与HGFa链或其一部分形成连接 (共价或非共价)。
本发明的筛选(鉴定)法的一些实施方案中，所述方法包括测定候选 物质与靶抗原的结合亲和力，所述靶抗原包括部分或全部天然存在形式的 HGF p链或其变体形式或由其组成或基本上由其组成。所述靶抗原可包括 任何多肽，所述多肽包含含有至少一种突变(具体地所述至少一种突变导 致HGF p链与c-Met结合的能力改变)的HGF p链氨基酸序列或由所述 氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。 一些实施方案中，所述多 肽包括融合于异源多肽序列(诸如部分或全部HGF a链)的HGF |3链氨基 酸序列，由其组成或基本由其组成。所述HGF (3链的实例包括本文所述的 那些，例如，酶原-样HGFp链(例如，位置494的突变)，HGF卩链(Cys柳Ser)， 和"活性位点区，，突变体。本发明提供了具有位于I3链中的一或多个位置中 的突变(包括活性位点区中的突变)的HGF突变体，所述位置诸如位置534, 578, 619， 673, 692, 693, 694, 695, 696， 699和/或702。其它提供的突变体包括在HGF中的位置具有突变的那些突变体，所述突变导致其不能在体内或 体外被活化(例如，切割的)； 一种所述突变体的实例包括位置424和/或 494中的突变。
另一方面，本发明提供了筛选HGF受体拮抗剂的方法，所述HGF受体 拮抗剂阻断HGF与其受体的结合(例如，HGF与第一受体分子的结合，和/或 HGF,例如通过a和(3链之一或两条链，与第二受体分子的结合以便受体的 二聚体化)，所述方法包括选择与HGF p链的残基534， 578， 619, 673, 692, 693,694,695,696,699和/或702中的至少一个，两个，三个，四个或4壬4可 数目到所有残基结合的物质。两种或多种残基的组合可包括HGF卩链的残 基534, 578， 619, 673， 692， 693, 694， 695, 696， 699和/或702中的任4可残基。 一个实施方案中，所述物质结合至少残基673和/或695。另一实施方案中， 所述物质结合(i)至少残基673和/或695，以及(ii)残基692。 另一实施方 案中，所述物质结合(i)残基673和/或695，以及(ii)残基692，以及(iii)残 基534和/或578。另一实施方案中，所述物质结合(i)残基673和/或695,以 及(ii)残基534,578和692中的至少一个，两个和所有三个。另一实施方案 中，所述物质结合(i)残基673, 695和696中的至少一个，两个和所有三个, 以及(ii)残基534，578，692和694中的至少一个，两个或至多为所有残基的 任何数目。 一个实施方案中，所述物质结合HGF p链，其中如果在位置 534, 673和/或692中存在突变，所述P链还包括位置578, 694， 695和696 中的至少一个，两个或最多为所有残基的任何数目的位置中的突变。这些 分子的一些实施方案中，活化的(3链具有通过切割单链HGF获得的j3链结 构； 一些实施方案中，所述切割位于或邻近单链HGF的残基494和495 ，例 如，所述切割存在于单链HGF的残基494和495之间。一个实施方案中，所 述物质结合残基673, 693， 694, 695和696中至少一个残基。 一个实施方案 中，所述物质结合残基692和702中至少一个。 一个实施方案中，所述物质 结合残基534和578。个实施方案中，所述物质结合残基513, 516, 619和699 中的至少一个。 一个实施方案中，所述物质结合选自以下各组的组的两个或 多个残基，所述各组为第一组，由残基673, 693, 694, 695和696组成，第 二组，由残基692和702组成，第三组，由残基534和578组成以及第四 组，由残基513, 516, 619和699组成。所述两个或多个残基可选自相同的
7组或所述四个组的任何组合。
一些实施方案中，所述物质进一步结合残基
423,424,494和/或495。
本领域技术人员显而易见，与上文所述一致的筛选试验也可包含以下 步骤第一个步骤是基于功能读出器(readout)进行筛选，以获得第一组候选 调节物质，然后第二步骤是基于第一组候选调节物质调节HGF p与c-met 的结合的能力进行筛选。功能读出器可以是本领域技术人员根据与 HGF/c-met信号途径相关的生物活性的知识显而易见的任何功能读出器。这 些生物活性包括但不限于C-met磷酸化，作为C-met底物的细胞分子的磷 酸化，细胞生长(增殖，存活等)，血管生成，细胞迁移，细胞形态发生等。
一方面，本发明提供HGF/c-met拮抗剂，其破坏HGF/c-met信号途径。 例如，本发明提供这样的分子，其结合结合活化的肝细胞生长因子p链并抑 制所述活化的HGF p链与c-met的特异性结合。 一个实施方案中，该分子与 活化形式的p链的结合亲和力高于该分子与酶原形式的卩链的结合亲和 力。 一些实施方案中，所述分子结合P链的活性位点/结构域。 一些实施方 案中，所述活性位点包含|3链残基534, 578, 673， 692, 694， 695和/或696中 的至少一个，两个，三个，四个，五个，六个或所有残基。两个或多个残 基的组合可包括HGF (3的残基534， 578， 673, 692, 694, 695和/或696中的 任何残基。 一些实施方案中，所述分子结合HGF p链的残基534, 578, 619， 673, 692， 693， 694, 695, 696, 699和/或702中的至少一个，两个，三个，四 个或最多为所有的任何数目的残基。两个或多个残基的组合可包括HGF卩 链残基534， 578, 619, 673, 692, 693， 694， 695， 696, 699和/或702中的任何残 基。 一个实施方案中，所述物质结合残基673和/或695。另一实施方案中, 所述物质结合(i)残基6"和/或695，以及(ii)残基692.另一实施方案中， 所述物质结合(i)残基673和/或695,以及(ii)残基692，以及(iii)残基534 和/或578。另一实施方案中，所述物质结合(i)至少残基673和/或695,以 及(ii)残基534，578和692中的至少一个，两个或所有残基。另一实施方案 中，所述物质结合(i)残基673，695和696中的至少一个，两个或所有残基, 以及(ii)残基534， 578, 692和694中的至少一个，两个或最多为所有的4壬4可 数目的残基。 一个实施方案中，所述物质结合HGF卩链，其中如果突变存 在于534, 673和/或692中，所述p链还包括位置578， 694, 695和696中的 至少一个，两个或最多为所有的任何数目的位置中的突变。 一个实施方案中，所述物质结合残基673, 693， 694, 695和696中至少一个。 一个实施方 案中，所述物质结合残基692和/或702。 一个实施方案中，所述物质结合残 基534和578中至少一个。一个实施方案中，所述物质结合残基513，516,619 和699中至少一个。 一个实施方案中，所述物质结合选自下述各组的两个或 多个残基，所述各组为第一组，由残基673,693,694，695和696组成，第 二组，由残基692和702组成，第三组，由残基534和578组成以及第四 组，由残基513, 516, 619和699组成。所述两个或多个残基可选自相同的 组或所述四个组的任何组合。 一些实施方案中，所述物质进一步结合残基 423,424,494和/或495。这些分子的一些实施方案中，活化的p链具有通过 切割单链HGF获得的(3链结构； 一些实施方案中，所述切割位于或邻近单 链HGF的残基494和495 ，例如，所述切割存在于单链HGF的残基494和 495之间。
一些实施方案中，所述物质或分子是或包含小分子，肽，抗体，抗体片 段，适体或其组合。
一方面，本发明提供HGF突变体，其具有HGF/c-met调节活性，例如 HGF/c-met活性的拮抗剂或HGF变体，其HGF生物活性(例如，细胞生长 刺激活性)降低但不缺失。 一个实施方案中，本发明的拮抗剂能抑制野生型 HGF的生物活性(沐/^)(所述生物活性包括但不限于刺激细胞增殖，促进 细胞存活，促进血管生成，诱导/促进细胞迁移)。 一个实施方案中，HGF变 体提供降低的细胞生长(包括但不限于细胞增殖，细胞存活，血管生成，细 胞迁移)促进活性。 一个实施方案中，HGF突变体是酶原-样HGF卩链(例如， 位置494的突变)。例如，这些突变体包括在HGF中使得其不能够在体外或 体内被活化(例如切割)的位置中的突变的那些突变体；所述突变体的一个实 例包括位置424和494中的突变。 一个实施方案中，所述HGF突变体是单 链HGF,例如HGF包含位置424和/或494中的突变，和/或邻近残基424 和/或494的位置。 一个实施方案中，本发明的HGF突变体还包括位置604 (例如HGF卩链Cys,Ser)中的突变。 一个实施方案中，本发明的HGF突变 体是如上所述的"活性位点区"突变体。 一个实施方案中，本发明提供HGF 突变体，其具有(3链中的一或多个位置中的突变(包括活性位点区中的突变)， 诸如位置534， 578, 619, 673, 692， 693， 694， 695， 696， 699和/或702。一些实施方案中，本发明的物质或分子与活化的|3链的结合抑制HGF 对c-met的活化。 一些实施方案中，所述物质或分子与活化的卩链的结合抑 制HGF诱导的细胞生长(诸如细胞增殖，存活，血管生成，形态发生，迁移)。 一些实施方案中，所述物质或分子与活化的p链的结合抑制c-met受体二聚化。
一些实施方案中，本发明的物质或分子通过如上所述本发明的筛选或 鉴定方法获得。
一些实施方案中，本发明的物质或分子包括肽。 一些实施方案中，所述
肽包含序列VDWVCFRDLGCDWEL。 一些实施方案中，所述肽包含氨基酸
序列，其与序列VDWVCFRDLGCDWEL具有至少50%， 60%， 70%, 80°/。， 90%,
95%, 98°/。序列同一性或相似性。该序列的变体可通过本领域已知方法获得，
例如通过组合诱变(例如，通过噬菌体展示)。所述变体的具体实例包括但不
限于下表1所示的那些。 一些实施方案中，这些肽包含增强它们的抑制和/
或治疗效果(包括，例如增强亲和力，改进的药物动力学性质(诸如半寿期,
稳定性，清除率)，对受试者的生物毒性降低)的修饰。所述修饰包括，例如
包括糖基化，PEG化，用非天然存在的功能等同氨基酸取代，连接基团等。
适宜修饰是本领域已知的，并且如需要可根据经验测定。
表1
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一个实施方案中，本发明提供HGF/c-met拮抗剂，其为与肝细胞生长因 子卩链竟争结合c-met的物质或分子。 一些实施方案中，所述分子抑制c-met 受体多聚体化(例如，二聚体化)。 一些实施方案中，所述分子包含变体(突变 体)P链,其与另一 p链分子相互作用(例如，多聚体化/二聚体化)的能力降低。 一些实施方案中，所述分子抑制HGFP链多聚体化(例如，二聚体化)。 一些 实施方案中，所述分子结合c-met但使c-met活化的能力降低(例如，降低的 c-met磷酸化，有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)磷酸化，和/或降低的 HGF/c-met依赖性细胞迁移，细胞增殖，细胞存活，细胞形态发生等所指示 的)。 一个实施方案中，所述分子包含含有至少部分HGF p链的多肽，由所 述多肽组成或基本由所述多肽组成，其中所述|3链包含位置695， 696和673 中的一或多个位置中的突变。 一个实施方案中，所述分子包含这样的多肽， 由所述多肽组成或基本由所述多肽组成，所述多肽包含位置695, 696和673 中的一或多个位置中的突变，以及位置534， 578, 692和694中的一或多个J立 置中的突变。两个或多个残基的组合可包括HGF p链的残基534, 578， 673， 692， 694, 695和696中的任何残基。 一个实施方案中，所述分子包含含有至 少部分HGF j3链的多肽，由所述多肽组成或基本由所述多肽组成，其中所 述卩链包含位于残基673和/或695中的突变。另一实施方案中，所述分子包含含有至少部分HGF p链的多肽，由所述多肽组成或基本由所述多肽组 成，其中所述(3链包含位于残基673和/或695,以及(ii)残基692中的突变。 另一实施方案中，所述分子包含含有至少部分HGF p链的多肽，由所述多 肽组成或基本由所述多肽组成，其中所述P链包含位于残基673和/或695， 以及(ii)残基692,以及(iii)至少残基534和/或578中的突变。另一实施方案 中，所述分子包含含有至少部分HGF p链的多肽，由所述多肽组成或基本 由所述多肽组成，其中所述卩链包含位于残基673和/或695,以及(ii)残基 534，578和692中的至少一个，两个或所有残基中的突变。另一实施方案中， 所述分子包含含有至少部分HGF p链的多肽，由所述多肽组成或基本由所 述多肽组成，其中所述p链包含位于残基673,695和696中的至少一个，两 个或所有残基，和(ii)残基534, 578， 692和694中的至少一个，两个和至多 所有的任何数目的残基中的突变。 一个实施方案中，所述分子包含含有至少 部分HGFP链的多肽，由所述多肽组成或基本由所述多肽组成，其中所述p 链包含突变，并且其中如果所述突变位于位置534， 673和/或692中，所述 (3链还包含位置578, 694， 695和696中的至少一个，两个或至多所有的任4可 数目的位置中的突变。 一个实施方案中，所述分子包含含有至少部分HGF卩 链的多肽，由所述多肽组成或基本由所述多肽组成，其中所述p链包含p链 中 一个或多个位置中的突变(包括活性位点区中的突变)，所述位置诸如位 置534, 578， 619, 673， 692, 693， 694， 695， 696, 699和/或702。 一个实施方案 中，所述分子包含至少部分HGF,由其组成或基本由其组成，其中所述部 分包含HGF中一或多个位置中的突变，其使得它不能在体外或体内被活化 (例如，裂解的)； 一种所述突变体实例包含位置424和/或494中的突变。这 些实施方案的一些中，p链(例如，通过二碌u键)与至少部分HGFa链(或其功 能等同物)相连。 一些实施方案中，所述(3链(例如，通过二硫键)与基本上全 部HGFa链(或其功能等同物)相连。 一些实施方案中，J3链不与HGFa链序列 (或其功能等同物)相连。其它物质或分子可通过本发明的筛选或鉴定方法获 得。 一些情况中，所述物质或分子可以是修饰基于本发明提供的信息设计 的起始物质或分子的重复(iteration)的产物，例如基于预期与具有功能上 有意义的残基相互作用的小分子支架或肽序列，包括但不限于HGF |3链的 活化结构域，活性区域和/或特定残基(诸如残基534, 578， 619, 673, 692， 693，694, 695, 696, 699和/或702中的一或多个)中的残基(例如,蛋白酶-样结构域 中的残基)。
其中一或多个位置相对于野生型对等序列被突变的本发明的任何分子 中，突变可为任何减少或消除(或在一些情况中增加)相应野生型残基的 功能效果的形式。突变可以本领域已知的任何适宜形式获得(和/或通过经-验 确定)，例如通过取代，插入，添加和/或缺失。 一些实施方案中，所述突变 包含非保守取代。适宜的取代包括但不限于本文所述那些(具体为实施例 中的那些)，例如利用诸如丙氨酸和丝氨酸的氨基酸。
一方面，分子/物质(例如，本文所述的HGF/c-met调节物)连接于毒素诸 如细胞毒剂。这些分子/物质可与添加剂/增强剂诸如》文射和/或化疗剂配制在 一起或耳关用。
本发明还提供用于调节与HGF/c-met信号轴失调相关的疾病状态的方 法和组合物。因此， 一方面，本发明提供调节受试者中的c-met活化的方法， 所述方法包括给药受试者本发明的HGF/c-met调节分子(例如，抑制野生型 (天然)HGF P链与c-met特异性结合的物质)，由此调节c-met活化。 一个 实施方案中，所述分子是HGF/c-met拮抗剂，其抑制HGF/c-met活性。 一个 实施方案中，所述拮抗剂抑制HGF卩与c-met的特异性结合。 一个实施方案 中，所述分子是增加HGF/c-met活性的激动剂。 一个实施方案中，所述激动 剂增加或实现HGF卩与c-met特异性结合的增力口。 一方面，本发明提供治疗 与受试者中c-met活化相关的病理性疾病，所述方法包括给予受试者本发明 的c-met拮抗剂(例如，抑制野生型(天然)HGF p链与c-met特异性结合的物 质)，由此抑制c-met活化。
HGF/c-met信号途径参与多种生物和生理功能，包括，例如，细胞生长 刺激(例如细胞增殖，细胞存活，细胞迁移，细胞形态发生)和血管生成。由 此，另一方面，本发明提供抑制c-met活化的细胞生长(例如增殖和/或存活) 的方法，所述方法包括将细胞或组织与本发明的c-met拮抗剂(例如，抑制野 生型(天然)HGF p链与c-met特异性结合的物质)接触，由此抑制与c-met活 化相关的细胞增殖。另一方面，本发明提供调节血管生成的方法，所述方法 包括给予患有与异常血管生成相关的疾病的细胞、组织和/或受试者本发明 的c-met拮抗剂(例如,抑制野生型(天然)HGF |3链与c-met特异性结合的物质): 由此调节血管生成。
13一方面，本发明提供本发明c-met拮抗剂在制备用于治疗和/或预防疾 病的药物中的用途，所述疾病诸如癌症，肿瘤，细胞增殖性疾病，免疫(诸 如自身免疫)疾病和/或血管生成相关疾病。c-met拮抗剂可为本发明所述的 任何形式，包括抗体，抗体片段，小分子(例如有机分子)，多肽(例如寡 肽)，核酸(例如寡核苷酸，诸如反义寡核苦酸)，适体，或其组合。
一方面，本发明提供本发明的核酸在制备用于治疗和/或预防疾病的药 物中的用途，所述疾病诸如癌症，肿瘤，细胞增殖性疾病，免疫(诸如自身 免疫)疾病和/或血管生成相关疾病。
的药物中的用途，所述疾病诸如诸如癌症，肺瘤，细胞增殖性疾病，免疫(诸 如自身免疫)疾病和/或血管生成相关疾病。
一方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防疾病 的药物中的用途，所述疾病诸如诸如癌症，肺瘤，细胞增殖性疾病，免疫(诸 如自身免疫)疾病和/或血管生成相关疾病。
一方面，本发明提供本发明的制品在制备用于治疗和/或预防疾病的药 物中的用途，所述疾病诸如诸如癌症，肿瘤，细胞增殖性疾病，免疫(诸如 自身免疫)疾病和/或血管生成相关疾病。
一方面，本发明提供本发明的试剂盒在制备用于治疗和/或预防疾病的 药物中的用途，所述疾病诸如诸如癌症，肿瘤，细胞增殖性疾病，免疫(诸 如自身免疫)疾病和/或血管生成相关疾病。
一方面，本发明提供抑制c-met活化的细胞增殖的方法，所述方法包括 将细胞或组织与有效量的本发明c-met拮抗剂接触，由此抑制与c-met活化 相关的细胞增殖。
一方面，本发明提供治疗与受试者中的c-met活化失调相关的病理性疾 病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的本发明的c-met拮抗剂，由此
治疗所述疾病。
一方面，本发明提供抑制表达c-met和/或肝细胞生长因子的细胞生长 的方法，所述方法包括将所述细胞与本发明的c-met拮抗剂接触，由此导致 对所述细胞生长的抑制。 一个实施方案中，所述细胞与不同的细胞表达的 HGF (例如，通过旁分泌岁丈应)接触。一方面，本发明提供治病性治疗患有含表达c-met和/或肝细胞生长因 子的细胞的癌性肿瘤的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的本 发明的c-met拮抗剂，由此有效治疗所述哺乳动物。 一个实施方案中，所述 细胞与不同的细胞表达的HGF (例如，通过旁分泌效应)接触。
一方面，本发明提供治疗或预防与c-met和/或肝细胞生长因子的表达 或活性增加相关的细胞增殖性疾病，所述方法包括给予需要所述治疗的受 试者有效量的本发明的c-met拮抗剂，由此有效治疗或预防所述细胞增生性 疾病。 一个实施方案中，所述增生性疾病是癌症。
一方面，本发明提供抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部 分有赖于c-met和/或肝细胞生长因子的生长增强效应，所述方法包括将所 述细胞与有效量的本发明的c-met拮抗剂接触，由此抑制所述细胞的生长。 一个实施方案中，所述细胞与不同的细胞表达的HGF (例如，通过旁分泌效 应)接触。
一方面，本发明提供治病性治疗哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿 瘤的生长至少部分有赖于c-met和/或肝细胞生长因子的生长增强效应，所 述方法将所述细胞与有效量的本发明的c-met拮抗剂接触，从而治疗所述肺 瘤。 一个实施方案中，所述细胞与不同的细胞表达的HGF(例如，通过旁分 泌岁丈应)t妄触。
本发明的方法可用来影响任何适宜的病理状态，例如与HGF/c-met信 号途径失调相关的细胞和/或组织。 一个实施方案中，作为本发明方法的靶 的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可选自以下细胞组成的组乳腺癌细胞， 结肠直肠癌细胞，肺癌细胞，乳头状癌细胞(例如，曱状腺的)，结肠癌细 胞，胰腺癌细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，中枢神经系统癌症细胞，成 骨肉瘤细胞，肾癌细胞，肝细胞癌细胞，膀胱癌细胞，胃癌细胞，头和颈 的鳞癌细胞，黑素瘤细胞和白血病细胞。 一个实施方案中，作为本发明方法 的靶的细胞是过度增殖性和/或增生性细胞。 一个实施方案中，作为本发明 方法的靶的细胞是发育不良细胞。另一实施方案中，作为本发明方法的靶 的细胞是转移细胞。
本发明的方法还可包含其它治疗步骤。例如， 一个实施方案中，所述方 法还包含其中靶细胞和/或组织(例如,癌症细胞)暴露于放疗或化疗剂的步 骤。
15如上所述，c-met活化是重要的生物过程，其失调导致多种病理性疾病。 因此，本发明方法的一个实施方案中，靶细胞(例如癌症细胞)是其中c-met 的活化与相同组织来源的正常细胞相比增强的细胞。 一个实施方案中，本发 明的方法导致靶细胞死亡。例如，与本发明的拮抗剂接触可导致细胞不能 通过c-met途径产生信号，导致细胞死亡。
c-met活化(由此信号)失调可由多种细胞改变引起，包括例如HGF(c-met 的同源配体)和/或c-met本身过表达。因此， 一些实施方案中，本发明的方 法包含靶向这样的细胞，其中所述细胞(例如,癌症细胞)表达的c-met和/ 或肝细胞生长因子与相同组织来源的正常细胞相比更多。c-met-表达型细胞 可由多种来源的HGF调节，即以自分泌或旁分泌的方式。例如，本发明方 法的一个实施方案中，靶细胞与不同的细胞中表达的肝细胞生长因子接触 或结合(例如，经由旁分泌效应)。所述不同的细^^的组织来源可相同或不同。 一个实施方案中，靶细胞靶细胞与靶细胞自身表达的HGF接触或结合(例如, 经由自分泌岁丈应/环)。
一方面，本发明提供一种方法，其包括给药受试者能够在超正常水平 (例如低于相似治疗条件下利用相似量的野生型HGF获得的活性水平)影 响HGF生物活性的HGF变体，其中HGF活性合意地为亚最佳(即，低于 野生型)水平，由此达到所需量的HGF生物活性。 一个实施方案中，所述 HGF变体包含位于位置534, 578, 619， 673， 692， 693, 694, 695, 696, 699和/ 或702中一或多个位置的突变。 一个实施方案中，所述HGF变体包含HGF 中的突变，其使得HGF能够在体外或体内被活化(例如，切割)； 一个所述突 变体的实例包含位置424和/或494中的突变。通过本方法处理的适宜疾病 包括任何与受试者中异常/不需要的HGF/c-met活性生理水平相关的病理性 疾病，其中需要严格调节治疗剂诱导的HGF/c-met活性的量。所述疾病的 实例包括但不限于，伤口愈合，心脏肥大，心肌梗塞，肢体缺血，外周动 脉疾病等。
本发明的任何c-met拮抗剂可用于本发明的方法中。例如，本发明方法 的一些实施方案中，c-met拮抗剂是包含活化的HGF (3链(或其功能对等物) 或由其组成或基本上由其组成的物质或分子，在一些实施方案中其不通过 二硫键连接于HGFa链(或其功能对等物)。 一些实施方案中，所述物质或分 子包含活化的HGF p链(或其功能对等物)或由其组成或基本上由其组成，其中包括位置534, 578， 619, 673, 692, 693， 694， 695， 696， 699和/或702 (包括 本文所述的任何组合)中一或多个位置中的突变。一些实施方案中，活化的p 链(例如，通过二硫键)连接于至少部分HGFct链(或其功能等同物)。 一些实 施方案中，活化的(3链(例如，通过二硫键)连接于基本上全部HGFa链(或其 功能等同物)。 一些实施方案中,活化的(3链不连接于HGFa链序歹'J (或其功能 等同物)。
本发明方法的一些实施方案中，所述物质或分子是或包含小分子，肽, 抗体，抗体片段，适体，或其组合。
本发明方法的一些实施方案中，c-met拮抗剂是包含肽或由其组成或基 本上由其组成物质或分子，在一些实施方案中所述肽包含序列 VDWVCFRDLGCDWEL或由其组成或基本上由其组成。 一些实施方案中， 所述肽包含这样的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸 序列与序列VDWVCFRDLGCDWEL具有至少50%， 60%, 70%, 80%, 90%, 95%， 98%序列同一性或相似性。 一个实施方案中，该序列的变体是上表1 中所述的那些。 一些实施方案中，这些肽包含增强它们的抑制和/或治疗效 果(包括，例如增强的亲和力，改善的药物动力学性质(诸如半寿期，稳定 性，清除率)，对受试者的降低的毒性)的修饰。所述修饰包括，例如涉及糖 基化，PEG化，用非天然存在但功能等同的氨基酸取代，连接基团等的修 饰。适宜的修饰是本领域已知的，并如需要还可通过经验确定。
一些实施方案中，本发明的方法利用通过本发明的任何筛选和/或鉴定 方法获得的物质或分子。
本发明的方法和组合物的一些实施方案中，抑制HGF/c-met信号的物 质/分子基本上不干扰除外活化的HGF卩链和c-met的细胞组分之间的结合 作用。例如， 一个实施方案中，所述物质/分子基本上不干扰HGF a链与 c-met的结合。
一方面，本发明提供包含本发明的一或多种物质s/分子(例如, HGF/c-met拮抗剂)以及载体的组合物。 一个实施方案中，所述载体是可药用的。
一方面，本发明提供编码本发明物质/分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)的 核酸。 一个实施方案中，本发明的核酸编码物质/分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)，其是或包含多肽(例如,寡肽)。
一个实施方案中，本发明的核酸编码是
或包含抗体或其片段的物质/分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)。 一方面，本发明提供载体，其包含本发明的核酸。
一方面，本发明提供宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。载体可为 任何类型，例如重组载体诸如表达载体。可使用多种宿主细胞的任何一种。 一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，义J^f麥。 一个实施方案中， 宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
一方面，本发明提供制备本发明物质/分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)的 方法。例如，本发明提供着制备是或包含抗体(或其片段)c-met拮抗剂的方 法，所述方法包括在编码所述抗体(或其片段)的本发明的适宜宿主细胞重 组载体中表达，并回收所述抗体。另一实例中，本发明提供制备是或包含多 肽(诸如寡肽)的物质/分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)的方法，所述方法包括 在编码所述多肽(诸如寡肽)的本发明的适宜宿主细胞重组载体中表达，并 回收所述多肽(诸如寡肽)。
一方面，本发明提供制品，其包含容器，以及包含在所述容器之内的组 合物，其中所述组合物包含本发明的一或多种物质/分子(例如，HGF/c-met 拮抗剂)。 一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸. 一个实施方案 中，包含物质/分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)的组合物还包舍栽体，其在一些 实施方案中是可药用的。 一个实施方案中，本发明的制品还包含用于将所述 组合物(例如拮抗剂)给予受试者的说明。
一方面，本发明提供试剂盒，其包含含有包食本发明一或多种物质/分 子(例如，HGF/c-met拮抗剂)的组合物的第一容器；以及含有緩冲剂的第二容 器。 一个实施方案中，所述緩冲剂可药用的。 一个实施方案中，包含物质/ 分子(例如，HGF/c-met拮抗剂)的组合物还包含载体，其在一些实施方案中是 可药用的。 一个实施方案中，试剂盒还包含将所述组合物(例如拮抗剂)给 予受试者的说明。
本发明涉及以下各项
1.筛选或鉴定选择性结合活化的肝细胞生长因子(HGF) P链的物质的 方法，所述方法包4舌
比较(i)候选物质与活化的HGF P链的结合，与(ii)候选物质与参 比HGF P链的结合，其中所述参比P链基本上不结合c-met,由此选择显示与活化的HGF P链的结合亲和力高于与参比HGF P 链的结合亲和力的候选物质，作为选择性结合活化的HGF p链的物质。
2. 项1的方法，其中所述参比P链包含在单链HGF多肽中。
3. 项1的方法，其中所述参比I3链在其N-末端融合于HGF oc链的部 分C末端区域，其中C末端区域的位置494 (对应野生型人HGF)是除精 氨酸以外的氨基酸。
4. 项3的方法，其中位置494的氨基酸是谷氨酸。
5. 项3或4的方法，其中HGF的部分C末端区包含人HGF的残基 479-494的氨基酸序列。
6. 筛选阻断c-met活化的物质的方法，所述方法包括筛选结合c-met并 阻断HGF (3链与c-met的特异性结合的物质。
7. 项6的方法，其中所述物质与HGF P链竟争结合c-met。
8. 调节受试者中c-met活化的方法，所述方法包括给予受试者调节HGF P链与c-met的特异性结合的物质，由此调节c-met活化。
9. 项8的方法，其中所述物质抑制HGF P链与c-met的特异性结合， 由此c-met活化减弱。
10. 项8的方法，其中所述物质增加HGF (3链与c-met的特异性结 合，由jt匕;t曽力口 c-met ，舌。
11. 抑制c-met活化的细胞增殖的方法，所述方法包括将细力包或组织 与抑制HGF P链与c-met的特异性结合的物质4妻触，由此抑制与c-met活 化相关的细胞增殖。
12. 治疗受试者中与c-met活化相关的病理疾病的方法，所述方法包 括给予受试者这样的物质，所述物质抑制HGF |3链与c-met的特异性结合， 由此抑制c-met活化。
13. 项8 - 12之一的方法，其中所述物质是不通过二碌"建连接于HGF cc链的活化的HGF P链。
14. 项8-12之 一 的方法，其中所述物质是包含序列 VDWVCFRDLGCDWEL的肽。
15. 项8-12之一的方法，其中所述物质通过项1-7之一的方法获
《曰付。16. 项1 - 15之一的方法，其中所述物质是小分子，肽，抗体，抗体片 段，适体，或其混合物。
17. 筛选阻断HGF与其受体结合的HGF受体拮抗剂的方法，所述方 法包括选择这样的物质，所述物质结合HGF P链的残基534, 578, 619,673, 692, 693， 694， 695， 696, 699和/或702中的至少一个。
18. 项17的方法，其中所述物质结合至少残基673和695。
19. 项18的方法，其中所述物质还结合残基534，578和692中的至少 一个》
20. 分子，其结合活化的肝细胞生长因子P链并抑制所述活化的HGF P链与c-met的特异性结合。
21. 项20的分子，其中所述分子对于P链的活化形式的结合亲和力 超过所述分子对酶原形式的P链的结合亲和力。
22. 项20或21的分子，其结合P链的活性位点。
23. 项22的分子，其中所述活性位点包含P链的残基534， 578， 619， 673， 692， 693， 694, 695， 696， 699和/或702中的至少一个。
24. 项22的分子，其中所述活化的|3链具有通过切割单链HGF获得 的P链构象。
25. 项24的分子，其中所述切割位于或邻近单链HGF的残基494和
495。
26. 项25的分子，其中所述切割出现在单链HGF的残基494和495之间。
27. 项20或21的分子，其中所述分子是小分子，抗体或其片段，肽， 或其组合。
28. 项20或21的分子，其中所述分子与活化的P链的结合抑制HGF 的c-met活4匕。
29. 项20或21的分子，其中所述分子与活化的P链的结合抑制HGF 诱导的细胞增殖。
30. 项20或21的分子，其中所述分子与活化的P链的结合抑制c-met 受体二聚化。
31. 项20-30之一的分子，其通过项1 - 15和17-19之一的方法获
《曰
付c
2032. 项20或21的分子，其为包含序列VDWVCFRDLGCDWEL的肽。
33. 分子，其与肝细胞生长因子P链竟争结合c-met 。
34. 项33的分子，其中所述分子是通过项6或7的方法获得的物质。
35. 项33或34的分子，其中所述分子抑制c-met受体二聚化。
附图简述


图1A-lEMet磷酸化试验中HGF卩的直接且竟争性结合以及活性。(A) HGF卩与Met的细胞结构域(Met ECD)通过表面胞质团共振4企测。Met ECD 在CM5芯片上 2000共振单位被捕荻。注入12.5 nM-lOO nM的系列浓度的 HGF卩。箭头表示结合和解离阶段的开始。数据利用Global Fit利用1:1结 合模型分析，由此确定kon, k。ff和Kd值。
(B) HGF J3/Met-IgG竟争ELISA。 Met-IgG被捕获在包被有兔抗-人IgG Fc的板上，并与含有250 nM马来酰亚胺-偶联的生物素化野生型HGF |3以 及一系列浓度的未标记的HGF p("和原HGF p(隱)的混合物一起保温。板上 结合的生物素化的野生型HGF p的量通过neutravidin-HRP检测。来自至少 3次独立测定的数据中的每一个都被标准化，取平均值并通过四参^t拟合利 用Kaleidagraph拟合，由此测定ICs。值；误差才奉表示标准偏差。
(C) AM9细胞中Met的HGF-依赖性磷酸化如实施例所述利用HGF (▲) 和HGF j3(争)进行。
(D) Met的HGF-依赖性磷酸化的抑制一式双份如实施例所述利用0.5 nM ( ), 0.25 nM (A)和0.125 nM (園)的HGF进行，以在浓度渐增的的HGF (3存在下刺激A549细胞。
(E) 全长HGF/Met-IgG竟争ELISA。这利用1 nMNHS-偶联的生物素化 HGF和一系列浓度未标记的HGF (O),和HGF p(參)以类似于(A)的方式进行。 使3次独立测定中每一次的数据标准化，取平均值并如上所述进行拟合。
图2A-2C通过HGF突变体的HGF-依赖性细胞迁移。(A) HGF突变体 的代表性纯度。对于阳离子交换纯化的HGF I623A,显示还原条件下通过 SDS-PAGE分析所有突变体的纯度。在1 % FBS (v/v)中，分泌的单链形式通过CHO表达的不完全转化显示在泳道1中。另外暴露于5。/。FBS完成了 活化过程产生纯的双链HGFI623A(泳道2)。分子量标记显示为Afrx 103。 B)存在1 nM HGF突变体时il夸孔试验中MDA-MB435细胞的迁移。活性 表达为暴露于1 nM野生型HGF的对照细胞的迁移百分比；显示了全长 HGF序列编号[糜蛋白酶原编号]。值表示4-8个独立试验的平均值± SD。 (C)缺乏野生型HGF (a) (a),存在1 nM野生型HGF (b)， 1 nM HGF R695A (c)和1 nMHGFG696A(d)的条件下，MDA-MB435的细胞迁移。
图3 HGF突变体对Met的HGF-依赖性磷酸化。A549细胞的Met 的磷酸化如实施例所述利用不同浓度的HGF (*),原HGF ( ), HGF Q534A (〇)，HGF D578A (▲), HGF Y673A (A)， HGF V692A ( )， HGF R695A (口)和 HGFG696A(V)进行。
图4 HGF卩突变体的Met竟争结合。利用HGF |3/Met-IgG竟争ELISA 测定以下物质的Met结合野生型HGF |3(厶)，HGF p(參)和HGF |3突变体 Q534A [c57](〇),D578A [cl02] (▲)， Y619A [cl43] ( )， R695A [c217] (□), G696A[c219](T)和I699A[c221a〗0)。数据利用Kaleidagraph通过四参凄t 拟合；对于n23时的多个独立测定，显示代表性单个竟争试验。
图5 HGF卩和2-链HGF中P-链的突变的影响。显示HGF p/Met竟争结合 ELISA中的HGFp突变体的Met竟争结合数据，以及MDA-MB-435细胞迁移 测定法中2-链HGF突变体的细胞迁移活性。除非另有说明，HGFJ3-链突变体 在C604S背景中制备。
图6A-6BHGF突变对细胞增殖的刺激和抑制的影响。(A) BxPC3细胞 中^链HGF和入链HGF突变体(具有指示的突变)的HGF-依赖性细胞增 殖。(B)HGF(3链(具有指示的突变)中2-链HGF突变体以及BxPC3细胞中 的1-链HGF对HGF-依赖性细胞增殖的抑制。
图7 HGF/Met竟争结合ELISA测定的HGF突变体与Met的相对结合 亲和力。图8不同浓度HGF突变体的促迁移活性。
图9 HGF |3链竟争ELISA测定的单链原-HGF和双链HGF与 c-Met-IgG的结合的分析。数据利用Kaleidagraph通过四参数拟合来拟合， 并测定双链HGF的IC5G。浓度直到100 nM的单链原-HGF不与HGF p链 竟争与c-Met-IgG的结合。
实施本发明的方法
技术领域：
本发明提供鉴定HGF/c-met信号途径(具体是HGFp链与c-met结合的 抑制剂)的方法，组合物，试剂盒以及制品，以及利用所述抑制物的方法。 本文详述了这些方法，组合物，试剂盒以及制品的细节。
常规技术
除非另有说明，本发明的实践将利用分子生物学常规技术(包括重组 技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学以及免疫学的常规技术，它们是 本领域4支术人员已知的。所述才支术在以下文献中详述诸如，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al" 1989); "Oligonuceotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed" 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al.， eds.， 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase链Reaction", (Mullis et al" ed.， 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V" 1988).
定义
相对于肽(例如，VDWVCFRDLGCDWEL)或多肽序列的"氨基酸序列同 一性百分数(％)"定义为比对该序列并在需要时导入间隔以达到最大序列同 一性百分数后，候选序列中与具体肽或多肽序列中氨基酸残基相同的氨基 酸残基的百分数，且任何保守取代都不作为该序列同一性的一部分。以测 定氨基酸序列同一性百分数为目的的序列对比可按本领域技术内的各种方 法完成，例如，使用公众可得到的计算机软件，例如BLAST, BLAST-2,ALIGN,或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于测量 序列对比的合适参数，包括在所比较的序列全长上达到最大对位排列所需 的任何算法。然而，为本文目的，氨基酸序列同一性％值可通过使用序列 比较计算机程序ALIGN-2获得，其中下面的表A提供了 ALIGN-2程序的 全部源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作且下面表 A所示的源代码在美国版权局，Washington D.C., 20559以用户文件存档， 以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序通过Genentech, Inc., South San Francisco, California可zi^开得到或者可/人下面表A提供的源代7马 编译。编译ALIGN-2程序应基于UNIX操作系统平台，优选数字式UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。
在使用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相 对于(to)、和(with)、或者针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸 序列同一性(任选可表述为具有或者包含相对于，和，或者针对给定氨基酸 序列B的某一°/。氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下
100乘以分数X/Y
中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。 可预料到如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A相 对于B的％氨基酸序列同一性不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值是如前 一段所述利用ALIGN-2计算机程序获得的值。
表A
/*
*
承C"C从12增加到15 承B是ND的均值
* match with stop is —M; stop-stop = 0; J (joker) match = 0
*/
#deflne _M-8 /* value of a match with a stop */<formula>formula see original document page 25</formula>/* N */ { 0, 2,-4， 2, 1，-4, 0, 2，画2, 0, 1,-3，陽2, 2,一M，-1， 1, 0， 1, 0, 0，-2，-4 0,-2, 1}，
/* O */ {_M,_M，—M,一M，—M,一M,一M，一M,-M,一M，一M，—M,_M，—M， 0，—M，—M，—M,一M，一M,一M，一M,一M,—M，—M,_M}，
/* P */ { 1,画1,-3，-1，腸1，國5,曙1， 0,-2, 0，國l，-3，-2,-l，一M， 6, 0, 0, 1, 0， 0,-1,-6
0,-5, 0},
/* Q*/ 0，-4, 3},
/*R*/ 0,-4, 0},
/* S " 0,-3， 0}，
/承了承/
0，-3, 0},
/*u*/
0， 0}，
/* v */
0，画2,-2},
/* W*/ 0,-6,17, 0, 0,國6},
/*X*/ 0, 0},
/氺Y承/
0， 0,10，國4}， /* z */ 0,-4, 4}
{ 0, 1,-5， 2, 2，画5，國1， 3，画2, 0， 1,-2,-1， 1,—M， 0, 4, l,-l,曙l, 0,-2,-5 {陽2, 0,-4,-1,國1,-4，-3, 2,-2， 0, 3,-3, 0, O,一M， 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2， 2 { 1, 0， 0, 0, 0，-3， l,-l，-l, 0, 0，國3，國2， 1，—M, l，-l， 0, 2, 1, 0,國1，-2 { 1， 0，-2， 0， 0,國3, 0,-1， 0, 0, O，画l,-l, 0，—M, O，國l，-l, 1， 3， 0, 0,-5 { 0， 0， 0， 0， 0， 0， 0, 0, 0， 0, 0， 0， 0, O，一M， 0， 0, 0， 0， 0， 0， 0， 0, 0 { 0，画2,-2,-2,-2,國1,-1，-2， 4, 0，-2, 2, 2,画2，—M,-l，-2,画2,-l， 0， 0， 4，-6 {-6,腸5,-8，-7，画7, 0，画7，國3,-5, 0,-3，画2,國4,-4,—M,-6,-5， 2,-2，-5 { 0, 0, 0, 0， 0, 0, 0， 0, 0， 0， 0， 0， 0， 0，—M， 0, 0, 0， 0， 0， 0， 0, 0， 0 {一3，-3, 0,-4,-4， 7,曙5， 0,-1， 0,國4,-l，-2，-2,一M，-5,-4,誦4，-3，-3， 0，國2 { 0, 1,-5， 2， 3,-5, 0， 2，-2, 0， 0,-2,-1， l，一M， 0， 3, 0, 0， 0, 0，-2,國6
/*
#include <stdio.h>
26#include <ctype.h>
#define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag */
#define MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps larger than this
#define JMPS 1024 /* max jmps in an path */
#define MX4 /* save if there's at least MX-1 bases since last jmp
弁defineDMAT3/* value of matching bases */
#defineDMIS0/* penalty for mismatched bases */
#defineDINSO8/* penalty for a gap */
#defineDINS11/* penalty per base */
#definePINS08/* penalty for a gap */
弁defiiiePINS14/* penalty per residue */
struct jmp {
short n[MAXJMP]; /* size of jmp (neg for dely) */ unsigned short x[MAXJMP]; /* base no. of jmp in seq x */ }; /* limits seq to 2A16-1 */
struct diag {
int score; /* score at last jmp */ longoffset; /* offset of prev block */ short ijmp; /* current jmp index */ struct jmp jp; /* list of jmps */
struct path {
int spc; /* number of leading spaces */ short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) */int };x[JMPS]; /*loc of jmp (last elem before gap) */
char/* output file name */
clmr*namex[2];seq names: getseqs()"
char*prog;/* prog name for err msgs */
char*seqx[2];/承seqs: getseqs()承/
intdmax;/* best diag: nw() */
intdmaxO;/* final diag */
intdna;/* set if dna: main() */
intendgaps^/* set if penalizing end gaps */
intgapx, gapy;/* total gaps in seqs */
intlenO, lenlj/* seq lens */
intngapx, ngapy;; /* total size of gaps V
intsmax^/* max score: nw() */
int*xbm;/* bitmap for matching */
longoffset;/* current offset in jmp file */
structdiag *dx;/* holds diagonals */
structpath pp[2];/* holds path for seqs */
char *calloc()， *malloc()， *index()， *strcpy(); char *getseq()， *g—calloc(》
/* Needleman-Wunsch alignment program
*
* usage: progs filel file2
* where filel and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguityAny lines beginning with'>' or '<' are ignored Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp
A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be
Output is in the file "align.out"
* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
承/
#include "nw-h" 弁include 'day.h"
static _dbval[26] = {
1,14，2， 13,0,0,4， 11 ，0，0,12,0,3， 15,0，0，0,5,6,8，8,7，9，0,10,0
};
static _pbval[26] = {
1, 21(1《('D'-'A'))I(1《('N'-W)), 4, 8， 16, 32, 64, 128, 256， OxFFFFFFF, 1《10， 1《11， 1《12， 1《13， 1《14， 1《15， 1 16, 1 17， 1《18, 1《19, 1《20， 1《21， 1《22， 1《23， 1《24， 1《25K1《('E'画'A'))I(1《('Q'-'A'))
};
m3in(3c, — main
int acj
char *av[];
prog = av[O]; if(ac !=3){
*
*
struct)
*
DNA
* 承fi)rintf(stderr,"usage: %s filel file2\n", prog);
fprintf(stderr，"where filel and file2 are two dna or two protein sequences.Vn"》
Q3rintf(stderr，"The sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintf(stderr，"Any lines beginning with';' or '<' are ignored\n"); ^)rintf(stderr，"Output is in the file \"align.out\"\n"); exit(l);
namex[O] = av[l];
namex[lj = av[2];
seqx[O] = getseq(namex[O]， &len0);
seqx[l] = getseq(namex[l]， &lenl);
xbm = (dna) _dbval: _pbval;
endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */
ofile — "align.out"; /* output file */
nw(); /* fill in the matrix, get the possible jmps */ readjmps();/* get the actual jmps */ print(); /* print stats, alignment */
cleanup(O);/* unlink any tmp files */
/* do the alignment, return best score: main()
* dna: values in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386， 1983
* pro: PAM 250 values
* When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer
* a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx* to a gap in seq y. 承/ nw()
nw
char*px， *py; /* seqs and ptrs */
int *ndely, *dely; /* keep track of dely */
int ndelx, delx;/* keep track of delx */
int *tmp; /* for swapping rowO， rowl */
int mis;/* score for each type */
int insO， insl; /* insertion penalties */
registerid; /* diagonal index */
registerij; /* jmp index */
register*col0, *coll; /* score for curr， last row */
registerxx, yy; /* index into seqs */
dx = (struct diag *)g—calloc("to get diags"， lenO+lenl+1, sizeof(struct
diag));
ndely = (int *)g—calloc("to get ndely", lenl+1, sizeof(int)); dely = (int *)g_calloc("to get dely", lenl+1, sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", lenl+1, sizeof(int)); coll = (int *)g_calloc("to get coll", lenl+1 ， sizeof(int)); insO = (dna) DINSO : PINSO; insl = (dna) DINS1 : PINS1;
smax = -10000; if (endgaps) {
for (co10
= dely[O] = -insO, yy = 1; yy <= lenl; yy++) { col0[yy] = dely[yy] = col0[yy國l] - insl; ndely[yy] = yy;co10
= 0;/* Waterman Bull Math Biol 84 */
else
for (yy = 1; yy <= lenl; yy++) dely[yy] = -insO;
/* fill in match matrix
for (px = seqx[O]， xx = 1; xx <= lenO; px++， xx++) { /* initialize first entry in col
if (endgaps) { if(xx== 1)
coll[O] = delx = -(insO+insl);
else
coll[O] = delx = co10
- insl; ndelx = xxj
else {
coll
= 0; delx = -insO; ndelx = 0;
.nw
for (py = seqx[l]， yy = 1; <= lenl; py++, yy++) { mis = colO[yy-l];if(dna)
mis += (xbm[承px-'A']&xbm[承py-'A']) DMAT : DMIS; else
mis += _day[*px-'A'][*py-'A'];
/* update penalty for del in x seq;
* favor new del over ongong del
* ignore MAXGAP if weighting endgaps
if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) { if (colO[yy] - insO >= dely[yy]) {
dely[yy] = colO[yy] - (insO+insl);
ndely[yy] — 1; } else {
dely[yy] -== insl;
ndely[yy]十+;
} else {
if (colO[yy] - (insO+insl) >= dely[yy]) {
dely[yy] = colO[yy] - (insO+insl);
ndely[yy] = 1; } else
ndely[yy]++;
/* update penalty for del in y seq;
* favor new del over ongong del
氺/
if (endgaps || ndelx < MAXGAP) { if (col 1 [yy-1 ] - insO >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl);ndelx = 1; J else {
delx -= insl; ndelx++;
} else {
if (col 1 [yy-1 ]國(insO+ins 1) >= delx) { delx = coll[yy曙l] - (insO+insl); ndelx = 1;
} else
ndelx++;
/* pick the maximum score; we're favoring * mis over any del and delx over dely
承/
id = xx - yy + lenl - 1;
if (mis >= delx && mis >= dely[yy])
col 1 [yy] = mis; else if (delx >= dely[yy]) {
col 1 [yy] 二 delx;ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[O] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+D測0)) { dx[id].ijmp++; if (++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp == 0; dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset);
dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dx[id] jp.x[ij] = xx; dx[id]. score = delx;
else {
coll[yy] = dely[yy]; ij = dx[id].ijmp; if卿d].jp.n[O] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score十D腿O)) { dx[id].ijmp++; if (++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset);
dx[id].jp.n[ij]=画ndely[yy]; dx[id].jp.x[ij] =xx; dx[id]. score = dely[yy];if (xx == lenO && yy < lenl) { /* last col
if (endgaps)
coll[yy] -= insO+insl*(lenl-yy); if (coll [yy] > smax) {
smax = coll[yy];
dmax — id;
if (endgaps && xx < lenO)
coll[yy-l] -= insO+insl*(lenO-xx);
if (col 1 [yy-1 ] > smax) { smax — coll[yy-l]; dmax — id;
tmp —— colO; colO = coll; coll = tmp;
(void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char "colO》 (void) free((char "coll); }
* printO誦國only routine visible outside this module
*
* static:
* getmat() — trace back best path, count matches: print()* pr—align() — print alignment of described in array p[]: print()
* dumpblock() — dump a block of lines with numbers, stars: pr—align()
* numsO — put out a number line: dumpblockO
* putline() — put out a line (name, [num]， seq, [num]): dumpblock()
* stars()國-put a line of stars: dumpblock()
* stripnameO — strip any path and prefix from a seqname
include "nw.h" #define SPC 3
#deflne P一LINE 256/* maximum output line */
弁define P一SPC 3 /* space between name or num and seq */
extern—day [26] [26])
intolen; /* set output line length */
FILE *fk;/* output file */
print() print
int lx， ly, firstgap， lastgap;/* overlap */
if ((fk = fopen(ofile, "w")) == 0) {
Q)rintf(stderr,"%s: can't write %s\n"， prog, ofile); cleanup(l》
fyrintf(fk， "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[O], lenO); fprintf(fk， "<second sequence: %s (length = %d)\n"， namex[l]， lenl); olen = 60; lx :— lenO;ly = lenl;
firstgap = lastgap = 0;
if (dmax < lenl - 1) { /* leading gap in x */ pp[O]邻c = firstgap — lenl - dmax - 1; ly -= pp[O]邻c;
else if (dmax > lenl画1) { /* leading gap in y */ pp[l].spc = firstgap = dmax - (lenl - 1); lx -=pp[l].spc;
if (dmaxO < lenO - 1) {/* trailing gap in x */ lastgap = lenO - dmaxO陽l; lx -= lastgap;
else if (dmaxO > lenO - 1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO - (lenO - 1); ly -= lastgap;
getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); pr—align();
/承
* trace back the best path, count matches static
getmat(lx, ly， firstgap, lastgap)
getmatint lx, ly; /* "core" (minus endgaps) */
int firstgap, lastgap; /* leading trailing overlap */
int nm， i0， il, sizO, sizl; char outx[32L double pet; registernO, nl; register char *p0, *pl;
/* get total matches, score
iO = il = sizO = sizl — 0; p0 = seqx[O] + pp[l].spc; pi = seqx[l] + pp[O].spc; n0 = pp[l].spc + 1; nl = pp[O]邻c + 1;
nm = 0j
while ( *p0&& *pl ) { if(sizO) {
nl++; siz0—;
else if (sizl) { p0++;
sizl画曙；
else {
if (xbm[*p0-'A']&xbm[*pl-'A'])nm++; if (nO++==pp
.x[iO])
sizO = pp
.n[iO++]; if(nl++==pp[l].x[il])
sizl =pp[l].n[il++];
pl++;
/* pet homology:
* if penalizing endgaps， base is the shorter seq
* else, knock off overhangs and take shorter core
if (endgaps)
lx = (lenO < lenl) lenO : lenl; else
lx = (lx < ly) lx : ly; pet = 100.*(double)nm/(double)lxj
fprintf(fk, "W');
fyrintf(fk， "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n",
nm， (nm == l) "" : "es", lx, pet);
fj)rintf(fk, "<gaps in first sequence: %d",
gapx); ...getmat if (gapx) {
(void) sprintf(outx, " (%d 0/os%s)"，ngapx， (dna) "base""'residue", (ngapx == l) "":"s"); f^rintf(fic,"%s"， outx);
^printf(fk, ", gaps in second sequence: %d", gapy); if (gapy) {
(void) sprintf(outx, " (0/od %s%s)"，
ngapy, (dna) "base":"residue", (ngapy == l) "":"s");
扭intf(fx,"o/os", outx);
if (dna)
fjprintf(fk,
"\n<score: ^>d (match = %d, mismatch = %d， gap penalty = %d + %d per base)Vn"，
smax， DMAT， DMIS, DINS0， DINS1);
else
扭intf(fe,
"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)\n",
smax, PINS0, PINS1); if (endgaps) fprintf(fk,
"〈endgaps penalized, left endgap: %d %s%s, right endgap: %d
%s%s\n",
firstgap, (dna) "base" : "residue", (firstgap == l) "" : "s", lastgap, (dna) "base" : "residue", (lastgap == l) "" : "s");
else
fprintf(fk， "<endgaps not penalizedW);
staticnm; /* matches in core — for checking */
staticlmax; /* lengths of stripped file names */static ij[2];
static nc[2];
static ni[2];
static siz[2];
static char *ps[2];
static char *po[2];
/* jmp index for a path */
/* number at start of current line */
/* current elem number画醫for gapping */
/* ptr to current element */
/* ptr to next output char slot */
static char out[2][P_LINE]; /* output line */ static char star[PJLINE]; /* set by stars() */
/承
* print alignment of described in struct path pp[]
static
pr_align() pr—align
int rm; /* char count */ int more; register ij
for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname(namex[i]); if (nn > lmax) lmax = nn;
nc[i] = 1; ni[i] = l; siz[i] = ij[i] = 0; ps[i] = s叫x[i]; po[i] = out[i]; }for (nn = nm
0， more
ign
for (i = more = 0; i < 2; i++) { /承
* do we have more of this sequence
if(!*ps[i]) continue;
more++;
if (pp[i]邻c) { /* leading space */ *po[i]++ =,'; pp[i].spc—;
else if (siz[i]) {/* in a gap */ *po[i]++ ='國'； siz[i]—;
else { /* we're putting a seq element
承/
*po[i] — *ps[i]; if (islower(*ps[i]))
*ps[i] = toupper(*ps[i]); P。[i]++; ps[i]++;
15 more; )
pr_al
are we at next gap for this seq* if(ni[i]==pp[i].x[ij[i]]){
/求
* we need to merge all gaps
* at this location
siz[i] = pp[i].n,++〗； while (ni[i] ==pp[i].x[ij[i]]) siz[i〗+=pp[i〗.n[ij[i]++];
ni[i]++;
if (++nn == olen || !more && nn) { dumpblock(》 for (i = 0; i < 2; i++)
po[i] = out[i]; nn = 0;
}
/承
* dump a block of lines, including numbers, stars: pr一align() 承/ static
dumpblock() dumpblock
registerfor (i = 0; i < 2; i++) *po[i]— = '\0';
dumpblock
(void) putc('\n'， fk); for (i = 0; i < 2; i++) {
if (承out[i] && (*out[i] != '' II *(po[i]) != '')) { if(i==0)
nums(i); if(i ==0&& *out[l])
stars(); putline(i);
if(i==0&& *out[l])
Q3rintf(fk, star); if(i==l)
nums(i);
* put out a number line: dumpblock()
static
nums(ix) nums
int ix; /* index in out[] holding seq line */char nline[P—LINE];
register i，jj
register char *pn, *px， *py;
for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P一SPC; i++, pn++) *pn ='';
for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++， pn++) { if(*py==''|| *py =-'-')
*pn =''; else {
if (io/"0 == 0 II (i == 1 && nc[ix] != l)) { j = (i<0)
for (px = pn; j; j /= 10， px—)
*px=jo/ol0 + '0'; if(i<0)
else
*pn = '\0'; nc[ix〗=i;
for (pn = nline; *pn; pn++)
(void) putc(*pn， fk); (void) putc('W， &);
/*
* put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock()承/
static
putline(ix) putline
intix; {
putline hit i;
register char *px;
for (px — namex[ix]， i = 0; *px && *px !=px++， i++)
(void) putc(*px， fk》 for (; i < lmax+P一SPC; i++)
(void) putc('', fx);
/* these count from 1:
* ni[] is current element (from 1)
* nc[] is number at start of current line
for (px = out[ix]; *px; px++)
(void) putc(*px&0x7F， fx); (void) putc('W， fk);
/*
* put a line of stars (seqs always in out[O], out[l]): dumpblock()static
stars()
stars
int i;
register char *pO， *pl， cx， *px;
if (!*out
II (*out
==''&& *(po
) == '') II !*out[l] II (*out[lJ ==''&& *(po[l])==''》 return; px = star;
for (i = lmax+P一SPC; i; i—) *px++ =,';
for (pO = out[O]， pl = out[l]; *p0 && *pl; p0++, pl++) { if (isalpha(*pO) && isalpha(*pl)) {
if (xbm[承pO-'A']&xbm[承pl画'A']) { cx —— '*'; nm++j
else if (!dna && 一day[承pO國'A'][承pl画VV] > 0)
cx = V;
else
cx ='';
else
cx =''; *px++ = cx;
*px++ = '\n';说明书第47/107页
/承
* strip path or prefix from pn, return len: pr一align() static
stripname(pn) stripname
char *pn; /* file name (may be path) */ register char *px， *py; py = 0;
for (px = pn; *px; px++) if (*px =='/') py = px + 1;
if(py)
(void) strcpy(pn, py); return(strlen(pn));
/承
* cleanup() — cleanup any tmp file
49* getseq()画誦read in seq， set dna， len， maxlen
* g一calloc() — calloc() with error checkin
* readjmps() — get the good jmps， from tmp file if necessary
* writejmps() -- write a filled array of jmps to a tmp file: nw()
*/
#include "皿h" #include <sys/file.h>
char *jname = 7tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */ FILE ";
intcleanup(); /* cleanup tmp file */
long lseek();
/承
* remove any tmp file if we blow
cleanup(i) cleanup
int i;
if(fj)
(void) unlink(jname); exit(i);
/*
* read, return ptr to seq， set dna, len， maxlen
* skip lines starting with ';'， '<'， or '>'
* seq in upper or lower casechar *
getseq(file， len) getseq
char *file; /* file name */ int *len; /* seq len */
char line[1024]， *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE
if ((fp = fopen(file，"r")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog， file); exit(l);
tlen = natgc = 0;
while (fgets(line, 1024,柳{
if (*line = ';' || *line ==|| *line ='>')
continue; for (px = line; *px != ，\n'; px++) if (isupper(*px) || islower(*px)) tlen++;
if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6)》==0) {
fprintf(stderr，"％s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n"， prog: tlen+6， file);
exit(l);
pseq[O] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = '\0';".getseq
py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp);
while (fgets(line, 1024,柳{
if (*line ==';' || *line == '<' || *line ==，>')
continue; for (px = line; *px != 'W; px++) { if (isupper(*px)) *py++ = *px; else if (islower(*px))
*py++ = toupper(*px); if (index("ATGCU",*(py-l)》 natgc++;
*py++ = '\0'; *py = '\0'; (void) fclose(f]p); dna = natgc 〉 (tlen/3); return(pseq+4);
char *
g一calloc(msg， nx， sz)
g_calloc
char *msg; /* program, calling routine */int nx, sz; /* number and size of elements */ char*px， *calloc();
if ((px = calloc((unsigned)nx， (unsigned)sz)) == 0) { if (*msg) {
fprintf(stderr， "％s: g—calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog:
msg， nx, sz);
exit(l); return(px》
/承
* get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[]， reset dmax: main()
readjmps() readjmps
int fd = -l; int siz，iO, il; register i，j，xx;
if,
(void) fclose(g);
if ((fd = open(j醒e, 0_RDONLY， 0)) < 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n"， prog， jname); cleanup(l》for (i = i0 = il =0, dmaxO 二 dmax, xx = lent);; i++) { while (1) {
for (j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx;.j--)
."readjmps
if (j < 0 && dx[dmax] .offset && 。 { (void) lseek(fd， dx[dmax].offset, 0); (void) read(fd， (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp)); (void) read(fd， (char *)&dx[dmax].offset:
sizeof(dx[dmax].offset));
dx[dmax].ijmp = MAXJMP曙l;
else
break;
if(i >=JMPS){
fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignment\n", prog); cleanup(l);
if(j>=0){
siz = dx[dmax].jp,n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += siz;
if (siz < 0) {/* gap in second seq */ pp[l].n[il] = -siz; xx += siz;
/* id = xx - yy + lenl - 1
54pp[l].x[il] = xx - dmax + lenl - 1; gapy++; ngapy -= siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz =(画siz < MAXGAP || endgaps) -siz : MAXGAP; il++;
else if (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp[O].n[iO] = siz; pp[O].x[iO] =xx; gapx++; ngapx += siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz = (siz < MAXGAP || endgaps) siz : MAXGAP; i0++;
else
break;
/* reverse the order of jmps
for (j = 0, iO—; j < iO; j++, iO画國){
i = pp[O].n[j]; pp[O].n[j] = pp[O].n[iO]; pp
.n[i0] = i; i = pp
.x[j]; pp
.x[j] = pp
.x[i0]; pp
.x[i0] = i;
for (j = 0， il—; j <il; j++， il—) {
i = PP[l].n[j]; PP[l].n[j] = pp[l].n[il]; pp[l].n[il] = i; i = pp[l].x[j]; pp[l]., = PP[l].则;PP[l].x[il] = i;if(fd>=0)
(void) close(fd);
if(fj)(
(void) imlink(jname);
offset = 0;
/承
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()
承/
writejmps(ix) writejmps
int ixj
char *mktemp();
if剛
if (mktemp(jname) < 0) {
fprintf(stderr， "％s: can't mktemp() %s\n"， prog, jname); cleanup(l》
if朋=fopen(j腿e， "w")) == 0) {
Q5rintf(stderr， "％s: can't write %s\n"， prog, jname); exit(l);
(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, g); (void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix],offset), 1， fj);本文术语"载体，"意图指一种核酸分子，其能运送与其相连的另一核酸
分子。 一种类型的载体是"质粒"，其指其中连接了其它DNA片段的环形 双链DNA环。另一类型的载体是噬菌体载体。另一类型的载体是病毒载体， 其中额外的DNA片段连入病毒基因组。 一些载体能够在其所导入的宿主细 胞(例如具有复制的细菌起点的细菌载体以及游离体哺乳动物载体)中自 主复制。其它载体(例如，非游离体哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时可被 整合入宿主细胞基因组中，由此与宿主基因组一同复制。此外， 一些载体 能够指导与它们可操作连接的基因的表达。所述载体在本文称为"重组表 达载体"(或简而言之，"重组载体")。通常，在重组DNA技术中应用的表达 载体通常是质粒的形式。本说明书中"质粒"和"载体"可互换使用，这是由于 质粒是最常使用的载体形式。
"多核苷酸,"或"核酸,"在本文可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物， 并包括DNA和RNA。所述核苷酸可为去氧核糖核苷酸，核糖核苦酸，修 饰的核苷酸或碱基，和/或它们的同系物，或任何可通过DNA或RNA聚合 酶或通过合成反应掺入聚合物的底物。多核香酸可包含修饰的核香酸，诸 如甲基化的核苦酸和它们的同系物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在 聚合物聚集之前或之后进行。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。多核苷 酸可在合成之后进一步修饰，诸如通过与标记偶联。其它类型的修饰包括， 例如"帽"，用类似物取代一或多个天然核苷酸，核苷酸间修饰，诸如，例 如具有不带电的连接(例如甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酸酰胺化物，氨基 甲酸酯等)以及具有带电的连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的 那些，含有悬垂部分(pendant moiety)的那些，诸如，例如，蛋白质(例如，核 酸酶，毒素，抗体，单个肽，ply-L-赖氨酸，等)，具有嵌入剂(例如，吖吱，补 骨脂素，等)的那些，含有螯合剂(例如，金属，放射活性金属，硼，氧化性金 属，等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，alpha异位性核 酸，等)的那些，以及多核苷酸的未经修饰的形式。此外，通常存在于糖中的 任何羟基可被取代，例如被膦酸(phosphonate)基团，磷酸基团，被标准保护 基团保护，或被活化以制备与其它核普酸的其它连接，或偶联于固体或半 固体支持物。5'和3'末端OH可^皮磷酸化或纟皮胺或1-20个碳原子的有才几 加帽基团部分取代。其它羟基可被衍生化为标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域通常已知的类似物形式的核糖或脱氧核糖，包括例如，2'-0-甲基 -,2'-0-烯丙基，2'-氟-或2'-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，.alpha,异位性糖, 差向异构体糖诸如阿拉伯糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖,
无环类似物以及非碱性核苦类似物诸如曱基核糖核苷。 一或多个磷酸二酯 键可通过其它天然连接基团来置换。这些其它天然连接基团包括，^旦不限 于以下实施方案其中磷酸被P(O)S("硫化物(thioate)"), P(S)S ("二硫化物 (dithioate) "), "(0)NR.sub.2 ("酰胺化物")，P(O)R, P(O)OR'， CO或CH.sub.2 ("formacetal")取代，其中每个R或R'独立地为H或取代的或未取代的烷基 (1-20 C.),可选含有醚(-O-)连接，芳基，烯基，环烷基，环烯基或amldyl。多 核香酸中的所有连接不必是相同的。前述内容适用于本发明所有多核苷酸， 包括RNA和DNA。
本文术语"寡核苦酸,"通常指短的，通常单链的，通常为合成的多核苷 酸，其长度通常但不必低于约200个核苷酸。术语"寡核苷酸"和"多核苷酸" 并非完全互相排斥。上述对于多核苷酸的描述同等并完全可用于寡核苷酸。
除非具体或在上下文中另有说明，本文术语"肝细胞生长因子"或 "HGF，指任何天然或变体(无论是天然或合成的)HGF多肽，其能在允许下 述过程出现的条件下允许活化HGF/c-met信号途径。术语"野生型HGF，通 常指包含天然存在的HGF蛋白的氨基酸序列的多肽。术语"野生型HGF 序列"通常指天然HGF中的氨基酸序列。
"活化的HGF p链"，或其变体，指任何HGF (3链，其具有野生型HGF (3 链从单链形式转化成双链形式(即，a和(3链)时野生型HGF (3链所具有的构 象，所述转化至少部分是由于野生型HGF蛋白的残基494和残基495之间 的裂解造成的。 一些实施方案中，所述构象具体指p链中蛋白酶-样结构域 的活化结构域的构象。 一些实施方案中，所述构象更为具体地指|3链中蛋白 酶-样结构域的活性位点区的构象。通常，采用所述构象揭示c-met结合位 点，如上所迷。
术语"抗体"和"免疫球蛋白"在最广义的意义上可互换使用，包括单克隆 抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)，多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗 体(辦如，双特异性抗体，只要它们显示所需的生物活性)并也可包括一些抗 体片段(如本文具体详述的)。抗体可为人抗体，人源化抗体和/或亲和力成 熟的抗体。"抗体片段"包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保持该部分存在 于完整抗体中时通常与该部分相关的至少一种，优选大部分或所有功能。 一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，并由此保持结合
抗原的能力。另一实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保持 至少一种通常与存在于完整抗体中的Fc区相关的生物功能，诸如FcRn结 合，抗体半寿期调节，ADCC功能以及补体结合。一个实施方案中，抗体片段 是单价抗体，其体内半寿期基本上类似完整抗体。例如，所述抗体片段可 包含一个抗原结合臂，其连接于Fc序列，能够使得所述片段在体内稳定。
本文中术语"单克隆抗体"，是指来自基本上均质的抗体群的抗体，即 除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克 隆抗体具有高度的特异性，是抗单个抗原的。而且，与通常包括的抗不同 决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原 上的单个表位。
本文中单克隆抗体具体包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分 与源自具体物种或属于具体抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同 源，但所述链的剩余部分的序列与源自另一个物种或属于另一个抗体种类 或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性)相同或同 源(美国专利4,816,567;和Morrison & a/.，iVaf/. 81:6851-6855 (1984》。
非人(例如，啮齿类)抗体的"人源化"形式是指含有来自非人抗体最小序 列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其 中来自受体高变区的残基被具有所需抗体特异性、亲和性、和能力的来自 诸如小鼠，大鼠，兔或非人灵长类的非人物种高变区(供体抗体)的残基取代。 在某些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基取代。 另外，人源化的抗体可包含在受体抗体或供体抗体中均没有发现的残基。 可作出这些修饰以进一步改进抗体效果。 一般来说，人源化抗体可包含至 少一个，且一般是两个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全部的高 变环相应于非人免疫球蛋白的高变环，且全部或基本上全部的FR区是人免 疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体优选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区 (Fc), —般是人免疫球蛋白的Fc。对于更详细的情况，参见，Jones & a/.， 淑匿321:522-525 (1986); Riechma皿ef a/"胸,332:323-329 (1988); andPresta, Cww O/ . S&w". 5zo/. 2:593-596 (1992). See also the following review articles and references cited therein: Vaswani and Hamilton,爿〃e^gy' c& 7w画wo/. 1:105-115 (1998); Harris, _S/oc/zew. rnms""/om1 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, CWr. Op.所oto^. 5:428-433 (1994)。
"人抗体"是具有与人产生的和/或使用本文公开的制备人抗体的任何技 术制得的抗体的氨基酸序列相对应氨基酸序列的抗体。人抗体的定义特别 排除含有非-人抗原-结合残基的人源化抗体。
"亲和力成熟"抗体，是指该抗体的一个或多个CDR区中存在一个或多 个改变，从而导致该抗体相对于其没有这些改变的亲本抗体而言，前者对 抗原的亲和力得到改善。优选的亲和力成熟抗体对其靶抗原具有纳摩尔甚 至皮克摩尔的亲和力。使用本领域已知的任何方法，制备亲和力成熟抗体。 Marks等Bio/technology 10: 779-783 (1992)描述通过VH和VL区改组 (shuffling)的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述在下列文献中: Barbas等Proc Nat. Acad. Sci， USA 91: 3809-3813 (1994); Schier等Gene 169: 147-155 (1995); Yelton等J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson等，J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995);和Hawkins et al， J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)。
"封闭"抗体或"拮抗剂"抗体是抑制或降低其所结合的抗原(例如， 活化的HGF卩链或活化的HGF P结合的c-met上的位点/表位)的生物活性的 抗体。优选的封闭或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
本文所述"激动剂抗体"是模拟目的多肽的至少一种功能活性的抗体 (例如，抗体可提供活化的HGF卩链的至少一种c-met活化功能)。
"疾病"是任何将从利用本发明的物质/分子或方法的治疗获益的疾病。 这包括慢性和急性疾病，其中包括使得哺乳动物易患目的疾病的病理条件。 本发明待治疗的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶 性疾病，神经元性，胶质细胞性，星形细胞性，下丘脑性和其它l^体性， 巨噬细胞性，上皮细胞性，基质性和嚢胚腔性(blastocoelic)疾病；以及炎性， 免疫性和其它血管生成相关的疾病。
术语"细胞增生性疾病，，和"增生性疾病，，指与一定程度的异常细胞增生 相关的疾病。 一个实施方案中，所述细胞增生性疾病是癌。本文使用的"肿瘤"是指不论是恶性还是良性的所有赘生性细胞生长和 增殖，以及所有前癌性和癌性的细胞和组织。术语"癌症"，"癌性"，"细胞增 生性疾病"，"增生性疾病"和"肿瘤"在本文中不互相排斥。
术语"癌"，是指或描述哺乳动物的以失控的细胞生长/增殖为特征的生 理状况。癌的实例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。
此类癌的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、 肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞 瘤、宫颈癌、卯巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠 直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺肾癌、外阴 癌、曱状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。
本文术语"治疗"指临床介入，以试图改变被治疗的个体或细胞的自然 病程，并可用于预防或临床病理过程中。治疗的所需效果包括防止疾病出 现或复发，緩解症状，减小疾病的任何直接或间接病理后果，防止转移， 降低疾病进展速率，緩解或减轻疾病状态，以及出院或改善预后。 一些实 施方案中，本发明的抗体用于延緩疾病或病症的进展。
"有效量，，指有效的量，以便在必要的剂量和时间下，实现所述的治 疗或预防结果。
本发明物质/分子，激动剂或拮抗剂的"治疗有效量"根据诸如个体疾 病状态，年龄，性别以及体重，以及所述物质/分子，激动剂或拮抗剂激发 个体内的所需反应的能力而不同。治疗有效量也指所述物质/分子，激动剂 或拮抗剂的治疗有益效果超过任何毒性或不利效果。"预防有效量，，指以必 要的剂量和时间，实现所需预防结果的有效量。通常但不必要，这是由于 预防量在得病以前或疾病早期用于受试者，所述预防有效量将低于治疗有 效量。
本文术语"细胞毒药剂"指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞石皮坏的 物质。该术语意图包括放射活性同位素(例如,At211， I131,1125， Y9G, Re186， Re188， Sm153, Bi212， P32和Lu的放射活性同位素)，化疗剂例如氨曱蝶呤，阿霉素， 长春花碱(长春新碱，长春碱，依托泊苷)，多柔比星，美法仑，丝裂霉素C, 苯丁酸氮芥，柔红霉素或其它嵌入剂，酶及其片段诸如核酸分解酶，抗生素 和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌药剂。其它细^^毒药 剂在下文描述。杀肿瘤药剂导致肿瘤细胞的破坏。
"化疗制剂"是在癌的治疗中使用的化学化合物。化疗制剂实例包括烷化
剂，如瘗替哌(thiotepa)和CYTOXAN 环磷酰胺(cyclosphamide);烷基磺酸 酉旨如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和派泊舒凡(piposulfan); 氮丙 口定如节替喊(bezodepa )，卡波醌(carboquone)，美妥替p底(meturedopa)和尿》克 亚胺(uredopa); 氮丙 定(ethylenimine)和曱基amelamine包括六曱蜜胺 (altretamine), 三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine), 三亚乙基石舞酰胺 (trietylenephosphoramide ), 三亚 乙基石克 石粦酰胺 (triethiylenethiophosphoramide)和三轻曱基蜜胺(trimethylolomelamine);多聚 乙酰(acetogenins)(具体是 bullatacin 和 bullatacinone); 喜树碱 (camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和 t匕4斤来杀斤(bizelesin)合成类4以物)；cryptophycins (具体是cryptophycin 1和 cryptophycin 8); 多4立司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成类似物, KW-2189和CB1國TM1); deutherobin; pancratistatin; sarcodictyin; spongistatin; 氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺 (cholophosphamide), 雌氮芥(estmmustine), 异环磷酰胺(ifosfamide)， 氮芥 (mechlorethamine),盐酸氧氮芥；美法仑，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯 乙酸氮芥(phenesterine ) ， ^^龙苯芥(prednimustine), 曲石粦胺(trofosfamide)， 尿嘧。定氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素 (chlorozotocin), 福莫司、汀(fotemustine), 洛莫司汁(lomustine)， 尼莫司 (nimustine), 雷莫司汁(ranimustine); 抗生素诸:i口 enediyne抗生素(例^(口刺孑包 霉素(calicheamicin),具体是刺孢霉素和刺孢霉素col (见，例如，Agnew， Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994));蒽环类抗生素(dynemicin)，包括 蒽环类抗生素A; 二膦酸盐(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate); esperamicin; 以及杀斤制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白 enediyne抗生素生色团)，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin), authramycin， 氮丝氨酸(azaserine),博莱霉素(bleomycin),放线菌素C (cactinomycin)， carabicin， 去曱柔红霉素(carminomycin)， 嗜癌霉素(carzinophilin)， chromomycinis，更生霉素(dactinomycin),柔红霉素,地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉 代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星)， 表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊达比星(idarubicin)，发波霉 素(marcellomycin)，丝裂霉素诸如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素 (nogalamycin),揪揽霉素(olivomycin), 培洛霉素(peplomycin)， potfiromycin， 嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链 脲霉素(streptozocin),杀结核菌素,乌苯美司(ubenimex),净司他丁(zinostatin)， 佐柔比星(zorubicin);抗代谢药如氨曱蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似 物如二曱叶酸(denopterin)，氨曱蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三曱曲沙 (trimetrexate);嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine), 6-巯基噪 令，石克咪噤 呤，辟u鸟。票p令；嘧，定类似物如安西他滨(ancitabine)，阿4U包苷(azacitidine), 6-氮尿苷，卡莫氟(carmofUr)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷 (doxifluridine),依诺他滨(enocitabine),氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮 (calusterone)， 丙酸曱#■烷酉同(dromostanolong propionate)， 环石危名,醇 (epitiostanol), 美》,氨(mepitiostane),睾内酉旨(testolactone); 4元肾上&泉类长口氨 鲁米特(aminoglutethimide)，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦 (trilostane);叶酸补充剂如frolinic acid; 醋葡内酯；醛石寿酰胺泮唐苷 (aldophosphamide glycoside); 氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid); 恩尿嘧咬 (eniluracil);安p丫口定(amsacrine); bestrabucil; t匕生群(bisantrene); 依达曲沙、 (edatraxate); defofamine; 秋7jC仙胺；地吖醌(diaziquone); elfornithine; elliptinium acetate; epothilone;依4乇格鲁(etoglucid);硝'酸镓；轻基脲；香蒜 多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登素类(maytansinoids)诸如美登素 (maytansine)和柄型菌素(ansamitocins);米托脈踪(mitoguazone); 米托蒽醌 (mitoxantrone); 莫旅达醇(mopidanmol); nitraerine; 喷司4也丁(pentostatin); 蛋氨氮芥(phenamet);外匕柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼 树酸(podophyllinic acid); 2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine); PSK⑧多泮唐 复合体(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);才艮霉素 (rhizoxin);西索菲兰(sizofiran); 错虫累胺(spirogermanium);纟田交链孑包菌酉同酸 (tenuazonic acid);三亚胺醌；2,2'，2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);单 端孑包霉烯(trichothecene)(具体是T-2毒素,verracurin A，杆孑包菌素(roridin)A 和anguidine);乌拉坦(urethan);长春碱酰胺；达卡巴"秦(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol); 二溴卫矛醇(mitolactol); 溴丙"底。秦 (pipobroman); gacytosine;阿拉伯糖香("Ara-C，，)；环磷酰胺；三胺硫磷 (thiotepa); 紫杉烷(taxoid),如TAXOL 紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , ABRAXANE 无克列莫佛(Cremophor誦free)，紫 杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒酉己制剂(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg， Illinois),和TAXOTERE doxetaxel(Rh6ne- Poulenc Rorer，'Antony, France); chloranbucil; GEMZAR⑧吉西他滨(gemcitabine); 6-碌u代鸟嘌呤;巯基嘌呤；氨 曱蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；鬼臼乙叉武(etoposide) (VP-16);异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱；NAVELBINE 长春瑞宾(vinorelbine); novantrone; 替尼泊戒(teniposide); 依达曲沙 (edatrexate);柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda;伊拜膦酸盐(ibandronate); CPT-11; 拓朴异构酶抑制剂RFS2000; 二氟曱基鸟氨酸(DMFO);维曱酸类(retinoids) 诸如维曱酸；c叩ecitabine;以及上述^f壬^T物质的可药用盐，酸或书t生物。
此定义还包括能调节或抑制激素对肺瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌 激素制剂和选择性雌激素受体调节物(SERM),包括，例如他莫昔芬 (tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬 (droloxifene)， 4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene， LY117018， 奥那司酮(onapristone),和FARESTON.托瑞米芬(FARESTON. toremifene); 抑制芳香酶的芳香酶抑制物，该酶调节肾上腺中的雌激素生成，诸如，例 如4(5)-咪哇，氨鲁米特(aminoglutethimide)， MEGASE 醋酸曱地孕酮 (megestrol acetate), AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)， formestanie，法倔哇 (fadrozole), RIVISOR⑧伏氯唑(vorozole), FEMARA⑧来曲唾(letrozole),和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole);和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide), 尼鲁米特(nilutamide),比卡鲁胺(bicalutamide),亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍 瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(l,3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似 物)；反义寡核苷酸，具体是抑制异常细胞增生所涉及的信号途径中的基因 表达的那些反义寡核苷酸，诸如，例如，PKC-a， Ralf和H-Ras;核酶诸如 VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗 诸如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗，LEUVECTIN 疫苗，和VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2; LURTOTECAN⑧拓朴异构酶1抑制物; ABARELIX rmRH;和上述任何物质的可药用盐、酸或书f生物。
本文所用"生长抑制剂"，是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或 组合物，其中所述细胞的生长有赖于活化。因此，生长抑制剂是显著降4氐S 期的HGF/c-met依赖型细胞的百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断 细胞周期进程的试剂(在S期之外的环节)，譬如，诱导Gl期停滞和M-期 停滞的试剂。传统的M-期阻断剂包括长春花碱(长春新碱和长春碱)、紫杉 烷(taxane)和拓朴酶II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依^l乇泊苷和 博莱霉素。那些使G1期停滞的试剂也涉及S-期停滞，例如，DNA烷化剂 如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨曱蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿 糖胞苷。进一 步的信息可在下列文献中找到The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn和Israel编辑，第 一章,题目为"Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" by Murakami等(WB Saunders: Philadelphia, 1995)， 特别是第13页。紫杉烷(taxanes)、紫杉醇(paclitaxel)和紫杉萜(docetaxel) 都是来自紫杉的抗癌药物。紫杉萜(TAXOTERE⑧，Rhone-PoulencRorer)，来 自欧洲紫杉，是紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫 杉醇和紫杉萜促进微管自微管蛋白二聚体的聚集，并通过防止去聚合化来 稳定微管，所述去聚合化导致细胞中的有丝分裂被抑制。
"阿霉素"是蒽环霉素类抗生素。阿霉素的化学全名为(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2, 3， 6-三去氧-a-L-来苏-吡喃糖苷基)氧代]-7， 8, 9, 10-四氢-6, 8， 11 -三羟-8-(羟乙酰)-甲氧基-5, 12-naphthacenedione。
载体构建
编码本文所述多肽的多核苷酸序列可利用标准重组技术获得。所需多 核苷酸序列可适宜源细胞分离并且从测序。抗体源细胞将包括产生抗体的 细胞，诸如杂交瘤细胞。可选，多核苷酸可利用核苷酸合成仪或PCR技术 合成。 一旦获得，编码所述免疫球蛋白的序列被插入能够在宿主细胞中复 制并表达异源多核苷酸序列的重组载体中。许多可得并且本领域已知的载 体可用于本发明的目的。选择适宜载体将主要有赖于待插入载体的核酸的 大小以及待用所述载体转化的具体宿主细胞。每个载体含有各种成分，根据它的功能(扩增和/或表达异源多核苷酸)以及其与其所定居的具体宿主
细胞的相容性而定。所述载体成分通常包括，但不限于复制起点(具体 是载体插入真核细胞时)，选择标记基因，启动子，核糖体结合位点(RBS)， 信号序列，异源核酸插入物以及转录终止序列。
通常，含有来自与所述宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质 粒载体与这些宿主联用。载体通常携带复制位点，以及标记序列，其能够 在转化的细胞中提供表型选择。例如，大肠杆菌通常利用来自大肠杆菌的 质粒pBRK2转化。pBR322含有编码氨节西林(Amp)以及四环素(Tet)抗 性的基因，由此提供鉴定转化的细胞的容易的工具。pBR322，其衍生物，或 其它微生物质粒或细菌噬菌体也可含有或经修饰含有启动子，其可被微生 物体用于表达外源蛋白质。
此外，含有与宿主生物体相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用 作与这些宿主联用的转化型载体。例如，细菌噬菌体诸如XGEM.TM,ll可 用于制备重组载体，其可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392。
技术人员可确定。多种可能的宿主细胞所识别的大量启动子是已知的。所 选启动子通过用限制酶消化从源DNA去除启动子并将分离的启动子序列插 入所选载体而可操作地连接于编码本发明所述多肽的顺反子DNA。天然启 动子序列和许多异源启动子可用于直接扩增和/或表达靶基因。然而，优选 异源启动子，这是由于它们与天然靶多肽启动子相比允许更多的转录以及 所表达靶基因的更高的产量。
适于用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子，(3-galactamase和乳糖启 动子系统，色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子诸如toc或加启动子。然 而，其它在细菌中有功能的启动子(诸如其它已知细菌或噬菌体启动子) 也适合。它们的核苷酸序列已经公开，由此使得本领域技术人员可操作地 将它们连于编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269)，利用接头或连接物以提供任何所需的限制位点。
一些实施方案中，重组载体内的每个顺反子包含分泌信号序列组分，其 指导表达的多肽穿过膜。通常，信号序列可为载体的组分，或其可为插入 所述载体的靶多肽DNA的一部分。被选择用于本发明目的的信号序列应为 宿主细胞识别并加工(即通过信号肽酶切割)的序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列由所选的原核信 号序列取代，例如所述原核信号序列选自碱性磷酸酶，青霉素酶，Ipp，或
热稳定内毒素II (STII)前导序列，LamB， PhoE, PelB， OmpA和MBP组成的组。
适于表达多肽的原核宿主细J包包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌 (Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃 希氏菌(Escherichia)(例如大肠杆菌(Escherichia coli)),芽孢杆菌(Bacilli)(例 如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)),肠杆菌(Enterobacteria)，假单胞菌属 (Pseudomonas species)(例如绿脓杆菌(P. aeruginosa)), 鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) , Serratiamarcescans,克雷伯氏菌(Klebsiella)，变形 菌(Proteus),志贺氏菌(Shigella),根瘤菌(Rhizobia),透明颤菌(Vitreoscilla) 或副球菌(Paracoccus)。优选，使用革兰氏阴性细胞。优选所述宿主细胞应 分泌最小量的蛋白水解酶，其它蛋白酶移植物也可合意地包含在细胞培养 物中。
多肽制备
宿主细胞用上述表达载体转化或抓南，并在常规营养培养基中培养， 所述培养基经改造适于诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基 因。
转染指宿主细胞吸收表达载体，而无论任何编码序列是否被实际表达。 转染方法对于一般技术人员公知，例如，CaP04处理法和电穿孔法。通常当 该载体的操作的任何指示出现在宿主细胞内时，认为转染成功。
转化指将DNA导入原核宿主细胞使得所述DNA可复制，所述DNA可 作为染色体外元件或通过染色体组成部分。# 据^1用的宿主细;1包，转化利 用适合所述细胞的标准技术进行。利用氯化钩的4丐处理通常用于含有实质 性细胞壁障碍的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。另一种 所用的技术为电穿孔。
用于产生本发明多肽的原核细胞生长在本领域已知适于培养所选宿 主细胞的培养基中。适宜培养基的实例包括添加必要营养补充物的luria培 养液(LB)中。优选实施方案中，所述培养基含有选择剂，其基于表达载体的构建来选择，以选择性允许含有所述表达载体的原核细胞生长。例如，将 氨节西林加入培养基用于表达氨千西林抗性基因细胞的生长。
除碳，氮，和无机磷酸盐来源以外的任何必须补充物也以适当浓度包 括在内，其被单独引入或作为与其它补充物或培养基的混合物诸如复合氮 源。可选，所述培养基可含有一或多种还原剂，所述还原剂选自谷胱甘肽、 半胱氨酸、胱胺、巯基醋酸盐(S旨)、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇组成的组。
所述原核宿主细胞在适宜温度培养。对于大肠杆菌生长，例如，优选温
度为约20。C -约39。C，更优选约25°C -约37。C，更优选约30°C。培养基 的pH可为约5-约9的任何pH，主要根据宿主生物体而不同。对于大肠杆 菌，pH优选约6.8 -约7.4,更优选约7.0。
如果可诱导启动子用于表达载体中，蛋白质表达在适于启动子活化的 条件下诱导。例如，如果用PhoA启动子控制转录，转化的宿主细胞可培养 在磷酸盐(酯)限制性培养基中用于诱导。可根据所用载体构建体使用多种其 它诱导物，如本领域已知的。
在生物体中表达的本文所述多肽可分泌入宿主细胞周质并从中回收。 蛋白质回收通常涉及破坏生物体，通常通过诸如渗透休克(osmotic shock), 超声法或裂解法等方法。 一旦细胞被破坏，细胞碎片或完整细胞可通过离 心或过滤回收。所述蛋白质可进一步纯化，例如通过亲和树脂层析。可选， 蛋白质可转运入培养基并从中分离。细胞可从培养物去除并过滤培养物上 清，浓缩用于进一步纯化产生的蛋白质。表达的多肽进一步分离并利用常 规已知方法鉴定，诸如在免疫亲和或离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反 相HPLC;在硅胶或离子交换树脂诸如DEAE上层析；硫酸铵沉淀；凝胶过 滤，利用例如，SephadexG-75;疏水亲和树脂，利用固定在基质上的适宜抗 原的配体亲和以及Western印迹测定法。
除了原核宿主细胞，真核宿主细胞系统在本领域也充分建立。适宜宿主 包括哺乳动物细胞系诸如CHO，和昆虫细胞诸如下文所述那些。
多肽纯化
制备的多肽可被纯化以获得对于进一步测定和使用基本上均质的制备 物。采用本领域已知的标准蛋白纯化方法。以下步骤是适宜纯化步骤的实 例在免疫亲和或离子交换柱上进行分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE上进行层析，层析聚焦，SDS-PAGE，利 用例如S印hadex G-75碌u酸铵沉淀和凝月交过滤。 本发明的方法
技术领域：
本发明提供各种方法，其基于活化的HGF卩能够直接结合c-met，并且 所述结合可用适宜物质和分子抑制这一发现。
各种物质或分子(包括肽，等)可用作治疗剂。这些物质或分子可#4居制 备可药用组合物的已知方法配制，由此将其产物与可药用载体混合。本发 明的多肽、抗体或拮抗剂的治疗组合物的制备如下将具有适当纯度的所 需分子与可选的药物可接受的载体、赋形剂、或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol， A. ed. (1980)，并以冻干酉己制剂或 水溶液的形式来储藏。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所用剂量及浓 度对接受者无毒性，并包括緩冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐，及其它有机酸； 抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量多肽(少于约10个残基)多肽；蛋白质如 血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸 如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖 及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA;糖醇如 甘露醇、或山梨醇；成盐反离子如钠；；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)； 和/或非离子型表面活性剂如TWEEN , PLURONICS頂或PEG。
用于体内给药的配制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜轻易实现， 其在冻干和溶解之前或之后进行。
本文的治疗组合物通常可置于具有无菌入口的容器中，例如静脉内药 包或具有可用皮下注射针穿透的塞子的小瓶。
给药途径与已知方法一致，例如通过静脉内、腹腔内、脑内、肌内、 眼内、动脉内、或损伤内途径注射或输注，局部给药或通过持续释放系统。
本发明药物组合物的剂量和所需药物浓度根据预期的具体用途而不 同。试剂剂量的或给药途径的确定是普通医师已知的。动物试验为人治疗 的有效剂量的确定提供了可信的指导。有效剂量的物种间换算可根据 Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al.， Eds" Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96中所述的原则进行。采用本发明的物质或分子的体内用药时，常规剂量为约10ng/kg到100 mg/kg哺乳动物体重或更高每天，优选约1 pg/kg/天-10 mg/kg/天，根据给 药途径而不同。具体递送剂量和方法的指导见文献；见例如美国专利 4,657,760; 5,206,344;或5,225,212。预期不同剂量对于不同的治疗化合物和 不同疾病有效，给药靶向一个器官或组织例如可使得耙向另一器官或组织 的递送方式不同成为必要。
当需要持续释放给药物质或分子是具有适于治疗任何需要给药所述物 质或分子的疾病或病症的释i文性质的配制剂中所需的时，涉及所述物质或 分子的微被嚢化。微被嚢化重组蛋白质用于持续释放对于人生长激素 (rhGH),干扰素-(rhIFN-),白介素-2,和MNrgpl20已经成功进行。Johnson et al" Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda， Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Horn et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adiuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692， WO 96/40072， WO 96/07399;和美国专利5,654,010。
这些蛋白质的持续释放配制剂利用聚-乳酸-共乙醇酸 (poly-lactic-coglycolic acid) (PLGA)聚合物开发，这是由于PLGA的生物相容 性以及广泛的生物可降解性质。PLGA，乳酸和乙醇酸的降解产物可在人体 内迅速清除。此外，该聚合物的可降解性可调节到数月到数年，根据其分 子量和组分而异。Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York， 1990)， pp. 1-41。
本发明包括筛选化合物以鉴定通过千扰HGF |3链和c-met相互作用来 抑制HGF/c-met信号的那些物质。筛选测定法被设计为鉴定这样的化合物， 其结合或复合活化的(且优选非酶原-样)HGF p链和/或c-met (在c-met中抑 制活化的HGF (3链与c-met结合的位点上)，或干扰活化的HGF |3链与其它 细胞蛋白相互作用。所述筛选测定法将包括适于高通量化学文库筛选的测 定法，使得它们尤其适于鉴定小分子候选药物。测定法可以多种形式进行，包括蛋白质-蛋白质结合试验，生物化学 筛选测定法，免疫测定法，以及基于细胞的测定法，其是本领域已知的。
对于拮抗剂的所有测定法的共同之处在于它们需要将候选药物与HGF (3链(或其等价物)和/或c-met上的位点接触，所述位点参与活化的HGF p 《连与c-met的结合作用，所述接触在足以允许这两个组分相互作用的条件和 时间下进行。
在结合试验中，所述相互作用是结合，形成的复合物可在反应混合物 中分离并检测。在具体实施方案中，候选物质或分子通过共价或非共价附 着固定在固相例如微量滴定板上。非共价附着通常通过用物质/分子溶液包 被固体表面并进行干燥来实现。可选，固定的亲和分子，诸如特异于待固 定的物质/分子的抗体例如单克隆抗体，可用于将所述物质/分子锚定在固体 表面。所述测定法通过将用可4企测标记来标记的非固定的组分加入固定的 组分例如含有锚定的组分的包被的表面来进行。当反应完全时，非反应性 组分被去除，例如通过洗涤，并检测锚定在固体表面的复合物。当最初非 固定组分携带可检测标记时，固定在所述表面的标记的检测表明复合出现。 如果初始非固定组分不携带标记，可通过利用特异性结合所述固定复合体 的标记的抗体来4企测复合。
如果候选化合物与活化的HGF (3链或c-met反应但不发生结合，其与所 述多肽的反应可利用已知用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法测定。 这些测定包括传统方法，如交联、共免疫沉淀、和通过梯度或色镨柱来共 纯化。另外，蛋白质-蛋白质相互作用可用基于酵母的遗传系统来监测，如 Fields及其合作者(Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989)所 述；Chien等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 H991V),如Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5789-5793 (1991)公开的那样。很 多转录激活剂，如酵母GAL4,其由两个物理上分离的(physically discrete) 模块结构域(modular domain)组成，其中一个结构域用作结合DNA的结构 域，另一个结构域用作转录激活结构域。上述出版物所述的酵母表达系统(通 常称为"双杂合系统")利用此特性，使用了两种杂合蛋白，在其中一种杂合 蛋白中，靶蛋白与GAL4的DNA结合区融合，而在另一种杂合蛋白中，候 选的活化蛋白质与活化域融合。受GAL4-活化的启动子控制的GALl-/"cZ 报道基因的表达，依赖于借助蛋白质-蛋白质相互作用而重建GAL4活性。包含相互作用的多肽的集落，用针对P-半乳糖苷酶的产色底物来检测。用 双杂合技术来鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试
剂盒(MATCHMAKERTM)可购自Clontech。此系统也可扩展用于《会制与特定 蛋白质相互作用有关的蛋白质结构域的图语，以及查明对这些相互作用关 键的氨基酸残基。
干扰活化的HGF p链与c-met相互作用的化合物可如下检测通常在允 许两种产物相互作用与结合的条件和时间下，制备含有活化的HGF |3链和 c-met(或其包含c-met上同源活化的HGF |3链结合位点的等价物)的混合物。 为检测候选化合物抑制结合的能力，所述反应在缺乏和存在候选化合物的 条件下进行。此外，将安慰剂加入第三反应混合物，作为阳性对照。存在 混合物中的受试化合物与活化的HGFP链和/或c-met(或其等价物如上所 述)的结合(复合体形成)如上所述进行监测。复合体在对照反应而不是含 有受试化合物的反应混合物中形成指示所述受试化合物干扰活化的HGF |3 链与c-met的相互作用。
为测定抑制剂(诸如拮抗剂)，包含活化的HGF |3链的2-链HGF可与待 筛选具体活性的化合物一起加入细胞，所述化合物在2-链HGF存在下抑制 目的活性的能力提示所述化合物可能为活化的HGF p链的拮抗剂，该性质 可进一步通过测定其与活化的HGF P链而不是HGF a链(例如，如2-链 HGF或单链HGF中所见)特异性结合或反应的能力来确定。
可能的拮抗剂的更具体的实例包括与活化的HGF卩链和/或其在c-met 上的结合位点结合的寡核苷酸(其可为适体)，具体地，抗体包括但不限于， 多克隆和单克隆抗体，抗体片段，单链抗体，抗独特型抗体，所述抗体或 片段的嵌合或人源化版本，以及人抗体和抗体片段。可选，可能的拮抗剂 可为紧密相关的蛋白质，例如突变形式的HGFP链，其识别HGFP链结 合配偶体，但不显示任何效果，由此竟争性抑制野生型HGF(3链的作用。
潜在的拮抗剂包括与HGF p链活性位点结合的分子，c-met上活化的 HGF卩链的结合位点，或活化的HGF卩链的其它相关结合位点，由此阻断 活化的HGF J3链的正常生物活性。小分子实例包括但不限于，小肽或肽样 分子，优选可溶肽，以及合成非肽基有机或无机化合物。
这些小分子可通过上述任何一或多种筛选测定法和/或本领域已知的任 何其它篩选技术鉴定。如上所述，本发明的物质/分子可以是肽。获得所述肽的方法是本领域 已知的，包括筛选肽文库中与适宜靶抗原的结合物。 一个实施方案中，适宜
靶抗原可包括活化的HGF p链(或其包含c-met结合位点的部分)，其在本文 详细描述。例如，适宜耙抗原是如上所述的活化的HGF p链多肽，或2-链 HGF多肽(其如上所述，包含活化的HGF卩链组分)。 一些情况中，具体地 在所需物质/分子与活化的HGF p链而不是HGF a链和/或酶原-形式的 HGF p链以任何明显程度结合的情况下，也可筛选候选结合物缺乏与包含 酶原形式的HGF卩链(即，未活化的HGF卩链)(例如，单链HGF)的多肽的实 质性结合能力。肽文库是本领域已知的，并可根据本领域技术制备。见例 如，Clark et al.,美国专利6,121,416。融合于异源蛋白质组分，诸如噬菌体外 壳蛋白质，是本领域已知的，例如，Clark etal.所述，见上文。 一个实施方案 中，能阻断活化的HGF p链与c-met结合的肽包含氨基酸序列 VDWVCFRDLGCDWEL,或其变体。第一肽结合物的变体可通过筛选所述 肽的突变体以获得目的特征(例如，增强的靶结合亲和力，增强的药物动 力学，降低的毒性，改善治疗指数，等)来产生。诱变技术是本领域已知 的。此外，扫描诱变技术(诸如基于丙氨酸扫描的那些)对于评估肽中的单个 氨基酸残基的结构和/或功能重要性尤其重要。
测定本发明候选物质/分子，诸如包含氨基酸序列 VDWVCFRDLGCDWEL的肽或其变体，调节HGF/c-met信号和/或与所述 信号相关的生物活性的能力，可通过在体外或体内测定法中^r测所述物质/ 分子的调节能力来进行，所述测定法是本领域已知的，例如，如上文Okigaki et al所述；Matsumoto et al.如上所述；Date et al.， FEBS Let. (1997)， 420:1-6; Lokker et al.如上所述；Hartmann et al.如上所述。
抗-活化的HGF 13链抗体
本发明还提供包括利用抗-活化的HGF(3链抗体的方法。示例性抗体 包括多克隆，单克隆，人源化，双特异性，和异源偶联抗体。 1. 多克隆抗体
所述抗活化的HGF p链抗体可包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方 法本领域技术人员公知。多克隆抗体可在哺乳动物产生，例如通过一或多 次注射致免疫剂，如果需要的话，注射佐剂。通常，免疫制剂和/或佐剂可 以多次皮下或腹膜内方式注射到哺乳动物中。致免疫剂可包括活化的HGF |3链(或其部分)或其融合蛋白。可将所述致免疫剂与已知对被免疫动物有 免疫原性的蛋白偶联。这些免疫原性蛋白的实例包括但不限于匙孔血蓝蛋
白(keyhole limpet hemocyanin)，血清白蛋白，牛曱状I^J求蛋白，和大豆月夷蛋 白酶抑制剂。可用的佐剂实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷脂 (monophosphoryl Lipid) A或合成的trehalose dicorynomycolate)。本领域技术 人员不需要作很多实验即可选择免疫接种方案。
2.单克隆抗体
抗-活化的HGF(3链抗体可选为单克隆抗体。单克隆抗体可利用杂交 瘤法制备，诸如Kohler and Milstein, Nature, 2^:495 (1975)所述那些。在杂交 瘤法中，小鼠，仓鼠或其它适宜宿主动物，通常用免疫剂进行免疫以激发 产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合免疫剂。可选， 所述淋巴细胞可在体外免疫。
致免疫剂通常包括活化的HGF |3链(或其一部分)或者其融合蛋白。通 常，如果需要人源细胞就用外周血淋巴细胞("PBL，，)，如果需要非人哺乳动 物来源就用脾细胞或淋巴结细胞。然后用合适的融合剂如聚乙二醇，将淋 巴细胞与无限增殖的细胞系融合，来形成杂交瘤细月包。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103。无限增殖的细胞系通常为经过转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类 动物、牛、和人类来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。 可在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，该培养基优选含有一或多种抑制未 融合的无限增殖细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄 噪呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常会包括 次黄。票呤，氨基蝶呤和胸苷("HAT培养基")，这些物质阻止HGPRT-缺陷型 细胞的生长。
优选的无限增殖细胞系是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以 稳定的高水平产生抗体、并对诸如HAT等培养基敏感的细胞。更优选无限 增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，它们可以从，例如Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California和美国典型培养物j呆藏中心(the American Type Culture Collection), Manassas, Virginia获得。也有报道称，人骨髓瘤以及小 鼠-人异质性骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体[Kozbor， J. Immunol.,133:3001 (1984): Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。
然后，可以检测培养杂交瘤细胞的培养基中抗活化的HGF卩M:的单克 隆抗体的存在。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性优选通过免 疫沉淀或体外结合试验来测定，所述试验如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫 吸附试验(ELISA)。这类技术和试验是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲 和力可以，例如用Munson and Pollard, Anal. Biochem.,巡:220 (1980)的 Scatchard分析来确定。
在鉴定出所需杂交瘤细胞后，将这些克隆用有限稀释法进行再克隆并 用标准方法使其生长[Goding，见上文]。适于此目的的培养基包括，例如， Dulbecco's改良Eagle's培养基或RPMI-1640培养基。可选地，杂交瘤细胞 可以以哺乳动物腹水的形式在体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养基或腹水液，用常用的免疫球蛋白 纯化方法如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层 析来分离或纯化。
也可用重组DNA方法制备单克隆抗体，所述方法如美国专利4，816，567 所述。可用传统方法容易地分离并测序编码本发明单克隆抗体的DNA(例 如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苦酸探 针)。本发明的杂交瘤细胞可作为所述DNA的优选来源。所述DNA在分离 后可被置入表达载体中，然后转染到宿主细胞(如猿猴COS细胞、中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，来在重组宿主 细胞中合成单克隆抗体。也可以修饰DNA,例如，通过用人重链和轻链恒 定区的编码序列取代同源鼠序列(美国专利4,816,567; Morrison等，见上文)， 或通过将免疫球蛋白编码序列与全部或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列 共价连接。所述的非免疫球蛋白多肽可以被本发明抗体的恒定区取代，或 被本发明抗体的 一个抗原结合位点的可变区取代，来制备嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法本领域已知。例如， 一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。所述重链通常在Fc 区的任意点被截短，从而避免重链的交联。或者，相关的半胱氨酸残基被 其他的氨基酸残基取代或者缺失，从而避免交联。体外方法也适合制备单价抗体。可以用本领域已知技术来消化抗体以
制备其片段，尤其是Fab片段。
抗体也可通过筛选与(或其等同物)以适宜的/所需的亲和力结合的抗体 或抗体片段的噬菌体展示文库来产生。所述技术在本领域已知，例如在美 国专利5,750,373; 5,780,279; 5，821,047;6，040，136; 5,427,908; 5，580，717，以及 本文引用的对比文件中公开。
3.人抗体和人源化抗体
抗-活化的HGFP链抗体还可包含人源化抗体或人抗体。非人(例如，鼠) 抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白，免疫球蛋白链，或其片段(如Fv， Fab, Fab', F(ab')2，或者抗体的其他抗原结合亚序列)，其包含源自非人免疫 球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受者的抗体)，其中来 自接受者CDR的残基被具有所需的特异性、亲和性和能力的来自非人物种 (供者的抗体)如小鼠、大鼠、或兔的CDR的残基所取代。有些情况下，人 免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体也可包含既 不在接受者抗体也不在引进的(imported)CDR或框架序列中发现的残基。通 常，人源化抗体会包含可变区中的至少一个可变区，通常为两个可变区中 的基本上所有的，其中所有的或基本所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白 的CDR区，并且所有的或基本所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR 区。人源化抗体优选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人 免疫球蛋白恒定区的至少一部分。Jones等，Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等，Nature, 332: 323-329 (1988); Presta， Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
本领域已知将非人抗体人源化的方法。通常，人源化抗体具有一或多 个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为"引进的，， 残基，它们常来自"引进的，，可变区。人源化基本可根据Winter及合作者的 方法进行(Jones等，Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等，Nature, 332: 323-327(1988); Verhoeyen等，Science, 239: 1534-1536(1988))，该方法用啮 齿类动物的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。由此，这些"人源化 "的抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的一部分基 本被来自非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基 取代。
人抗体也可用本领域已知的多种技术制备，包括噬菌体展示文库。 Hoogenboom和Winter,丄Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks等，J. Mol. Biol., 222: (1991)。 Cole等和Boemer等的技术对于制备人的单克隆抗体也可 用。Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， p. 77 (1985)和Boemer等，J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)。或者，可通过将人 免疫球蛋白基因座引入转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物如，内 源性免疫球蛋白基因已经被部分或全部灭活的小鼠。攻击后，可观察到人 抗体的产生在所有方面极其类似在人中所见，包括基因重排，组装 (assembly),以及抗体的所有组成成分(repertoire)。对此方法的描述见例如， 美国专利5,545,807; 5，545，806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425和5,661,016， 以及如下的科技出版物Marks等，Bio/Technology,边779-783 (1992); Lonberg等，Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild等，Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Hev. Immunol., U: 65-93 (1995)。
利用上述已知的选择和/或诱变方法，所述抗体可为亲和力成熟的。优 选的亲和力成熟的抗体具有的亲和力比由其制备成熟抗体的起始抗体(通 常为鼠的，人源化的或人的)的亲和力高5倍，更优选10倍，更优选20 或30倍。
4.双特异性抗体
体(优选人抗体或人源化抗体)。在本发明中， 一种结合特异性是针对活化的 HGF p链和/或HGF |3链c -met结合位点，另 一种结合特异性是针对任何 其它抗原，优选针对细胞表面的蛋白质或受体或受体亚基。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的 重组制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条重链具 有不同特异性。Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)。由于免疫5求 蛋白重链和轻4连随才几分配(random assortment)， 这些杂交瘤(四交瘤 (quadroma))产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有
77正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来进
行。类似的方法见WO 93/08829(1993年5月13日公开)和Traunecker等， EMBOJ. 10, 3655-3659 (1991)。
可以将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫 球蛋白恒定区序列融合。该融合是与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一 部分的免疫球蛋白重链恒定区的融合。优选使含有轻链结合所需位点的第 一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合物中。可将编码免疫球蛋白重链 融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共 转染至适当宿主生物。更多制备双特异性抗体的细节见例如，Suresh等， Methods in Enzvmologv, 121: 210 (1986)。
根据WO 96/27011所述的另一方法，抗体分子对之间的界面可被改造 以最大化自重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比。优选的界面包括 至少抗体恒定区的CH3区的一部分。该方法中，来自第一抗体分子界面的 一或多个小氨基酸侧链用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。与大 侧链相同或相似大小的补偿性"空腔"通过用较小的侧链(例如丙氨酸或 苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来产生。这提供了增加异源二聚体相对于其 它不需要的终末产物诸如同源二聚体的产量的机制。
双特异性抗体可作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab，)2双特异性抗体) 制备。从抗体片段产生双特异性抗体的技术已经在文献中描述。例如，双特 异性抗体可利用化学连接来制备。Brennan "a/.. Science 229:81 (1985)描述 了一种方法，其中完整抗体经蛋白水解产生F(ab，)2片段。这些片段在双疏 醇复合剂亚砷酸钠存在下被还原以稳定邻接的双硫醇，并防止分子间二硫 化物形成。产生的Fab，片段随后转化成thionitrobenzoate (TNB)衍生物。 一种Fab，-TNB衍生物通过用巯基乙胺还原-故转化成Fab，-琉醇并与等摩尔 量的其它Fab，-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。生成的双特异性抗体 可用作选择性固定酶的试剂。
Fab，片段可直接从大肠杆菌收获并化学偶联以形成双特异性抗体。 Shalaby W a/., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)描述了完全人源化双特异性抗 体F(ab，)2分子的制备。每个Fab，片段分离地从大J^f漭分泌并在体外进 行定向化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞以及正常人T细胞，以及激发人细胞毒淋巴细胞 对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。
已经描述了将从重组细胞培养物直接制备并分离双特异性抗体片段的 很多技术。例如，已经用亮氨酸拉链制备了双特异性抗体。Kostelny等，J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的 亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体的同型二聚体在铰链区 被还原以形成单体，然后再^^氧化形成抗体的异型二聚体。该方法也可用 于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 90:6444-6448 (1993)描述的"二价抗体"技术，已经提供了制备双特异性抗体 片段的可选机制。所述片段包含通过接头与VL连接的VH，此接头很短所 以不能在相同链的两个结构域之间成对。因此， 一个片段的VH和VL结构 域需要与另一片段的互补的VL和VH结构域成对，/人而形成两个抗原结合 位点。也报道了用单链Fv (sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的其他策略。 见Gmber等，J. Immunol., 152:5368 (1994)。
本发明包括两价以上的抗体。例如，可制备具有三种特异性的抗体。 Tutt等，J. Immunol. 147: 60 (1991)。
示例性双特异性抗体可结合活化的HGF |3链上的两种不同表位或活化 的HGF (3链上的表位以及另 一多肽(例如，c-met或HGF a链)上的表位。
5. 异源偶联抗体
异源偶联抗体也包含在本发明范围内。异源偶联抗体由两个共价连接 的抗体组成。此种抗体据称例如可以使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美 国专利4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360和WO 92/200373; EP 03089)。所述抗体可用合成蛋白质化学的已知方法，包括涉及交联剂的那些 方法来体外制备。例如，免疫毒素可用二石克化物互换反应或通过形成辟b醚 键来构建。适宜的试剂例如包括亚胺硫醇(iminothiolate)和曱基-4-巯基丁酰 亚胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和如美国专利4,676,980所7}开的那些。
6. 效应子功能改造
就效应子功能而言，理想的是修饰本发明的抗体从而提高，例如抗体 治疗癌症的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在此区域形 成链内二硫键。由此产生的同型二聚体抗体具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤作用和抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用
(ADCC)。见Caron等，J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992)和Shopes， L Immunol.,巡2918-2922 (1992)。具有增强的抗肺瘤活性的同型二聚体抗体 也可用异双功能交联剂(heterobifonctional cross-linkers)来制备，如Wolff等， Cancer Research, 2: 2560-2565 (1993)所述。或者，可通过改造得到具有双 Fc区，因而具有增强的补体裂解作用和ADCC能力的抗体。见Stevenson 等，Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)。
7.免疫偶联物
本发明也包含免疫偶联物，其包含与细胞毒剂偶联的抗体，所述细胞 毒剂如化疗剂，毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素， 或其片段)，或放射性同位素(即放射性偶联物)。
上面已描述了用于产生这些免疫偶联物的化疗剂。可用的酶活性毒素 及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合的活性片段、外毒素A链(来 自铜绿菌，I单月包菌(i^e"(io附o"as flerwg/"oj")、 荒麻毒蛋白(ricin)A链、相思 豆毒蛋白(abrin)A《连、蒴莲才艮毒素(modeccin)A链、a画八叠^求菌(sarcin)、油 4同(/i/ewn.tesybraf")蛋白质、石冲亇素(dianthin)蛋白质、PA;vfo/aca amen'ca"a蛋 白质(PAPI、 PAPII和PAP-S)、 momordica chamntia抑制物、麻风树毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋白(crotin)、 sapaonaria officinalis 4中制净勿、白树毒蛋白 (gelonin)、 mitogellin、局P艮曲菌素(restrictocin)、 酚霉素(phenomycin)、 j尹i若 霉素(enomycin)及tricothecenes。可用多种放射性核素来制备》文射性偶联抗 体。例子包括212Bi、 131I、 131In、 90y和^Re。用多种双功能蛋白偶联剂来 制备抗体和细胞毒剂的偶联物，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺 -3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(8 0 )， iminothiolane (IT),亚氨酸酯的双功能衍 生物(如二曱基己二酰亚胺盐酸酯(dimethyl adipimidate HCL))，活性酯类(如 双琥珀酰亚胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate)),醛类(如戊二醛)，双叠氮 化合物(如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl) hexanediamine))、 双偶氮镥(bis-diazonium)衍生物(如双(对-偶氮镜苯曱酰基)-乙二胺 (bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))， 二异氰酸酉旨(如曱苯2,6-二异氰 酸酯(tolyene 2,6-diisocyanate))，及双活性氟(bis-active fluorine)化合物(如1,5-
80二氟-2,4-二硝基苯(1 ，5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))。例如，可如Vitetta等， Science, 238: 1098 (1987)所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。使放射性核苷酸与 抗体偶联的螯合剂例如碳-14-标记的3-曱基二亚乙基三胺戊乙酸1-异硫氰 酸千酉旨(l-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid, MX-DTPA)。见W094/11026。
另一实施方案中，抗体可与"受体"(如链霉亲合素)偶联来用于预先靶向 肿瘤，其中将抗体-受体偶联物给药病人，之后用清除剂从循环中除去未结 合的偶联物，再给药与细胞毒性剂(例如力文射性核苷酸)偶联的"配体"(例如亲 合素)。
8. 免疫脂质体
本文所述抗体也可配制成为免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体用本 领域已知方法制备，如Epstein等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 3688 (1985); Hwang等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 22: 4030 (1980);和美国专利4，485，045 和4,544,545所述。循环时间延长的脂质体见美国专利5,013,556的7>开。
特别有用的脂质体可通过反相蒸发方法用包含卵磷脂、胆固醇、和从 PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物来制备。通过限定孔径的 滤膜挤压出脂质体，来产生具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab'片段 可通过二硫化物互换反应与脂质体偶联，如Martin等，J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)所述。化疗剂(如阿霉素(Doxorubicin))可选被包含在脂质体 中。见Gabizon等，J. National Cancer Inst, 8109): 1484 (1989)。
9. 抗体的药物组合物
上文公开的筛选方法鉴定的抗体以及其它分子，可以用药物组合物的 形式给药，用来治疗多种疾病。
如果利用完整抗体作为抑制物，抗体优选^皮内化。然而，Lipofectin或 脂质体可用于将本发明的多肽、核酸分子、抗体、拮抗剂或组合物传递到 细胞。当使用抗体片段时，优选使用最小抑制性片段。例如，基于抗体的 可变区序列，可设计仍保持与靶蛋白质序列的结合能力的肽分子。这些肽 可用化学方法合成和/或用重组DNA技术制备。见例如，Marasco等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)。本文的配制剂也可包含对所治疗的具体适应症必要的 一种以上的活性化合物，优选那些活性互补且;f皮此不 负向影响的化合物。或者，或另外，所述组合物可包含提高其功能的物质， 如细胞毒性剂、化疗剂、或生长抑制剂。这些分子适合以对所需目的有效 的量来联合存在。
也可将活性成分捕获在微胶嚢中，所述微胶嚢例如，通过凝聚技术或 界面聚合作用来制备，例子分别有羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚-(异丁烯 酸曱酯)(poly-(methylmethacylate))微胶嚢，其容纳在胶体性质的药物运送系 统(如脂质体，白蛋白小球体，微乳剂，纳米颗粒及纳米胶嚢)中，或者容纳 在大乳剂(macroemulsions)中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Scisnc6s,见上文0
用于体内给药的配制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻 易实现。
也可制备缓释制剂。緩释制剂的适当实例包括含有抗体的固态疏水聚 合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶嚢。 緩释基质实例包括，聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯 醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、 L-谷氨酸与Y乙基-L-谷氨酸的共聚物、不 可降解的乙烯乙烯乙酯(ethylene-vinylacetate)、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚 物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸乙酸酯 (lenprolideacetate)組成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。聚合 物如乙烯-乙烯乙酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水 凝胶释放蛋白的时间较短。当胶嚢化的(encapsulated)蛋白质在生物体保留长 时间，在37。C接触湿气可使它们变性或聚集，导致生物活性的丧失并可能 导致免疫原性改变。根据涉及的机制，可设计合理的策略来使蛋白质稳定 化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换而形成的分子间S-S 键，可通过修饰巯基残基，从酸性溶液冻干，控制湿度含量，使用合适的 添加剂，并开发特定的聚合物基质组合物，来实现稳定化。
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解根据上述总体描述，可 实施各种其它实施方案。
实施例
才才泮牛&方法辦
含有C-末端His6标记的成熟形式的Met ECD (Glu25-Gln929)结构域在 昆虫细胞中表达，并通过Ni-NTA金属螯合物以及凝胶过滤利用上述标准方 案纯化。Met-IgG融合蛋白质如上所述获得(Marketal.， 1992)。
i/GF^ f冷^^^这和^化
HGF p蛋白质利用杆状病毒分泌载体pAcGP67 (BD Biosciences, Pharmingen， San Diego， CA)在昆虫细胞中表达，其含有信号序列用于将产物 分泌如培养基。所有构建体含有羧基末端His6标记，并通过NiNTA金属 螯合物和凝胶过滤层析纯化至均质(>95%纯度)。对于野生型HGF J3,编码 HGF卩-链的残基Va1495 [cl6] - Ser728 [c250]的cDNA片段通过PCR克隆使 得Val495 [cl6]被插入紧邻分泌信号序列后处。定点诱变利用QuikChange (Stratagene, La Jolla， CA) 以 及 寡 核 芬 酸 5'CCTAATTATGGATCCACAATTCCTG3，进行以制备含有Cys604 [cl28]到 Ser突变(HGF(3)的HGFP，以避免蛋白酶样结构域中暴露的非配对Cys的 潜在的复杂化。HGF (3突变体Y513A [c36], R516A [c39]， Q534A [c57], D578A [cl02], Y619A [cl43],Y673A [cl95], V692A [c214], P693D [c215], G694E [c216], R695A [c217], G696A [c219], I699A [c221a]和R702A [c224]如 上述在HGF卩构建体(具有C604S突变)中制备。HGFP突变体C561S [c78] (即，C561S:C604S)如上所述在HGF |3构建体中制备以消除两个游离的半胱 胺酸残基。原HGF卩编码HGF的残基Asn479 - Ser728并具有利用寡核苷 酸 5'CAAAACGAAACAATTGGAAGTTGTAAATGGGATTC 3，产生的 R494E突变。半胱胺酸不在该构建体中改变以允许Cys487与Cys604之间 推定的二硫化物形成。氨基酸位置编号如下全长HGF序列[糜蛋白酶原编号]。
含有所需插入物的杆状病毒载体经由Baculogold 表达系统根据生产 商的说明(BD Biosciences Pharmingen, San Diego， CA)转染入板上TNM-FH 培养基中的Spo(io;7fera/n^:perab (Sf 9)细胞。2-4轮病毒扩增之后，用10 ml 病毒母液感染1 1 High Five 细胞(Invitrogen， San Diego， CA)，所述细胞为 在TNM-FH培养基中的5xl05细胞s/ml的悬液。培养物在27 °C保温72 h 然后通过在8,000 x g离心15 min收获所述培养基。将细胞培养基加样于4 ml Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen， Valencia, CA)。用4倍柱体积的50 mM Tris'HCl，pH 8.0, 500 mM NaCl， 5 mM咪哇洗涤后，HGF (3蛋白质用50 mM Tris.HCl pH 8.0， 500 mM NaCl， 500 mM咪唑洗脱。收集洗脱物，并加4羊于 SuperdexTM-200柱(Amersham Biosciences, Piscataway， NJ)，所述柱在10 mM HEPES pH 7.2, 150 mM NaCl， 5 mM CaCl2中平衡。收集蛋白质峰并利用 Centriprep YM-10 (Millipore, Bedford, MA)浓缩。级分用考马斯蓝染色的 12。/。SDS-PAGE分析。所有突变通过DNA测序以及质语法分析。蛋白质浓 度通过定量氨基酸分析测定。N-末端测序显示原HGF P和HGF p存在单个 正确N-末端。纯化的蛋白质在SDS-PAGE上显示正确的分子量；观察到多 个条带很可能是由于异源糖基化，与质镨数据一致，分子量为比从该序列 预测的高 2kDa。
全长M7F蛋冷^的游建，4迷和^化
重组蛋白质在1 1中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物中通过瞬时转染制 备(Peek et al.， 2002)。氨基酸改变通过定点诱变引入(Kunkel, 1985)并通过 DNA测序证实。表达培养基(F-12/Dulbecco，s改良的Eagle培养基)含有1% (v/v)超低IgG胎牛血清(FBS)(Gibco， Grand Island, NY)。 8天后，收获培养 基并补充FBS至最终含量为5-10%(v/v)。在37。C另外保温2-3天导致完 全的单-链HGF转化。该步骤被去除以表达原HGF这种未切割的单链形式， 其具有位于活化切割位点(R494E)和a-链中的蛋白酶-易感位点(R424A)的氨 基酸改变(Peek et al., 2002)。突变体蛋白质通过HiTrap-琼脂糖SP阳离子交 才奐层才斤(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)长口声斤述(Peek et al.， 2002)自培 养基纯化。通过SDS-PAGE(4-20。/。梯度凝胶)在还原条件下检测并用Simply BlueSafestain染色显示，除了原HGF保持单链形式以外，所有突变体HGF 蛋白质纯度>95%，并完全转化成a/p-异源二聚体。每种突变体的蛋白质浓 度通过定量氨基酸分子测定。
遞it^面應l思共凝两;Ci/GFA和
HGF卩对Met的结合亲和力通过表面胞质团共振利用Biacore 3000装置 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ)测定。Met ECD结构域利用胺偶联在 2000共 振单位根据生产商说明固定在CM5芯片上。10 mM HEPES pH 7.2, 150 mM NaCl， 5 mM CaCl2中浓度为12.5 nM-100 nM的系列浓度的HGF卩(即， C^(MS突变体)以流速20(il/min注入40s。结合的HGF(3被允许解离10min。进行适宜的背景减除。结合(k。J和解离(k。ff)速率常熟通过该装置提供的整体 拟合程序获得；ko^kon比率用于计算解离常数(Kd)。
//Gi^与M" ^潜合AX^^爭潜合五丄ZSv4
微量滴定板(Nunc, Roskilde, Denmark)在4。C用2|ig/ml兔抗-人IgG Fc 特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA)在50 mM 碳酸钠緩沖液，pH 9.6中包被过夜。用1% BSA的HBS緩沖液(50 mM HEPES pH 7.2, 150 mM NaCl， 5 mM CaClz和0.1% Tween-20)封闭后，加入ljxg/ml Met-IgG融合蛋白质(Marketal., 1992)并将板在室温轻摇下保温lh。用HBS 緩冲液洗涤后，加入HGF卩蛋白质lh。结合的HGF p用抗-His-HRP (Qiagen, Valencia, CA)保温然后加入TMB/H202底物(KPL， Gaithersburg, MD)。所述 反应用1M H3P04终止，并在Molecular Devices SpectraMax Plus384微量读板 仪上测定A45()。产生半数最大结合(EC5o)的有效浓度通过四参数拟合利用 Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA)观'J定。
为开发竟争ELISA，野生型HGF卩用20倍摩尔过量的生物素马来酰亚 胺(Pierce, Rockford,IL)在室温生物素化2 h。如上处理微量滴定板，但利用 HRP-neutravidin (Pierce, Rockford， IL)生物素化的野生型HGF卩并4全测。竟 争试验包括250nM生物素化的野生型HGF p和所述各种浓度的蛋白质(例 如，未标记的HGF |3变体，HGF (即，2-链)或原HGF (即，单链形式的HGF))。 在室温保温l h后，板上结合的生物素化的野生型HGF p的量如上所述测 定。IC5o值通过将数据拟合于四参数等式(Kaleidagraph, Synergy Software, Reading, PA)测定。
//GF ^ir谬力M&的潜合
生物素化的HGF利用Sigma immunoprobe生物素化试剂盒(Sigma, St Louis, MO)制备。微量滴定板用兔抗-人IgG Fc特异性抗体如上述进行包被。 板在PBS 0.05。/。(v/v)Tween-20中洗涤然后与0.5% (w/v) BSA， 0.05% Tween-20 的PBS溶液，pH 7.4在室温保温1 h。洗涤后，1 nM生物素化的HGF和0.2 nM Met-IgG融合蛋白质(Marketal.， 1992)以及各种浓度的HGF突变体，野生 型HGF(3被加入孔中并保温2h。洗涤后，结合的生物素化的HGF通过加入稀 释的(1:3000)链霉抗生物素辣根过氧化物酶偶联物(Zymed， South San Francisco, CA)然后加入SureBlue TMB过氧化物酶底物和终止溶液TMB STOP (KPL, Gaithersburg, MD)来检测。如上所述测定八450并测定1<:50值。相
85对结合亲和力表达为ICso(突变体)/IC5()(野生型HGF)。 的i/GF-该務扭4f凝化
蛋白激酶受体活化测定法(KIRA)如下进行。肺癌A549细胞(CCL-185, ATCC， Manassas, VA)满底培养物(以前保持在生长培养基(Ham's F12/DMEM 50:50 (Gibco， Grand Island, NY)含有10% FBS(Sigma， St Louis, MO)中)，利用Accutase(ICN, Aurora, OH)分离并以50,000细胞每孔的密度 接种于96孔板中。在37。C保温过夜后，去除生长培养基并使细胞在含有 0.1% FBS的培养基中血清饥俄30 - 60 min。 HGF或HGF哭变体的Met碌 酸化活性通过将500-0.2 ng/ml的连续稀释物在含有0.1% FBS的培养基中 然后在37°C保温10 min测定，去除培养基并用补充了 IX蛋白酶抑制物 cocktail set I (Cat #539131, Calbiochem, San Diego, CA)的IX细胞裂解li冲 液(Cat. #9803,细胞信号Technologies, Beverly, MA)裂解细胞。HGF P-链类 似地进行，起始浓度5 |iig/ml。 HGF(3-链对HGF依赖性Met磷酸化活性的 抑制通过将156-0.06 nM的连续稀释物加入测定板然后在37°C保温15min 测定，加入12.5， 25或50 nM的HGF，另外在37°C保温10 min,如上所述 去除培养基和细胞裂解。经由电化学荧光测定法利用Bio VerisM-Series装 置(Bio Veris Corporation, Gaithersburg, MD),分析细胞裂解物的磷酸化的 Met。抗磷酸酪氨酸mAb 4G10 (Upstate, Lake Placid, MY)用BV-TAG经由 NHS-脂化学根据生产商说明(Bio Veris)标记。抗-Met ECD mAb 1928 (Genentech， South San Francisco, CA)利用生物素X國NHS (Research Organics， Cleveland, OH)生物素化。BV-TAG-标记的4G10和生物素化的抗-Met mAb 在测定緩沖液(PBS, 0.5% Tween-10, 0.5% BSA)中稀释，并将混合物加入细 胞裂解物。室温剧烈震摇下保温1.5-2 h后，加入链霉抗生物素石兹性珠 (Dynabeads, Bio Veris)并保温45 min。具有结合的物质(抗-Met抗体/Met/抗-磷酸酪氨酸抗体)的珠通过外部加入的磁铁被捕获。洗涤步骤后，光源产生 的化学荧光信号在Bio Veris装置上测定为相对荧光单位。对于每个试验， HGF突变体诱导的Met磷酸化表示为用2-链HGF获得的最大信号的百 分比。
增遂縱法
BxPC3 (人胰腺腺癌；ECACC No. 93120816)获自European Collection of Cell Cultures (CAMR Centre for Applied Microbiology and Research, PortonDown, Salisbury, Wiltshire (UK)并用于HGF-依赖性增殖测定法。细胞在 RPMI培养基中生长，所述培养基含有10% FCS (Sigma F-6178, St. Louis, MO)， 10 mM HEPES, 2 mM谷氨酰胺，IX青霉素-链霉素(Invitrogen 15140醫122，Carlsbad, CA)， IOOX青霉素10000 |ag/ml-链霉素10000吗/ml), 和G418 (Invitrogen 10131-035)250pg/ml。所述细胞用PBS，含有10 mM EDTAPBS依次洗涤，并利用胰蛋白酶去除。将细胞收获入含血清培养基， 并利用血细胞计数仪测定细胞密度。50000-75000/ml的细胞以200 pi每孑L 4妄种于白底MT板(Cultur Plate 6005680 Packard/PerkinElmer, Boston, MA)，其中仅仅利用内侧60孔并允许生长24h。回收培养基，细胞用PBS 以及含有0.1。/。BSA(SF-BSA)的200jil无血清培养基洗涤，加回到细胞中。 所述细胞再生长24h。去除培养基并将各种受试HGF蛋白质(n-4)的 SF-BSA溶液加入孔中。利用终浓度l nM的2-链HGF用于抑制测定。对 照在缺乏HGF和/或缺乏受试HGF蛋白质的条件下进行。
允许细胞生长72 h然后利用细胞Titer-Glo Luminescent试剂盒(Promega G7571 ， Madison, WI)测定。随后的方法在Promega Technical Bulletin TB288 中描述。樣i量滴定板在TropixTR717微量滴定板荧光计(Berthold 75323 Bad Wildbad, Germany)上读数。刺激或抑制细胞增殖的百分比相对于适宜对照标 准化。
勿應if移W;t法
乳腺癌细胞s MDA-MB-435 (HTB-129， ATCC， Manassas, VA)培养在推 荐的补充了血清的培养基中。满底的细胞在含有10 mM EDTA的PBS中解离 并用无血清培养基稀释到终浓度0.6-0.8 x 105细胞/ml。将0.2 ml该悬液 (1.2-1.6 x 105总细胞)一式三份加入24跨孔板(8 iim孔径)(HTS Multiwell Insert System, Falcon, Franklin Lakes, NJ)的上方小室中，所述板与IO pg/ml 大鼠尾I型胶原(Upstate，LakePlacid，NY)预保温。将野生型HGF或HGF突 变体以IOO ng/ml加入下方小室的无血清培养基中，除非另有说明。HGF P-链也在30吗/ml检测。保温13-14h后，去除膜顶部的细胞并将迁移到基底侧 的那些细胞在4%多聚曱醛中固定然后用0.5%结晶紫溶液染色。洗涤并风干 后，在10%醋酸中溶解，在MolecularDevices微量滴定板读板仪上测定八560。 HGF突变体的促迁移活性表示为减去缺乏JGF情况下的背景迁移后HGF对 照的百分比。染色的细胞的照片利用连接于Leitz显微镜(Leica Mikroskope &Systeme GmbH, Wetzlar, Germany)的Spot数字相机(Diagnostics Instruments, Inc., Sterling Heights, MI)获取。照片利用Adobe Photoshop 4.0.1 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA)获得。 结果
//GF々与MW ^潜合
HGF |3与Met结合从利用表面胞质团共振在CM5芯片上测定的共振单 位改变评估，其利用Met的细胞外结构域(MetECD)衍生化。结果显示HGF |3以Kd 87 nM结合Met ECD,所述IQ从相对较快的结合速率常数(kon = 1.18 x 105 M-1s-1)和解离速率常数(k。ff= 0.0103 s")计算(图1A)。类似的结果 获自与c-met Sema结构域的结合，其中算出的Kd为27 nM(数据未显示)。 HGF P与Met的结合也通过第二种独立方法利用^反ELISA"^正实。将生物素 化的HGF卩与结合于固定的抗-Fc抗体的方向适宜的Met-IgG融合物一同 保温并利用HRP-neutravidin检测后，测定ECs值为320 ± 140 nM (n = 6;数 据未示)。
由于单-链HGF以可比的亲和力结合双-链HGF,但不诱导Met磷酸化 (Lokker et al.， 1992; Hartmann et al.， 1992),我们设想这是由于卩-链的未切割 形式缺乏Met结合位点。为检测该假设，我们表达并纯化原HGF(3，HGF卩 的酶原-样形式，其含有HGF a-链的C-末端16残基以及切割位点的突变 (R494E)以保证单-链形式保持完整。HGF卩和原HGF(3与Met的结合利用 竟争结合ELISA测定，产生的ICso值分别为0.86±0.17和11.6± 1.8 pM(图 1B)。减弱13.5-倍的结合显示虽然酶原-样HGF (3上的Met结合位点的确存 在，其并非最佳的。原HGF卩结合亲和力的丧失也在图5中总结的翁:据中 显示。事实上，在其它轮的试验中，发现酶原-样&链与标记的p链结合c-Met 的能力的有效性低得多，其ICso为ca. 41一，比HGF卩链在该测定法中的 0.56^M高约75-倍，表明酶原-样HGF |3链与c-Met的结合明显降低(数据 未示)。因此，各种试验证实了酶原-样p链(原HGF (3)是次最佳Met配体。
i/G7^对活^的押斜
尽管HGF卩与Met结合，其不诱导Met磷酸化(图1C)。图IC显示HGF |3完全无活性，即使在超过全长HGF的最佳磷酸化活性浓度>1000-倍的情 况下。类似地，在MDA-MB-435细胞迁移测定法中，HGF |3在达0.95pM的 浓度没有效果。然而，HGF(3不以浓度依赖的方式抑制Met的HGF-依赖性磷酸化(图ID),虽然抑制在所用最高浓度时不完全。Met磷酸化的抑制与 同HGF直接竟争Met结合一致。与此一致的是，竟争结合试验显示HGFP 抑制全长HGF与Met结合(图IE),但是是在相当高的浓度(ICso = 830 ± 26 nM; n = 3)。作为比较的是，全长野生型HGF在该测定法中ICso值为0.86 ± 0.47nM(n = 3)。
i/(J尸^ //GF A户參^勿^if移一 凝化 为鉴定J3-链中的Met结合位点，我们系统性改变了对应活化区域的区 域中的残基，以及丝氨酸蛋白酶活性位点，本文称为HGF的"活化结构域 ，，和"活性位点区"。HGF突变体在CHO细胞中的初始表达产生了单链和 双联HGF形式，以突变体HGFI623A为例显示(图2A)。残余未切割的HGF 的完全转化通过另外将收获的培养基暴露于5-10%血清数天进行(图2A)。 HGF I623A通过阳离子交换层析纯化后的纯度代表所有HGF突变体(图 2A)。
突变HGF中|3-链残基的功能后果通过测定HGF突变体刺激 MDA-MB435细胞迁移的能力来评估。结果显示3种HGF突变体，R695A [c217]，G696A[c219]和Y673A [cl95]严重受损，具有低于野生型活性的20% 的活性，而5种突变体Q534A [c57]， D578A [cl02], V692A [c214], P693A [c215]和G694A[c216]具有野生型活性的20%-60%的活性(图2B)。另外一组 9个突变体(R514A，P537A, Y619A, T620A, G621A, K649A, 1699A，N701A 和R702A)具有野生型活性的60-80%的活性。其余21个突变体的活性野生 型活性的>80%并被认为基本上与HGF相同。如预期那样，原HGF不刺激 细胞迁移(图2B)。 1 nM R695A [c217]或G696A [c219]促进细胞迁移的能力 的增加显示在图2C,显示突变体存在时的迁移类似缺乏HGF时的基底迁 移。
为研究细胞迁移中的活性降低是否与降低的Met磷酸化相关，将HGF 突变体的亚组在蛋白激酶受体测定法(KIRA)中4企测。对于野生型HGF和 HGF突变体，最大Met磷酸化在0.63和1.25nM之间的浓度观察到(图3)。 突变体Y673A [cl95]， R695A [c217]和G696A [c219]的最大Met磷酸化低于 野生型的30%,与它们的最小或缺乏促迁移活性一致。突变体Q534A[c57]， D578A [cl02]和V692A [c214]在细胞迁移测定法中具有中间活性(30-60%);它们也具有中间水平的Met磷酸化，为野生型HGF的56%-83%。与其缺乏 细胞迁移活性一致，原HGF没有Met磷酸化活性(图3)。
"-链^f对/ZGF和/Z(7Fy -链与Mef錄合的参^
每种突变体与Met-IgG融合蛋白质的亲和力通过HGF竟争结合分析。 除了 K649A [cl73]和Y673A [cl95](均为ca. 4-倍更弱的结合)，所有(>30) HGF突变体具有与双-链HGF基本相同的结合亲和力(IC50 = 0.83 ± 0.32 nM; n = 30),通过它们的IC5o比例显示(IC5。mut/IC5 oWT),其为0.36 - 2.25 (图7)。 HGFY673A[cl95]和原HGF显示与HGF相比，前者与Met-IgG的 结合弱ca. 4-倍(图7)。(应注意虽然结合亲和力测定的绝对值在试验间不 同，结合亲和力的特异性突变的效应与野生型相比在多个试验之间是可重 复的)。我们还检测了在IO倍或50倍更高的浓度下，所选突变体的细胞迁 移活性；没有观察到促迁移活性增力口(图8)。因此，HGF突变体功能受损 不是由于与Met结合减弱，理由是浓度增加达50-倍没有补偿效应。
HGF突变体与Met结合的相关性较差以及HGF-依赖性细胞迁移或Met 磷酸化很可能是由于Met和HGFa-链的亲和力相对较高，其可掩盖任何由 于P-链所致的亲和力降低。因此，我们在HGF (3本身中进行选择突变以消 除任何a-链效应。HGF卩突变体Y513A [c36〗，R516A [c39]， Q534A [c57], D578A [cl02], Y619A [cl43]，Y673A [cl95], V692A [c214], P693D [c215]， G694E [c216], R695A [c217]， G696A [c219]， I699A [c221a]和R702A [c224] 在竟争ELISA中利用生物素化的HGF卩与Met-IgG的结合测定。检测HGF 卩突变体C561S [c78] (C604S:C561S )以评估无游离半胱氨酸突变体中的活 性。突变体在HGF PC604S [cl28]背景中产 生以避免纯化中任何潜在的二聚 体化，但该突变对与Met-IgG的结合没有影响。突变体的结合亲和力随后 相对于HGFJ3标准化，其IC50 0.55 ± 0.38 pM(n-16)。结果显示于图5。 这些选择的亚组图示在图4中。大多数突变体与Met的结合亲和力降低， 一些突变体-例如R695A [c217]和G696A [c219]-根本不竟争结合(见图 5)。我们现在发现全长双链HGF突变体的活性降低与同HGF P相应突变 体的结合降低之间的强相关性。发现一些突变体(例如R695A [c217], G696A [c219] and Y673A [cl95])，其迁移活性(如2-链全长HGF突变体) 损失最大，其Met结合(如HGF P突变体)的损失也最大。反之，迁移活性降低较少的突变体(例如Y619A [cl43]和I699A [c221a])在Met结合中的降 低也较小(低于10-倍)(图5)。因此，消除HGFa-链结合在该Met结合测定 法中的贡献揭示全长HGF突变体的迁移活性降低是由于HGF P-链与Met 受体的结合相互作用受损。
//GF ^的炎ir导趁潜合^^^遂活^舉錄以及对T7G^-^務遂勿^增遂 W賴賴
如图6A所示，HGF(3链突变体作为在BxPC3细胞中的增殖活化物而言 活性较低。图6A中的示例性突变体反应生长刺激活性降低的量级谦广泛。 注意HGF WT活性在25 ng/ml为100 ng/ml时的活性的83.6 ± 13.0 % (n = 12)。 ％活性指存在HGF或HGF突变体(100 ng/ml或25 ng/ml)时增殖的量 减去缺乏HGF时增殖的量。SD室标准偏差，n是独立测定的数目。
HGF |3链中的突变体也能在野生型HGF存在下作为细胞增殖抑制物 (图6B)。图6B中，相对活性指增殖测定法中的相对活性。％抑制可以多种 方法计算，其中两种在图6B中显示。％活性I指增殖的量，其相对于无 HGF (0%)和25 ng/ml HGF WT (100%)标准化。由此HGF R695A或HGF R424A:494E分别抑制79。/。或63。/。的HGF-依赖性细胞增殖活性。％活性II 指相对于5 pg/ml HGF R695A (0°/。)或HGF R424:R494E (0%)以及25 ng/ml HGF WT (100%)标准化的增殖的量。由此HGF R695A或HGF R424A:494E HGF分别抑制HGF-依赖性细胞增殖活性的68%或75%。注意到HGF WT 为25 ng/ml 2-链HGF; 2-链R695A和1-链R424A:494E为5 ng/ml。
//( F"链与oMW的潜合不錄被卓遂j9ro-ZfG^ f爭
我们的数据表明HGF卩链与c-Met结合，更具体地与c-Met的Sema 结构域结合。HGFa链也与c-Met结合并可能也与Sema结构域结合。我们 说明了这两条链的结合位点是否在c-Met上重叠。结果显示单链pro-HGF 具有完整a链和酶原-样(3链，在图9所示的浓度不与HGF卩链竟争结合 c-Met-IgG。然而，具有完整a链和活化的|3链的双链HGF以IC5o 19 nM竟 争，支持了 a和(3链结合c-Met上不同位点这一结论(图9)。竟争性ELISA 中的对照试验显示单链pro-HGF以ICso值12 nM与生物素化的双链HGF 竟争结合c-Met-IgG类似于双链HGF在6nM的ICso值(数据未示)。
讨论HGF在单链前体形式经蛋白水解转化为双链HGF时获得生物活(Naka et al" 1992; Hartmann et al" 1992; Lokker et al" 1992; Naldini et al. 1992)。基于 HGF与糜蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶具体是凝血酶原的结构相似性(Perona and Craik, 1995; Rawlings et al" 2002; Donate et al" 1994)，我们假设该活化 过程与HGFP-链中存在的结构改变相关。本文中提供了 "活化的"HGF卩-链含有位于对应糜蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶的底物/抑制物结合位点的区域 中的独特Met结合位点的"^正据。
i/GF与的潜合咖J，y^
利用纯化的HGF |3-链的结合研究显示，"活化"形式的HGF 卩(Val495-Ser728)与Met的结合亲和力比其前体形式原HGF P(Asn479-Ser728)高ca. 14-倍，这与Met结合位点的优化伴随单链HGF的 加工这一观点一致。提示Met结合位点包括在scHGF切割之后经历构象重 排的HGF区，即"活化结构域"。实际上，具有"活化结构域，，中的氨基 酸取代的HGF变体的功能分析导致鉴定了功能性Met结合位点。然而，促 迁移活性大大损失的HGF突变体(Q534A, D578A, Y673A， V692A, P693A， G694A， R695A， G696A和R702A),显示对Met的结合亲和力基本不变，但 除外Y673A (损失4-倍)，由于HGF亲和力由HGF a-链决定(Lokker et al., 1994; Okigaki et al., 1992)。与此一致，在增加HGF突变体浓度超过50-倍时， 降低的活性保持不变(图8)。因此，HGF突变体的活性降低被解释是HGFP-链与Met上的其特异性低亲和力结合位点的混乱的分子相互作用。作为支 持，我们发现在测定法中所选HGF突变体(2-链全长)与Met同相应HGF 卩突变体的结合减弱非常相关，所述测定法中消除了 HGF a-链对结合的贡 献。例如，HGFP突变体R695A[c217]，G696A[c219]和Y673A[c195]作 为全长突变体没有可检测的Met结合，与极大受损的生物功能相关。
与HGF |3结合与Met结合的相对低亲和力结合位点的数据一致，利用 固定的Met细胞外结构域表面胞质团共振试验显示HGF卩与Met结合的Kd 为ca,90nM。 Kd与1。5()值之间观察到的明显亲和力差异是由于4吏用不同 的测定法，例如较高ICso值反应与250 nM生物素化的HGF卩竟争结合Met 所需的HGFP浓度较高。
功能性Met结合位点集中在"催化三联体残基，，Gln534 [c57]，Asp578 [cl02], Tyr673 [cl95]和[c220]-环(残基Val692， Gly694, Arg695和Gly696)。我们所有的Ala取代不需要对除外Gly696的主要链构象进行大的改变。本文 中，507146°的phi/psi角以及非Gly残基的取代将导致[c220]环中的构象改 变，导致G696A突变体的活性降低。总之，这些残基与真正的丝氨酸蛋白 酶底物加工区域非常相似。这一发现与早期研究一致，其鉴定Y673和V692 是Met活化的重要残基(Lokker et al.， 1992)。在该研究中测定的HGF变体 Q534H的正常活性可反应Gln的功能由其相对接近的等排体His补偿。[c220]-环在糜蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶家族中非常重要性(Perona and Craik, 1994; Hedstrom, 2002)。扩展的经典底物和抑制物构象包括形成来自 [c214-c218]的形成主链相互作用的残基。该区域也被认为是凝血酶催化活性 的变构调节物(Di Cera et al., 1995)并作为与其抑制物hirudin的作用位点 (StubbsandBode， 1993)。此外，因子VIIa和凝血酶中对应HGF R695的残基 [c217]对于酶催化的底物加工(Tsiang et al., 1995; Dickinson et al.， 1996)是重 要的。此外，MSP中相应的残基R683 [c217]，在MSP P-链与其受体Ron 的高亲和力作用中起重要作用(Danilkovitch et al.， 1999)。 MSP R683 [c217] 是5个暴露于表面的精氨酸残基簇的一部分，据称其参与与Ron的高亲和 力结合(Miller and Leonard, 1998)。尽管只有R695 [c217]以及可能的K649 [cl73]在HGF中保守，这些残基都位于HGF J3-链的Met结合区域中，导致 我们预期MSP(3-链上的Ron结合位点高度同源。本文所述利用HGF Ala突变体得到的结果与以前的研究一致，其中 Tyr673 [cl95]和Val692 [c214]每个都被丝氨酸取代(Lokker et al,， 1991)。以前 的两个报道(Lokker et al.， 1991; Matsumoto et al., 1991)中测定HGF变体 Q534H [c57]的正常生物活性可反应Gin的功能由其相对接近的等排体His 代偿。然而，我们的结果与以前的研究不同，其显示HGF (3-链本身既不结 合Met也不抑制HGF与Met结合(Hartmann et al.， 1992; Matsumoto et al., 1998)。 一种情况中，HGF (3-链与我们的不同，其具有来自用弹性蛋白酶对 HGF的切割的额外的a-链残基，其可对Met结合其不良作用。然而，可 能在所用任意浓度下，所述测定法的敏感性或原HGF加工的程度不足以观 察与该低亲和力位点的结合(Matsumoto et al., 1998)。据报道HGF P-链与 Met结合，但是仅仅在来自a-链的NK4片段存在的情况下(Matsumoto et al.， 1998)。93原则上，两种Met结合位点在同一HGF分子中的存在- 一种为高亲和 力一种为亲和力的，可支持Met:HGF信号复合体的2: 1模型，类似于所述 Ron:MSP为2:1的模型(Miller and Leonard, 1998).。在相关的MSP/Ron配 体/受体系统中，MSP的单个a-和P-链(其缺乏信号活性)，可结合Ron并与 全长MSP竟争受体结合(Danilkovitch et al., 1999)。在HGF/Met系统中也如 此。然而，生物化学研究没有鉴定Met:HGF为2: 1的任何复合体(Gherardi etal.，2003)。此外，该受体活化模型需要某种未知的分子机制，其可能防止 一个HGF分子通过其a-和P-《连同时结合一个Met受体。可选，参与与Met的直接作用，HGFP-链可具有除了受体活化中的重要 功能，其有利于HGF:Met的2:2复合体。我们发现原HGF 0 HGF p-链的单 链"未活化的"形式与Met的结合超过HGF p的活化形式的数种突变 体，即Y673A， V692A和R695A (例如，图5)。重要的是，所有三种对应全 长HGF的突变体显示可测定的受体磷酸化和/或促迁移活性，然而原HGF 不是，即使在超过HGF活性所需浓度1000倍的情况下。明显的区别使得我 们考虑HGF (3-链在受体活化中的其它功能。錄论结论是，本文所述结果显示HGF (3-链含有至今未知的Met反应位点， 其类似于丝氨酸蛋白酶的"活性位点区"。因此HGF为二价的，具有a-链 中NK1区中的高亲和力Met结合位点。其它重要反应可出现在两条HGF 卩-链之间，两条HGF a-链之间(Donate et al., 1994)以及，如利用MSP/Ron所 发现的(Angeloni etal. ，2004),在两个Met Sema结构域之间。此外，肝素在 HGF/Met受体结合中也起重要作用。鉴定HGF P-链上的不同Met结合位点 提供了设计对疾病诸如癌症具有治疗潜力的新Met抑制物种类的科学和经 -验性原理。部分参者文献列表Angeloni, D., Danilkovitch-Miagkova, A.， Miagkov, A,, Leonard, E. 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〈213>人工序列<220><223〉合成肽 <400> 7Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Tyr Trp Glu Gin 15 10 15<210> 8 <211> 15 <212〉 PRT <213〉人工序列<220><223>合成肽 <400〉 8Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Phe Gly Cys Trp Phe Glu Ser 15 10 15102<210>9<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223〉合成肽<400>9Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp His Gly Cys Glu Tyr Val Glu 15 10 15〈210〉10<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223〉合成肽〈400>10Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp lie Gly Cys Asp 丁rp Val Leu 15 10 15<210〉11〈211〉15<212〉PKT<213〉人工序列<220><223〉合成肽〈400>11Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Phe Gly Cys Asp Trp Val Leu 15 10 15<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽〈400>12Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu lie Gly Cys Asp Trp Val Leu 15 10 15<210〉 13 〈211〉 15 <212> PRT <213>人工序列<220><223>合成肽 <400〉 13Val Asp Trp Val Cys Phe'Arg Gly lie Gly Cys Asp Trp Val Leu<210>14〈211>15〈212〉PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>合成肽<400>14Val Asp Trp Val Cys Leu Arg Asp lie Gly Cys Asp T卬Val Pro 15 10 15<210> 15 <211〉 15 <212> PRT <213>人工序列<220〉<223>合成肽〈400> 15Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Tyr Glu His 15 10 15<210〉16<211〉15〈212>PRT〈213〉人工序列〈220>〈223〉合成序列〈400〉16Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Leu Gly Cys Asp Tyr Val Leu 15 10 15〈210>17<211>15〈212〉PRT〈213〉人工序列<220〉<223>合成序列〈400〉17Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Leu Gly Cys Asp Trp Val Val 1 5 10 15<210> 18 〈211〉 15 <212> PRT 〈213〉人工序列〈220><223>合成序列〈400〉 18Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Glu Leu Gly Cys Asp Trp Val Phe 15 10 15〈210〉19〈211〉15〈212〉PRT<213>人工序列<220>〈223〉合成序列<400〉19Val Asp Trp Val Cys Phe Arg A印Met Gly Cys Tyr Tyr Glu Leu 15 10 15<210>20〈211〉15<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成序列<400>20Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Met Gly Cys Asp Trp Val Leu 15 10 15〈210〉21<211〉15<212>PRT<213>人工序列<220>〈223〉合成序列〈400〉21Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Ser Gly Cys Tyr Tyr Ala Thr 15 10 15<210>22<211>15〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成序列〈400>22Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp Thr Gly Cys Asp Trp Val Leu 1 5 10 15〈210〉 23 〈211> 15 <212> PRT <213>人工序列<220〉〈223>合成序列 <400> 23Val Asp Trp Val Cys Phe Arg Asp 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权利要求
1.筛选或鉴定选择性结合活化的肝细胞生长因子(HGF)β链的物质的方法，所述方法包括比较(i)候选物质与活化的HGF β链的结合，与(ii)候选物质与参比HGF β链的结合，其中所述参比β链基本上不结合c-met，由此选择显示与活化的HGF β链的结合亲和力高于与参比HGF β链的结合亲和力的候选物质，作为选择性结合活化的HGF β链的物质。
2. 筛选阻断c-met活化的物质的方法，所述方法包括筛选结合c-met并 阻断HGF卩链与c-met的特异性结合的物质。
3. 调节受试者中c-met活化的方法，所述方法包括给予受试者调节HGF (3链与c-met的特异性结合的物质，由此调节c-met活化。
4. 抑制c-met活化的细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞或组织与 抑制HGF卩链与c-met的特异性结合的物质接触，由此抑制与c-met活化相 关的细胞增殖。
5. 治疗受试者中与c-met活化相关的病理疾病的方法，所述方法包括给 予受试者这样的物质，所述物质抑制HGF |3链与c-met的特异性结合，由 此抑制c-met活化。
6. 筛选阻断HGF与其受体结合的HGF受体拮抗剂的方法，所述方法包 括选择这样的物质，所述物质结合HGF卩链的残基534， 578， 619, 673， 692， 693， 694， 695, 696， 699和/或702中的至少一个。
7. 分子，其结合活化的肝细胞生长因子(3链并抑制所述活化的HGF p 链与c-met的特异性结合。
8. 分子，其与肝细胞生长因子卩链竟争结合c-met 。
全文摘要
本发明涉及调节HGFβ链和C-MET的相互作用。本发明提供用于调节HGF/c-met信号途径的方法和组合物，具体通过调节HGF链与c-met的结合。
文档编号G01N33/68GK101614745SQ20091015110
公开日2009年12月30日 申请日期2004年6月4日 优先权日2003年6月6日
发明者丹尼尔·K·克里切霍弗, 姚晓怡, 罗伯特·A·拉扎勒斯 申请人:健泰科生物技术公司