专利名称：一种提高重组蛋白分泌效率的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种提高重组蛋白分泌效率的方法。
背景技术：
人类利用DNA重组技术生产治疗性药用蛋白已有数十年的历史了。目前 人们主要釆用原核的细菌表达系统以及真核的酵母和哺乳动物细胞表达系统 来生产重组药用蛋白。细菌生长速度快，对其做遗传修饰相对较容易些，尤 其是在工业化生产上成本要远低于哺乳动物细胞规模化培养系统。但是细菌 表达系统由于其本身固有的一些缺陷，使其难以表达一些来源于高等真核生 物的复杂蛋白。其中一个主要的原因是细菌缺乏完善的翻译后修饰系统，容 易使表达的重组蛋白形成不正确的折叠构象以及缺少糖基化和乙酰化修饰， 最终失去天然活性。哺乳动物细胞表达系统可以有效克服细菌表达系统这些 不足之处，但是在细胞规模化培养成本和重组蛋白产量上却难以与细菌表达 系统相抗衡。虽然人们对提高哺乳动物细胞表达产量做了许多优化工作，在 一定限度上提高了产量，但是最终产量还是与细菌表达系统相差甚远(Wurm 2004)。 一种行之有效的提高产量的方法就是利用动物乳腺作为生物反应器。 乳腺生物反应器具有高产量(l-20克/升)、低成本(转基因动物技术的成本 是哺乳动物细胞培养技术的1/100-1/10)和无病原污染等优点。制备转基因动 物乳腺生物反应器的一般流程为构建乳腺特异表达载体，制备转基因小鼠 验证乳腺表达载体在动物乳腺中表达重组外源蛋白的效果，然后制备转基因 大家畜以大规模生产重组外源蛋白，最终从乳汁中分离纯化目的蛋白。由于 重组蛋白分泌到乳汁中，与表达于哺乳动物细胞内的蛋白相比，其分离纯化 工艺要相对简单(Hennighausen 1990; Clark 1998; Van Cott and Velander 1998)。 2006年一种商品名为ATyn，来自于转基因动物的抗血栓重组蛋白药物被欧洲 药品管理局批准上市，标志着转基因动物用于商业化生产药物时代的到来。
对于如何提高重组蛋白在哺乳动物细胞以及转基因动物中的产量，人们 已经做了大量的优化工作。这些工作主要集中转录和翻译水平上的修饰，例 如选用较强的启动子，添加增强子和绝缘子，优化密码子，以及添加内含子
等遗传修饰(Fiering, Whitelaw et al. 2000; Lee and Young 2000; Zhang, Wu et al.2005)。但是关于提高重组蛋白分泌效率的研究工作相对较少，尤其是对转 基因动物的分泌效率研究更少。
分泌性蛋白通常在其N端含有一段16-26个氨基酸长的信号肽序列，信 号肽具有明显的序列特征，它包括N端起始的蛋氨酸(甲硫氨酸)、带正电 荷的氨基端区、高度疏水的中央核心区以及具有极性的羧基区。.牛卩酪蛋白 信号肽具有上述的所有特征，此外它的疏水核心区中亮氨酸与丙氨酸含量比 例为4: 2,研究表明当疏水核心区中亮氨酸与丙氨酸含量比例在7: 3到2: 8范围内信号肽都具有正常的分泌功能，在有效的比例范围内提高亮氨酸的 含量可以促进疏水螺旋二级结构的形成，从而提高其分泌效率，牛(3酪蛋白 信号肽具有较高的亮氨酸/丙氨酸比值，因此被认为是个具有较好分泌功能的 信号肽(Izard， Doughty etal.l995)。信号肽引导翻译中的新生肽进入内质网腔，
并进行折叠和乙酰化、磷酸化等各种修饰，然后转运至高尔基进一步作糖基 化加工，最后以膜泡形式运送到胞外(Walter, Gilmore et al. 1984; Rapoport, Jungnickel et al. 1996; Rapoport, Matlack et al. 1999)。然而，有一些蛋白，例如 转录因子Engrailed, Hoxa5和Pax6， HIV病毒蛋白Tat和疱疹病毒蛋白 VP22，以及其它一些蛋白，它们不含信号肽，但仍可以分泌至胞外，这些不 依赖信号肽的蛋白分泌形式被称为非经典分泌(Cleves 1997; Brooks, Lebleu et al. 2005; Amoys and Wang 2007; Dupont， Prochiantz et al. 2007)。非经典分泌过 程中蛋白不经过内质网和高尔基转运，而以一种或几种不明机制直接运输至 胞夕卜(Derossi， Calvet et al. 1996; Joliot, Trembleau et al. 1997; Prochiantz and Joliot 2003)。
利用哺乳动物细胞和转基因动物表达分泌蛋白时，通常是给重组蛋白N 端添加一段经典的信号肽序列。重组蛋白的分泌效率因信号肽和蛋白本身的 理化性质的不同而有很大的差异，通常在表达一些非分泌性蛋白时经常会遇到分泌效率低下的问题；同时分泌效率还与选用的细胞系紧密相关，在一个 细胞系中可以获得较好分泌效率的重组蛋白在另一个细胞系中很可能难以得 到同样的表达分泌效果。 一个重要原因是细胞质中的翻译后修饰加工系统与 内质网腔中的不同， 一些非分泌性蛋白在添加信号肽后，合成的新生肽链进 入内质网后，很可能与内质网腔中的蛋白发生静电和疏水交互作用，而且在 内质网的非还原性条件下容易形成二硫键，这些因素将导致肽链的错误折叠， 无法形成正确的高级空间构象，而不能被进一步转运至高尔基体，最终将被
Sec61p复合体转运到细胞质中降解掉，严重影响了其分泌效率(Bamsh, Wang etal.2002)。非经典分泌蛋白在细胞质中完成肽链的合成并不进入内质网，而 是被运送到富含胆固醇和鞘糖脂的穴样囊泡中，然后以一种尚未研究清楚的 机制分泌到细胞外。因为非经典分泌过程中重组蛋白没有进入含有复杂蛋白 复合体的内质网腔中，不会发生由空间构象引起的转运阻滞而导致的分泌效 率的降低。此外非经典分泌不受细胞类型限制，所以它具有广泛的应用性， 容易从一种应用推广到另一种应用中(Joliot and Prochiantz 2004; Sagan， Burlina et al. 2006)。
发明内容
(一) 要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种提高重组蛋白分泌效率的方法，本发明的又一 目的是公开该方法在制备重组蛋白类药物中的应用。
(二) 技术方案
本发明提供了一种提高重组蛋白分泌效率的方法，它是将小鼠转录因子 Engrailed 2的同源异型结构域中的分泌序列SS融合到重组蛋白的N端，其 中所述分泌序列SS的氨基酸序列为Ala Gin Glu Leu Ser Leu Asn Glu Ser Gln。
本发明所述的编码分泌序列SS的核酸序列为 GCACAGGAGCTCAGCCTGAACGAGTCTCAG。
优选地，所述重组蛋白为人过氧化氢酶。
本发明提供了重组人过氧化氢酶的经典分泌表达载体psighCAT-EGFP, 其质粒图谱和构建过程如附图1所示。
本发明还提供了重组人过氧化氢酶的非经典分泌表达载体 pSShCAT-EGFP,其质粒图谱和构建过程如附图1所示。
此外，本发明还公开了所述方法在制备重组蛋白类药物中的应用。 (三)有益效果
本发明将小鼠转录因子Engmiled 2的同源异型结构域中的分泌序列 SS:AQELGLNESQ加到融合了 GFP的人过氧化氢酶的N端，在CHO细胞中 表达后，发现其分泌效率与原来的牛p酪蛋白信号肽引导的经典分泌相比提 高到2.3倍，为工业生产中提高重组蛋白分泌效率提供了有效的解决手段。
图1是经典分泌和非经典分泌表达载体构建流程图2是Nhel和Pstl双酶切鉴定psighCAT-EGFP的电泳图，其中，M表 示lkb梯度DNA分子量标准，泳道1和2分别为pEGFP-Nl阳性质粒和经典 分泌表达载体psighCAT-EGFP的Nhel和Pstl双酶切结果，1.7kb条带为融合 了牛P酪蛋白信号肽的人过氧化氢酶编码序列，泳道3为psighCAT-EGFP的 Pstl酶切结果；
图3是瞬时转染细胞的RT-PCR检测结果图，其中，M表示100bp梯度 DNA分子量标准，P表示阳性质粒psighCAT-EGFP的普通PCR结果，N表 示pEGFP-Nl阳性质粒转染，泳道1和2分别为psighCAT-EGFP和 pSShCAT-EGFP转染；
图4是瞬时转染细胞的Western blot检测结果图，其中，P表示人过氧化 氢酶标准品，N表示pEGFP-Nl阳性质粒转染，泳道1和2分别为 psighCAT-EGFP和pSShCAT-EGFP转染；
图5是过氧化氢酶活性检测图，其中斜线柱形表示转染对照空载体 pEGFP-Nl,实心柱表示转染分泌表达载体psighCAT-EGFP和pSShCAT-EGFP
的平均结果，^表示P〈0.01;
图6是CHO细胞免疫荧光检测图，其中，细胞核为DAPI染色，显蓝色 荧光，GFP为绿色荧光，PE为红色荧光；A、 B和C表示转染对照空载体 pEGFP-Nl， G、 H和I为转染经典分泌表达载体psighCAT-EGFP， S、 T和U 为转染非经典分泌表达载体pSShCAT-EGFP，标尺长度20pm;
图7是细胞分泌效率定量检测结果图，其中，经典分泌的效率设为100， 图为3次重复实验的平均结果。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明所述实施例所使用的载体、菌种、试剂及其来源 pEGFP-Nl载体(Clontech公司)，pMD19-T(TaKaRa公司)，ESTcDNA克隆 (IMAGE 4515735 )购自Ivitrogen公司；宿主菌大肠杆菌DH5ot购自Promega 公司，CHO细胞系购自Ivitrogen公司；信号肽和非经典分泌短肽的序列、引 物合成及序列测定由上海生工完成，Taq酶，T4DNA连接酶、内切酶均来自 大连TaKaRa公司；抗人过氧化氢酶抗体购自Abcam公司，HRP标记的二抗购自 KPL公司；细胞培养基DMEM、 PBS和胎牛血清购自Gibico公司；脂质体 Lipofectamine 2000和RNA提取试剂TRIzo1均购自Invitrogen公司，蛋白浓度测 定试剂盒、过氧化氢酶活性测定试剂盒和细胞裂解液均购自碧云天公司。酶 切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第 三版)》。
实施例1细胞分泌表达载体的构建
1.1人过氧化氢酶经典分泌表达载体构建
经典分泌载体整个构建过程见图l，具体如下
以Invitrogen公司IMAGE编号4515735的EST cDNA克隆为模板，以 NCBI收录的人过氧化氢酶基因全长cDNA序列(登录号NM_001752)为依
据，设计引物扩增基因编码区序列，同时在序列的两端分别引入Nhel和Pstl 酶切位点，并删除了基因的终止密码子。上游引物为Nhel F: 5'-TTGCTAGCAGATGAAGGTCCTCATCC-3'， 下游引物为 Pstl R: 5'-TTCTGCAGCAGATTTGCCTTCTCCCT-3'。将PCR产物回收后连接到 pMD19-T载体，进行测序，证明序列正确后利用EcoRI和PstI作双酶切，回 收1386bp片段，将回收产物连接到同样经过EcoRI和PstII双酶切的 pEGFP-Nl载体,获得pEcoRI-hCAT-EGFP载体；用HindIII和EcoRI双酶切后， 回收208bp片段，连接到同样经过这两种酶双切的pMD19-T载体，获得 pMD-hCAT-EcoRI载体。在距人过氧化氢酶翻译起始位点15bp处有一 BamHI 酶切位点，所以在合成牛p酪蛋白信号肽DNA序列时，在其末端直接接上基 因的前15个bp序列，形成以下正负两条链 +5,-CTAGC4ra44GGT(XTC47rC7TG(XTG(XTGG:rGGCrC rGGC(XTrC7C4 ATGGCTGACAGCCG&3'
-5 ，-GATCCCGGCTGTCAGCCAT7UCA4 04 GCC4 CC4 G
序列中斜体部分为牛(3酪蛋白信号肽，黑体部分为基因的前15bp序列，下划线 为酶切位点序列。正负链100度水浴后退火形成5，末端带Nhel和3，带Bamffl酶 切位点的双链DNA,连接到经NheI和BamHI双酶切的pMD-hCAT-EcoRI载体， 测序验证序列正确后，用NheI和EcoRI双酶切载体，回收258bp连接到经Nhel 和EcoRI双酶切的pEcoRI-hCAT-EGFP载体，获得人过氧化氢酶经典分泌表达 载体psighCAT-EGFP。用Nhel和Pstl双酶切鉴定结果表明1638bp的信号肽和人 过氧化氢酶融合序列已正确克隆进载体(图2)。
1.2人过氧化氢酶非经典分泌表达载体构建
非经典分泌载体构建过程见图1 。
除了合成的非经典分泌短肽DNA序列不同外，其余步骤与经典分泌载体 的构建方法一致。人工合成的小鼠转录因子Engmiled2的同源异型结构域中的 分泌序列SS如下+:
CTAGCATGGC4C4G04GCTC4G(Xm^Ca4GrCTC^GATGGCTGACA GCCGG
GATCCCGGCTGTCAGCCATCra4a4CTCGrrC4GGCrG^GCr(X7CTGC
序列中斜体部分为SS序列，黑体部分为基因的前15bp序列，下划线为 酶切位点序列。最终构成的非经典分泌表达载体命名为pSShCAT-EGFP，其 酶切鉴定结果与图2—致。
实施例2 CHO细胞转染及表达检测 2.1细胞培养及瞬时转染
CHO细胞将种在6孔细胞培养板中，在含10%胎牛血清的DMEM培养 基中培养至70-80%汇合度时，按照说明书要求，用Lipofectamine 2000脂质 体将分泌表达载体psighCAT-EGFP和pSShCAT-EGFP以及对照空载体 pEGFP-Nl转入细胞中。
2.2 RT-PCR和Western blot检测
转染的CHO细胞在37。C培养箱中培养24小时，用TRIzol提取总RNA,并 用DNase去除残留的DNA,作为模板，以Oligo dT引物反转录合成cDNA链后， 用下面的一对引物扩增人过氧化氢酶基因内一段184bp长的片段。上游引物 hCAT F 5'-TGCTGAATGAGGAACAGAGG-3'; 下游引物hCAT R 5'-GTGTGAATCGCATTCTTAGG-3'。 RT-PCR结果表明转染的质粒中的过氧 化氢酶基因已经开始在CHO细胞活跃地进行转录了 (图3)。
转染的CHO细胞在37。C培养箱中培养24小时后，用碧云天公司的细胞 裂解液裂解，裂解产物以10000rpm离心10分钟后取上清作Westernblot杂交。 杂交中使用的一抗为绵羊抗人过氧化氢酶多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物
酶偶联的兔抗绵羊抗体。杂交结果表明转染的CHO细胞中表达有GFP蛋白融 合的人过氧化氢酶(图4)。
2.3过氧化氩酶活性检测
T-25细胞培养瓶中转染的CHO细胞在37。C培养箱中培养24小时后，用细 胞裂解液裂解细胞，离心后提取上清，用碧云天公司的过氧化氢酶检测试剂 盒测定样品的酶活性，结果表明转染的细胞中过氧化酶活性比对照中有明显 的提高，说明表达的GFP融合的重组蛋白仍具有天然活性(图5)。
2.4过氧化氢酶分泌效率检测
6孔板中爬片的CHO细胞转染表达载体之后，于37。C培养24小时，取出盖 玻片，用4。/。多聚甲醛于4。C固定10分钟，避免用Triton作透膜处理，接着依次 与绵羊抗人过氧化氢酶多克隆抗体和PE偶联的抗绵羊二抗孵育。细胞核以 DAPI染色，制备好的细胞免疫荧光样品用含2.5。/。DABICO (w/v) ,90%甘油 (v/v)和50mMTris的抗荧光淬灭封片剂封片，于共聚焦荧光显微镜下观察细 胞免疫荧光结果。结果如图6所示，绿色荧光来自GFP，蓝色荧光代表细胞核， 红色荧光显示分泌到细胞表面的重组人过氧化氢酶。图6 A、 B和C为转染对 照空载体pEGFP-Nl的细胞免疫荧光结果，图中可见GFP不仅分布在细胞质 中，也分布在细胞核中，但它不分泌到细胞表面；图6 G、 H和I为转染 psighCAT-EGFP的细胞免疫荧光结果，G表示融合GFP的人过氧化氢酶在细胞
内分布情况，可见融合蛋白不仅分布在整个细胞质中，也有部分进入细胞核， H中的红色荧光显示有部分融合蛋白已分泌到细胞表面，I为G和H的叠加效 果，表明只有极少比例的融合蛋白被分泌到胞外；图6 S、 T和U为 pSShCAT-EGFP的细胞免疫荧光结果，与psighCAT-EGFP相比，融合蛋白在非 经典分泌短肽SS的引导，趋于集中分布在紧靠细胞膜下的一圈细胞质中，且 有较大比例的融合蛋白分泌到细胞外。
为了定量比较经典分泌与非经典分泌效率的差异，我们釆用NIHImage J 软件对细胞免疫荧光图作定量分析。图中红色和绿色荧光的面积和荧光强度
可用ImageJ软件分别计算出，红色荧光面积和荧光强度的乘积与绿色荧光相 应的乘积的比值表示为分泌效率，如果把经典分泌的效率定为100，则非经 典分泌效率是它的2.3倍(图7 )。可见我们所用的SS短肽可有效提高蛋白的 分泌水平。
权利要求
1、一种提高重组蛋白分泌效率的方法，其特征在于将小鼠转录因子Engrailed 2的同源异型结构域中的分泌序列SS融合到重组蛋白的N端，其中所述分泌序列SS的氨基酸序列为Ala Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu SerGln。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于编码分泌序列SS的核酸序 列为GCACAGGAGCTCAGCCTGAACGAGTCTCAG。
3、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述重组蛋白为人过氧化氢酶。
4、 一种重组人过氧化氢酶的经典分泌表达载体psighCAT-EGFP,其质 粒图谱如附图l所示。
5、 一种重组人过氧化氢酶的非经典分泌表达载体pSShCAT-EGFP,其 质粒图谱如附图l所示。
6、 根据权利要求1-3之任一项权利要求所述的方法在制备重组蛋白 类药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种提高重组蛋白分泌效率的方法，它是将小鼠转录因子Engrailed 2的同源异型结构域中的分泌序列SS融合到重组蛋白的N端，所述分泌序列SS的氨基酸序列为Ala Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu Ser Gln。采用本发明所述方法得到的人过氧化氢酶的分泌效率与牛β酪蛋白信号肽引导的经典分泌相比提高到2.3倍，为工业生产中提高重组蛋白分泌效率提供了有效的解决手段。
文档编号C12N15/09GK101173270SQ20071012110
公开日2008年5月7日 申请日期2007年8月30日 优先权日2007年8月30日
发明者何祖勇, 宁 李, 波 汤 申请人:北京济普霖生物技术有限公司;李 宁