7-12。
[0119] 标准品浓度的设置：
[0120] 向编号Al至A12的孔中、编号El至E12的孔中均加入弱阳性抗原（Sema4C人重 组蛋白浓度为3. 125ng/mL);
[0121] 向编号BI至B12的孔中、编号Fl至F12的孔中均加入弱阳性抗原（Sema4C人重 组蛋白浓度为6. 25ng/mL);
[0122] 向编号Cl至C12的孔中、编号Gl至G12的孔中均加入强阳性抗原（Sema4C人重 组蛋白浓度为12. 5ng/mL);
[0123] 向编号Dl至D12的孔中、编号Hl至H12的孔中均加入强阳性抗原（Sema4C人重 组蛋白浓度为25ng/mL)。
[0124] 检测抗体浓度的设置：
[0125] 将检测抗体用加样缓冲液稀释为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL四个浓 度，分别加入上述孔中。其中，编号Al至A6、BI至B6、Cl至C6、Dl至D6的孔中加入浓度 为400ng/mL检测抗体；编号A7至A12、B7至B12、C7至C12、D7至D12的孔中加入浓度为 200ng/mL检测抗体；编号El至E6、Fl至F6、Gl至G6、Hl至H6的孔中加入浓度为IOOng/ mL检测抗体；编号E7至E12、F7至F12、G7至G12、H7至H 12的孔中加入浓度为400ng/mL 检测抗体。
[0126] 加底物（TMB)显色，加酸（硫酸，浓度为2M，体积为50uL)终止反应。分别读取吸 光度 OD45q 57。值（450nm，570nm，BIO-RAD Model)。
[0127] 其余详细的具体步骤（如添加各种试剂的体积、洗涤等等过程）均参照实施例5。
[0128] 根据实验的检测结果，本技术方案设置的包被抗体的工作浓度以及检测抗体的工 作浓度，强阳性抗原液OD值在1. 0-3. 0左右，阴性参考OD值< 0. 2,远远好于其他检测条 件，符合构建试剂盒所需达到的标准。本技术方案选取的包被抗体的工作浓度为4ug/mL为 最佳工作浓度，本技术方案选取的检测抗体的工作浓度为0. 4ug/mL为最佳工作浓度远远 好于设置的其他浓度的检测效果。
[0129] 工业实用性
[0130] 本发明提供的试剂盒是一种可用于临床检测的实用性试剂盒，通过检测患者血清 中Sema4C的水平来协助乳腺癌的早期诊断、预测预后、评估疗效及随访监测以期早期发现 肿瘤复发和转移。在目前没有理想的乳腺癌肿瘤标记物的现状下，分泌型Sema4C蛋白的发 现，为乳腺癌提供了优于目前临床常用的血清学标记物CA153和CEA(Molina，R.，Jo, J.， Filella，，Zanon，G.，Pahisa，J.，Mu ηοζ，Μ·，Farrus，Β·，Latre，M. L.，Escriche，C.， Estape，J.，et al. (1998). c-erbB-2 oncoprotein，CEA，and CA 15. 3 in patients with breast cancer prognostic value. Breast Cancer Res Treat 51，109-119. ;Robertson， J. F.，Jaeger，W.，Syzmendera，J. J.，Selby，C.，Coleman，R.，Howell，A.，Winstanley， J.，Jonssen，P. E.，Bombardieri，E.，Sainsbury，J. R.，et al. (1999). The objective measurement of remission and prog ression in metastatic breast cancer by use of serum tumour markers. European Group for Serum Tumour Markers in Breast Cancer. Eur J Cancer 35,47-53.)。本发明所述的分泌型Sema4C的灵敏度和特异性均高于CA153 和CEA单独使用时的灵敏度和特异性。因此，利用本发明的试剂盒，可以结合影像学检查来 开展无创性乳腺癌术前早期诊断及术后监测。且由于该生物标志物是一个独立预后因子， 与淋巴结转移明显相关，因此可以预测预后、监测病情、指导治疗。该标志物有望成为乳腺 癌治疗新的靶点，为乳腺癌个体化治疗带来新的思路和方案。
[0131] 分子标志物的血清学检测是基础研究结果向临床实际应用迈进的手段，鉴于以上 结果及SEMA4C分泌蛋白的发现，本发明人进一步尝试开发了人血清学检测试剂盒-双抗 夹心ELISA试剂盒。酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，简称 ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。ELISA的基础是 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其 免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本 (测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载 体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原和抗体，也通 过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加 入酶反应的底物后，底物被催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关， 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反 应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。其中双抗体夹心法是检测抗原的最常用的方法。 实验结果证实试剂盒构建成功。该试剂盒对乳腺癌患者的可信检出率为80. 04%，通过该试 剂盒，本发明人发现正常个体与乳腺癌患者血清Sema4C含量有显著差异。
[0132] 本发明中的一些术语与缩写：mAb :单克隆抗体，monoclonal antibody ;pAb :多克 隆抗体，polyclonal antibody ;BSA :牛血清白蛋白；Tween-20 ;IgG :免疫球蛋白G ;TMB :四 甲基联苯胺；0D:吸光度。
[0133] 需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员 可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和 改变也纳入本发明的范围内。
[0134] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0135]
【主权项】
1. 一种分泌型Sema4C蛋白，其特征在于，所述分泌型Sema4C蛋白为膜型Sema4C蛋白 的胞外段，包括SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述一种分泌型Sema4C蛋白，其特征在于，在SEQIDNO. 1所示的 氨基酸序列中插入一段标签序列。3. 根据权利要求1或2所述一种分泌型Sema4C蛋白，其特征在于，所述分泌型Sema4C 蛋白以分泌形式存在且能够在人血清中被检测到。4. 一种编码权利要求1或2所述的分泌型Sema4C蛋白的核苷酸序列。5. -种权利要求1或2所述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物的应用。6. -种权利要求1或2所述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物在乳腺癌术前检测 及术后监测中的应用。7. -种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，包括以下组成：包 被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体、检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体、链 霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体、标准品，所述标准品为Sema4C 人重组蛋白，所述Sema4C人重组蛋白包括SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列。8. 根据权利要求7所述一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，其特征在 于， 1) 所述包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，母液浓度为0. 2mg/mL，稀释50 倍后的工作液的浓度为4ug/mL; 2) 检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体，母液的浓度为0. 2mg/mL，利用生物素标记 后，使用时，将生物素标记的小鼠抗人Sema4C单克隆抗体稀释500倍得到的工作液浓度为 0.4ug/mL； 3) 链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体，母液的浓度为 0. 5mg/mL； 4) 标准品，母液的浓度为100ng/uL。9. 根据权利要求7或8所述一种含有分泌型Sema4C蛋白的试剂盒，其特征在于，还包 括包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、显色液、反应终止液。10. 根据权利要求9所述一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，其特征在 于， 1) 所述包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，其成分为140mMNaCl、2. 7mMKCl、10mMNa2HP04、 1. 8mMKH2P04,pH值为 7. 4 ; 2) 所述洗涤液为添加了体积分数为0. 05%的Tween-20的包被缓冲液； 3) 所述封闭液为含有体积分数为1%的牛血清白蛋白的包被缓冲液； 4) 所述加样缓冲液的成分为50mMTris-HCl、0. 5MKC1、体积分数为1%的牛血清白蛋 白、体积分数为〇· 05%的Tween-20,pH值为8. 4 ; 5) 所述反应终止液的成分为2MH2S04。
【专利摘要】本发明涉及一种分泌型Sema4C蛋白及其应用。本发明所述分泌型Sema4C蛋白为膜型Sema4C蛋白的胞外段，包括SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列。所述分泌型Sema4C蛋白可以作为肿瘤标志物进行应用。本发明还提供以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，以Sema4C人重组蛋白为标准品，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明所述的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，可用于肿瘤患者(尤其是乳腺癌患者)的术前诊断、术后治疗效果评估及随访监测。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105259348
【申请号】CN201510699053
【发明人】马丁, 高庆蕾, 魏军成, 杨洁, 乔龙
【申请人】珠海雅马生物工程有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月21日