明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0031] 实施例1香豆素树状体荧光免疫层析条的制备
[0032] 1、材料
[0033] 氨基脂肪酸乳胶圆珠（2% w/v, 20nm)购自于美国生命技术公司，流感病毒核蛋白 NP通过重组杆状病毒转染昆虫细胞Sf9表达、纯化获得。
[0034] 荧光免疫层析条检测法（FICT)所用单克隆抗体A-7307和A-7304购自美国ATCC。 ECL底物购自美国Bio-Rad公司。
[0035] 戊二醛溶液（8 %，溶于双氧水）和羊抗鼠 IgG购自美国Sigma公司。
[0036] HlNl和呼吸道拭子样本由国家流感中心舒跃龙博士惠赠。禽流感病毒H5N3、 H7N1、H7N7、H9N2感染鸡的器官样本由山西隆克尔生物制药有限公司保存（表1所示）。
[0037] 表1本发明中所使用的禽流感病毒
[0039] 2、方法
[0040] 2. 1病毒的鸡胚培养和纯化
[0041] 血凝素测定（HA)，病毒培养前进行血凝含量测定，操作简述如下：
[0042] 50 μ L PBS加入圆底96孔板，加入50微升稀释的病毒液混勾，取50微升移入下1 孔，加入等体积〇. 5%的红细胞，放置室温确定血凝含量。
[0043] 为确定流感病毒的繁殖，含禽流感病毒Η5Ν3、Η7Ν1、Η7Ν7、Η9Ν2的器官研磨、匀浆、 用PBS (含100单位、IOOng的庆大霉素、链霉素/毫升）重悬、0. 22微米针式滤器过滤，HlNl 病人拭子用PBS (每毫升含100单位庆大霉素、IOOng链霉素）浸泡、0. 22微米针式滤器过 滤。9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔接种100微升含50HAU/0.1 mL的流感病毒上清液，2天后 收集尿囊液，测定ΗΑ。
[0044] 尿囊液经离心机2600Xg(5804R,德国Eppendorf公司）4°C离心5min，放置于转 头SW28转头（德国Beckman Coulter公司产品）上20%蔗糖垫层（ΝΤΕ缓冲液配制（IOOmM NaClUOmM Tris-HCl(pH 7. 4)、lmM EDTA)，112,600Xg 超速离心 2 小时。PBS 透析测定 HA 或用于斑点杂交和荧光免疫层析检测。
[0045] 2. 2 -种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条的制备
[0046] 2. 2. 1结合香豆素树状体、抗体乳胶圆珠的制备
[0047] 0. 8mL氨基脂肪酸乳胶圆珠（2 % W/V，直径20nm)用0. 8mL结合缓冲液（0.1 M碳 酸氢钠 ，pH 8. 5)、PBS (pH 7. 4)先后分别洗涤3次，短暂离心，弃上清；然后向沉淀中加入 0. 8mL结合缓冲液，加入128 μ L溶于DMSO的浓度为lmg/mL香豆素树状体溶液，室温摇动1 小时，得到结合香豆素树状体的乳胶圆珠。PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，用0.8ml甲流 NP抗体A-7307 (lmg/mL)重悬，4°C孵育1小时，缓慢加入0· 5mL戊二醛溶液，涡旋1分钟， 4°C孵育2小时，用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用ImL 0. 1%牛血清白蛋白溶液重 悬，使乳胶表面单抗达0. 8mg/mL，4°C保存备用。
[0048] 所述的香豆素树状体的结构如以下结构式所示：
[0049]
[0050] 2. 2. 2斑点杂交免疫法检测香豆素树状体、乳胶、单抗结合物的荧光和免疫原性。
[0051] 荧光密度用紫外可见光或用微板读数仪（Infinite F200,瑞士 TECAN公司产品） 在460nm激发、560nm散发测量。
[0052] 2. 2. 3层析条的组装
[0053] 层析条按照连接顺序依次包括样品衬垫，结合衬垫，醋酸纤维素膜，吸水纸及位于 下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述醋酸纤维素膜（EMD，德国Millipore公司产品） 与结合衬垫之间有搭接，所述醋酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述结合衬垫吸附有表 面吸附甲型流感病毒核蛋白单抗A-7307以及作为荧光标记的香豆素树状体的乳胶圆珠；
[0054] 其中，醋酸纤维素膜（EMD，德国Mi 11 ipore公司产品）上包被有0· 2 μ g羊抗鼠 IgG 多克隆抗体包被的质控线，以及〇. 8 μ g甲型流感病毒核蛋白另一单抗A-7304包被的检测 线，两条线间隔〇. 5cm，样品衬垫提供了待测样品加入的位置，30°C干燥2小时用于荧光免 疫层析条检测。
[0055] 2. 3病毒检测
[0056] 2. 3. 1斑点免疫杂交
[0057] 用10 μ L感染病毒的样本液点样于PVDF膜表面，37°C下放置90min使膜完全干 燥，用含5%脱脂牛奶的PBST (PBS，0. 1% Tween 20)封闭1小时，加入溶于5% BSA溶液中 的第一抗体（1 μ g/mL)，4°C孵育16小时，用PBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗 鼠 IgG与膜上，轻摇、室温孵育1小时，PBST洗涤三次，ECL低物加到膜上。
[0058] 2. 3. 2 FICT荧光免疫层析条带检测和常规快速诊断检测（RDT)
[0059] 向10 μ L感染病毒的样本液中加入100 μ L样品稀释缓冲液（25mM HEPES (pH 7.5)，100禮恥(：1，2.511111%(：12,0.1%陬40)，取稀释后的样本液1(^1^加到在2.2节制备 得到的层析条的样品垫上，放置暗处5分钟，用于荧光免疫分析。便携条带读数计有450nm LED，在460nm激发、560nm散发波长下测量荧光。
[0060] 为比较FICT和RDT的操作性以及一致性，采用商用RDT试剂盒（购自韩国Humasis 公司）对检测样品、病毒液进行了检测。
[0061] 3.结果
[0062] 结合反应后，0. 8mg mAb结合到乳胶上，使全部单抗产生了共价结合物。
[0063] 0. 4 μ g/uL结合单克隆抗体，按荧光免疫层析检测的1/2浓度点在PVDF膜上，紫外 灯下肉眼可观察到黄色，也就是荧光密度可用结合单抗检测，确保乳胶结合单抗和香豆素 树状体的荧光信号。单抗结合乳胶效率通过单克隆抗体、结合单抗的斑点杂交免疫法比较 获得。结合单抗和未结合单抗上样PVDF膜，用HRP结合的抗鼠 IgG检测化学发光水平。通 过免疫分析乳胶上结合单抗数量筛选，使结合抗体具有高强度的荧光，化学发光信号显著 低于未结合抗体。因为乳胶或少许单抗和乳胶结合形成共价键效率低下造成的空间障碍。
[0064] 结合单抗可检测甲流病毒NP蛋白和抗原，具有免疫反应性。结合物4°C贮存10天 和新鲜胶体比较，结合的单克隆抗体显示高荧光度，平均为92. 19±5. 34(mean土SD) %，10 天的单克隆抗体结合物和新鲜制备的单克隆抗体结合物免疫层析条检测比较，制备放置10 天的样品结果阳性，见图1，表明结合香豆素树状体的单克隆抗体可发出稳定的荧光强度， 具有高度灵敏性，在区别诊断的结合复合体中具有重要的作用。
[0065] 光学性质（荧光吸附和散发谱）比较结果：
[0066] 结合了香豆素树状体后乳胶圆珠吸收波长范围相对较宽，在450nm处为吸收高 峰；单克隆抗体、抗原的结合没有显著改变吸收谱，吸收谱高峰仍在450nm处。这种稳定、 宽广的吸收特征允许使用广谱光源，如光散发二极管容易激发荧光散发。乳胶圆珠在长波 处形成吸收拖尾。荧光的散发光谱呈现较宽的范围，因此，使用光散发二极管便携式条读数 计，容易被荧光散发光滤器（590nm波长）检出。
[0067] 用免疫法检测的信号产生对荧光免疫层析条带检测法定量起了决定作用。检测区 (T)和控制区（C)荧光密度比例对应检测样本中的病毒数量，因此将每次检测T区峰值与每 次检测C区峰值的比值作为相关诊断数据。
[0068] 四种鸡场禽流感病毒感染器官液和病人甲流病毒拭子样本液