一种抗3型解脲支原体mb蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒的制作方法

一种抗3型解脲支原体mb蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗3型解脲支原体MB蛋白抗体及应用该抗体检测解脲支原体的免疫层析试剂盒，抗3型解脲支原体MB蛋白抗体是识别3型解脲支原体MB蛋白105?118位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，3型解脲支原体MB蛋白在GenBank序列号是AAC41437.1；3型解脲支原体MB蛋白105?118位的氨基酸序列为KLPREPKPNEQLTI。本发明所提供的兔抗3型解脲支原体MB蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。
【专利说明】
一种抗3型解脲支原体MB蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析 试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于生物医学技术领域，涉及一种抗3型解脲支原体MB蛋白抗体及应用该 抗体检测解脲支原体的免疫层析试剂盒。
【背景技术】
[0002]解脲支原体(M.urealyticum)为脲原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得 名。解脲支原体有两个生物群，14个血清型，其常存在于健康无症状的人群中，推测可能只 是某些亚群或亚行具有致病性。通过对不同人群泌尿生殖道的分群研究发现，在人类泌尿 生殖道寄居并引起感染的大部分是第一群，以3型最为常见。解脲支原体感染后，患者大多 无明显症状，因此，很难被患者觉察，也易造成医生漏诊。解脲支原体可侵犯尿道、宫颈及前 庭大腺，引起尿道炎、宫颈炎与前庭大腺炎;上行感染时，可引起子宫内膜炎、盆腔炎、输卵 管炎，尤其输卵管炎多见。解脲支原体感染造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的 重要原因。国内外资料提示，不孕症夫妇的宫颈粘液、精液中解脲支原体培养阳性率高达 50%以上，由此可见，解脲支原体感染与不孕症的发生有相关关系。解脲支原体感染造成不 良的另一个原因是流产，有人从流产的组织中检查出解脲支原体的阳性率高达40%以上。
[0003] 目前解脲支原体的检测方法主要有3类:一是分离培养法，其是证实感染的"金标 准"，但由于解脲支原体的生长周期极为缓慢，培养周期长，导致该法在临床上不能进行快 速诊断;二是血清学方法，即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝 试验等，检测被检者血清中解脲支原体抗体水平，可间接提示解脲支原体感染的存在。然 而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，而且有时需要双份血清。另外，抗体出现的时 机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在解脲支原体特异性抗体的差异，并且，解脲支 原体细胞膜上的糖脂抗原与其他微生物及机体组织存在非特异性交叉反应，故现有血清学 方法的检测质量受到一定限制;三是利用分子生物学技术检测解脲支原体DNA的存在，其中 最常用的是聚合酶链式反应(PCR)，该方法快速、灵敏、特异，是目前研究Mp感染的重要手 段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的 临床诊断方法。因此，建立解脲支原体特异性抗原诊断方法十分必要。目前，已公开报道的 检测解脲支原体抗原的方法主要为双抗夹心ELISA法，间接免疫荧光法等，但这些方法均不 能实行床旁检测，需要到特定的场合利用特定的仪器(如酶标仪、荧光仪等)来检测，不仅不 够方便快捷而且时间较长，临床应用较为不便。
[0004] 因此，建立解脲支原体特异性抗原的快速诊断方法十分必要。由于大部分致病性 解脲支原体均为血清三型，同时由于其外膜蛋白MB序列上的高度保守性，因此获得高特异 性的抗3型解脲支原体MB蛋白抗体就是一个十分重要的工作。目前，关于抗3型解脲支原体 MB蛋白抗体报道得最多的为相应的单克隆抗体及多克隆抗体。单克隆抗体最大的优点就是 特异性高，但是制备方法繁琐，生产成本高，限制了其应用。多克隆抗体则具有特异性低、效 价低等缺陷。因此，低成本的制备高特异性、高效价的抗3型解脲支原体MB蛋白抗体，以实现 对3型解脲支原体的快速检测，就显得十分重要。

【发明内容】

[0005] 针对【背景技术】中存在的这些技术问题，本发明的目的在于提供识别3型解脲支原 体MB蛋白105-118位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体及应用该抗体的免疫层析试剂 盒。
[0006] 抗3型解脲支原体MB蛋白抗体，其特征在于:所述抗3型解脲支原体MB蛋白抗体是 识别3型解脲支原体MB蛋白105-118位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，所述3型解脲 支原体MB蛋白在GenBank序列号是AAC41437.1;所述3型解脲支原体MB蛋白105-118位的14 个氨基酸序列为KLPREPKPNEQLTI;将3型解脲支原体MB蛋白105-118位的14个氨基酸的序列 命名为MB3Linearar;所述抗解脲支原体3型MB蛋白抗体是AbMB3Linearar。
[0007] -种基于如前所述的抗3型解脲支原体MB蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其 特征在于:所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的 免疫层析试剂盒。
[0008] 作为优选，本发明所提供的试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时， 所述试剂盒的制备方法是：
[0009] 1)量子点标记抗体 AbMB3Linearar:
[0010] 向微量离心管中依次加入〇.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以 MES缓冲液定容为lml，混合溶液，37°C反应5min后，再加入0.34mg的制备得到的抗体 AbMB3Linearar，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1 % (m/v)，封 闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应lh;反应后的样品用超滤管离心（截留分子量 100k)，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到 上部清液以及下部沉淀，l〇〇〇〇g条件下离心3min;将上部清液加到分离柱Superdex-200上 纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待 样品开始从下部流出时开始收集，收集lml后停止收集;将纯化后的样品用超滤管(截留分 子量l〇〇k)以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离 心的条件是l〇〇〇〇g，3min;获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4°C保存备用;至此制得 含有量子点标记抗体AbMB3Linearar的溶液；
[0011] 所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES 缓冲液的pH 7.4;
[0012] 所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、 〇.2g氯化钠、lg牛血清白蛋白BSA以及0. lgNaN3,溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH 调pH至7.3后用去离子水定容至100ml;
[0013] 2)制备结合垫
[0014] 将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有量子点标记抗体AbMB3Linearar的溶液中 lh，取出，25 °C干燥后裁成后规格为4cm X 0 ? 6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫；
[0015] 3)制备样品垫
[0016] 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生 物安全柜内37°C通风干燥后，剪裁成规格为4cmX 2.5cm/条后，即制得样品垫，25°C密封保 存；
[0017] 所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、 〇. 2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、lml吐温-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶 解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml;
[0018] 4)制备检测层
[0019] 4.1)抗MB蛋白多克隆抗体的制备：
[0020] 4.1.1)相关基因的克隆
[0021 ] 对3型解脲支原体MB蛋白（其NCBI蛋白质数据库中的accession number为 AAC41437.1)进行生物信息学分析，获取其N端胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽 段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码序列的5'端引入酶切位点Ndel、3'端 弓丨入终止信号TAA和酶切位点Xhol后分别化学合成全基因序列（全序列合成交由金斯瑞生 物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段均分别连于载体PUC57上），记为MB3,其 基因全序列如序列表所示。MB3基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB (accession number: AAC41437.1)的30-150aa。将含有该段人工合成的DNA片段的载体 PUC57分别用Ndel及Xhol进行双酶切后按常规方法分别回收目的片段，备用。同时采用Ndel 及Xhol对载体pET-28a( + )进行双酶切，并按常规方法分别将经双酶切后获得的MB3基因连 入pET-28a( + )载体中，并转化大肠杆菌T0P10,构建pET-MB3表达载体。经酶切和序列测定证 实表达载体构建无误。该载体表达重组MB3-His融合蛋白。
[0022] 4.1 ? 2)重组MB3_His融合蛋白的表达与纯化
[0023]将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E. coli BL21 (DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50yg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达 菌株。挑取PET-MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中， 于37°C培养过夜。取出菌液后，按1:100接种于100mL含有50yg/mL卡那霉素的LB培养基中， 于37°C培养至0D 6Q() = 0.6时，加入lmol/L IPTG至终浓度为lmmol/L，于37°C摇菌培养，诱导 融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸盐缓冲 液洗涤3次并用10mL上样缓冲液（20mM Na3P〇4,0.5M NaCl; 30mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超 声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心 15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组蛋白MB3-His以可溶性方式存在于菌 体中。
[0024] 重组MB3_His融合蛋白的纯化步骤如下：
[0025] 将上述获得的超声破碎上清液用0.45M1的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品），按照说明书用同样的方法进行纯化。具体方法如下： [0026] 1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0027] 2)用10mL上样缓冲液平衡，lmL/min流速。
[0028] 3)将融合蛋白上样，lmL/min流速。
[0029] 4)用10mL上样缓冲液，以lmL/min流速洗柱。
[0030] 5)用 10mL洗脱缓冲液（20mM Na3P〇4,0.5M NaCl，300mM咪唑，pH7.4)，以lmL/min流 速洗脱，分管收集，每管lml，12%SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。经 bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL。
[0031] 4.1.3)抗MB蛋白多克隆抗体的制备
[0032] 用上述纯化的重组MB3-His融合蛋白按照200yg(200yg重组MB3-His融合蛋白的总 体积是lmL)与lmL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔（由湖北省疾病预防控 制中心提供），于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组 Pl-His融合蛋白按照200yg(200yg重组MB3-His融合蛋白的总体积是lmL)与lmL弗氏不完全 佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取 血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意（用间接ELISA 法测定抗体效价大于1 X 105)。若满意则心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱(GE healthcare公司产品），严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量 检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为lmg/mL，-20°C保藏备用，至此制得抗MB 蛋白多克隆抗体。
[0033] 4.2)制备检测层
[0034]将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小;将按上述方法制备得到的抗MB蛋白多克隆抗 体和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2. Omg/mL及1. Omg/mL;将稀释好的抗 MB蛋白多克隆抗体装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1 .Oyl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形 成检测线;将稀释好的抗兔IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置l.Oiil/cm的量喷于硝酸纤维 素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为〇.7cm;将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2h，剪 裁成4cm X 4cm的规格，4°C密封干燥保存;至此制得检测层；
[0035] 所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以 及〇. 2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至 100ml；
[0036] 5)组装检测卡
[0037] 5 ? 1)将底板裁剪成4cm X 7 ? 3cm大小，备用；
[0038] 5 ? 2)将吸水滤纸裁剪成4cm X 3cm大小，作为吸水垫，备用；
[0039] 5.3)将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即 带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；
[0040] 5.4)将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端 有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平;再将步骤2)所述的结 合垫按0 ? 3cm重叠于检测层的左边缘处，0 ? 3cm粘于底板上；
[0041] 5.5)将步骤3)所述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与 底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平;将组装好的检测板于切条机下裁成4.0_宽的检测 卡，4°C密封干燥避光保存。
[0042] 作为优选，本发明所提供的试剂盒是基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒时， 所述试剂盒的制备方法是：
[0043] 1)胶体金标记抗体 AbMB3Linearar:
[0044] 1 ? 1)制备30nm胶体金溶液：
[0045] 取一个硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超纯水，将lml 1 % (m/v)HAuCl4溶液加入 250ml三角瓶中并与超纯水混匀，油浴加热并搅拌至沸腾；向250ml三角瓶中快速加入2ml 1 % (m/v)柠檬酸三钠水溶液，溶液继续沸腾lOmin，待250ml三角瓶中的溶液由蓝色转变为 红色时停止加热，将250ml三角瓶中的溶液自然冷却至室温，然后向250ml三角瓶中加入超 纯水补齐至l〇〇ml;
[0046] 1 ? 2)胶体金标记抗体 AbMB3Linear:
[0047] 1.2.1)取一个硅化好的50ml三角瓶，加入10ml步骤1.1)所制备的胶体金溶液，向 胶体金液中加入240111 0.2111〇1/11(2〇)3调节口11至8.5;
[0048] 1.2.2)在电磁搅拌器搅拌下，将抗体AbMB3Linear加入胶体金溶液中，至抗体终浓 度为10ug/ml，加入抗体时逐滴加入，加完后继续搅拌45min~60min;
[0049] 1.2.3)反应完成加入5%(111八)牛血清白蛋白85厶至终浓度为1%(111八），搅拌15~ 30分钟，4 °C保存备用；
[0050] l?2?4)将标记好的抗体AbMB3Linear取出后装入50ml离心管，2500g，4°C离心5分 钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉下层沉淀，上层清液转移至另一只50ml离心管，12000g， 4°C离心30分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉上层清液，将下层沉淀用10ml胶体金缓冲 液重悬沉淀，然后再12000g，4°C离心30分钟，再次得到下层沉淀及上层清液，将下层沉淀最 后用3ml胶体金缓冲液重悬，4°C保存备用，得到含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液； [0051 ] 所述胶体金缓冲液中各组分含量分别是：10mM Tris、l%m/vBSA、l%v/v Tween-20、5 %m/v蔗糖以及3%Qm/v聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，所述胶体金缓冲液的pH为10.5;
[0052] 2)制备结合垫
[0053]将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液中 lh，取出，25 °C干燥后裁成后规格为4cm X 0 ? 6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫； [0054] 3)制备样品垫
[0055]取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少2h，再置于生 物安全柜内37 °C通风干燥后，剪裁成规格为4cm X 1.5cm/条后，即制得样品垫，25 °C密封保 存；
[0056] 所述样品垫处理液的制备方式是称取0.242g Tris、lg牛血清白蛋白BSA、lml吐 温-20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH 调pH至11后用去离子水定容至100ml;
[0057] 4)制备检测层
[0058] 4.1)抗MB蛋白多克隆抗体的制备：
[0059] 4.1.1)相关基因的克隆
[0060] 对3型解脲支原体MB蛋白（其NCBI蛋白质数据库中的accession number为 AAC41437.1)进行生物信息学分析，获取其N端胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽 段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码序列的5'端引入酶切位点Ndel、3'端 弓丨入终止信号TAA和酶切位点Xhol后分别化学合成全基因序列（全序列合成交由金斯瑞生 物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段均分别连于载体PUC57上），记为MB3,其 基因全序列如序列表所示。MB3基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB (accession number:AA(341437.1)的30-150aa。其蛋白质全序列如序列表所示。将含有该段 人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用Ndel及Xhol进行双酶切后按常规方法分别回收目 的片段，备用。同时采用Ndel及Xhol对载体pET-28a( + )进行双酶切，并按常规方法分别将经 双酶切后获得的MB3基因连入pET-28a( + )载体中，并转化大肠杆菌T0P10,构建pET-MB3表达 载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组MB3-His融合蛋白。
[0061 ] 4.1.2)重组MB3-His融合蛋白的表达与纯化
[0062]将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E. coli BL21 (DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50yg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达 菌株。挑取PET-MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中， 于37°C培养过夜。取出菌液后，按1:100接种于100mL含有50yg/mL卡那霉素的LB培养基中， 于37°C培养至0D 6Q() = 0.6时，加入lmol/L IPTG至终浓度为lmmol/L，于37°C摇菌培养，诱导 融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸盐缓冲 液洗涤3次并用10mL上样缓冲液（20mM Na3P〇4,0.5M NaCl; 30mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超 声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心 15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组蛋白MB3-His以可溶性方式存在于菌 体中。
[0063] 重组MB3_His融合蛋白的纯化步骤如下：
[0064] 将上述获得的超声破碎上清液用0.45M1的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品），按照说明书用同样的方法进行纯化。具体方法如下： [0065] 1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0066] 2)用10mL上样缓冲液平衡，lmL/min流速。
[0067] 3)将融合蛋白上样，lmL/min流速。
[0068] 4)用10mL上样缓冲液，以lmL/min流速洗柱。
[0069] 5)用 10mL洗脱缓冲液（20mM Na3P〇4,0.5M NaCl，300mM咪唑，pH7.4)，以lmL/min流 速洗脱，分管收集，每管lml，12%SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。经 bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL。
[0070] 4.1.3)抗MB蛋白多克隆抗体的制备
[0071] 用上述纯化的重组MB3-His融合蛋白按照200yg(200yg重组MB3-His融合蛋白的总 体积是lmL)与lmL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔（由湖北省疾病预防控 制中心提供），于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组 Pl-His融合蛋白按照200yg(200yg重组MB3-His融合蛋白的总体积是lmL)与lmL弗氏不完全 佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取 血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意（用间接ELISA 法测定抗体效价大于1 X 105)。若满意则心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱(GE healthcare公司产品），严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量 检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为lmg/mL，-20°C保藏备用，至此制得抗MB 蛋白多克隆抗体。
[0072] 4.2)制备检测层
[0073]将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小;将按上述方法制备得到的抗MB蛋白多克隆抗 体和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL;将稀释好的抗 MB蛋白多克隆抗体装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1 .Oyl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形 成检测线;将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置l.Oiil/cm的量喷于硝酸纤维 素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为〇.7cm;将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2h，剪 裁成4cm X 4cm的规格，4°C密封干燥保存;至此制得检测层；
[0074] 所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以 及〇. 2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至 100ml；
[0075] 5)组装检测卡
[0076] 5 ? 1)将底板裁剪成4cm X 6cm大小，备用；
[0077] 5 ? 2)将吸水滤纸裁剪成4cm X 2 ? 5cm大小，作为吸水垫，备用；
[0078] 5.3)将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即 带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；
[0079] 5.4)将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端 有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平;再将步骤2)所述的结 合垫按0 ? 2cm重叠于检测层的左边缘处，0 ? 4cm粘于底板上；
[0080] 5.5)将步骤3)所述的样品垫则按一边0.2cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与 底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平;将组装好的检测板于切条机下裁成4.0_宽的检测 卡，4°C密封干燥避光保存。
[0081] 本发明的优点是：
[0082] 本发明提供了抗3型解脲支原体MB蛋白抗体，该抗3型解脲支原体MB蛋白抗体识别 3型解脲支原体MB蛋白105-118位的14个氨基酸所组成的线性抗原表位，3型解脲支原体MB 蛋白在GenBank序列号是AAC41437.1;3型解脲支原体MB蛋白105-118位的14个氨基酸的氨 基酸序列为KLPREPKPNEQLTI;将3型解脲支原体MB蛋白105-118位的14个氨基酸的序列命名 为MB3Linear;抗3型解脲支原体MB蛋白抗体是AbMB3Linear。基于解脲支原体单一线性抗原 表位所制备的上述兔抗3型解脲支原体MB蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成 本低廉的特点，可用于生产各种基于抗原-抗体反应的原理的高灵敏度检测解脲支原体的 检测试剂盒。同时，基于该抗3型解脲支原体MB蛋白抗体还制备得到了两种不同的免疫层析 试剂盒。两种不同的免疫层析试剂盒能快速、准确检测生物样品中的解脲支原体，其均包括 本发明所述的抗体;两种免疫层析试剂盒均可用于解脲支原体感染的辅助诊断，具有更高 的灵敏性与特异性，同时兼顾了简单、快速、稳定以及制造成本低等优势，适用于临床标本 的检查，而且由于可以进行大批量的快速检查，也适合于流行病学调查。因此，本发明所述 的兔抗3型解脲支原体MB蛋白抗体，两种免疫层析试剂盒均具有广泛的应用前景和实用价 值。
【具体实施方式】
[0083] 为了有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，下文特举较佳实施例详细 说明本发明。
[0084] 本申请文件中浓度单位中的"m/v"，当m单位为g时，v单位为mL，属于本领域的常 识。
[0085] 本发明使用或采用的各种材料的来源及相关试剂的配制
[0086] 1、样品垫处理液:称取0.242g Tris，lg牛血清白蛋白（BSA)，1ml吐温-20，5g蔗糖， 〇.3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至11后用去 离子水定容至l〇〇ml。
[0087] 2、磷酸盐保存液:称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、lg牛 血清白蛋白BSA以及0.1 gNaN3，溶解于90ml的去离子水中，用lmo 1 /L NaOH调pH至7.3后用去 离子水定容至l〇〇ml;
[0088] 3、磷酸盐缓冲液(PBS):称取0? 29g磷酸氢二钠，0 ? 0295g磷酸二氢钠，0? 2g氯化钠， 溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
[0089] 4、样品处理液:称取0.0121g三羟甲基氨基甲烷，0.17g氯化钠，0.025g溶菌酶溶解 于90ml去离子水中，用盐酸调pH至8.0后用去离子水定容至100ml。
[0090] 5、抗体AbMB3Linear:为本发明自制，用ros稀释，摇匀，使溶液中抗体浓度为3mg/ ml〇
[0091] 6、抗MB蛋白多克隆抗体：为本发明自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中抗体浓度为 3mg/ml〇
[0092] 7、羊抗兔IgG:为武汉博士德生物工程有限公司产品，用roS稀释，摇匀，使溶液中 多克隆抗体浓度为lmg/ml。
[0093] 8、量子点:本发明中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子 点，其发射波长为565nm，购买自武汉珈源量子点技术开发有限公司，产品名称为羧基水溶 性量子点 _565。
[0094] 9、玻璃纤维素膜:厚度为0 ? 4mm，吸水量为42mg/cm2，玻璃纤维直径为0 ? 6-3M1，具 有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司（型号为BT40)。
[0095] 10、聚酯纤维膜:厚度为0.48mm，吸水速度为18s/4cm，具有极好的亲水性，用于结 合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司（型号为DL42)。
[0096] 11、硝酸纤维素膜：型号为Millipore Corp SHF135,有衬板，购买于Millipore公 司。
[0097] 12、吸水滤纸:厚度为0.95mm，吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm2，具有良好 的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司（型号为CH37K)。 [0098] 13、底板:为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31-40，购买于上海 金标生物科技有限公司。
[0099] 14、解脲支原体:购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC27815。
[0100] 15、本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
[0101]下面结合实施例对本发明所提供的技术方案进行详细说明：
[0102] 实施例1兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的制备
[0103] 兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的制备方法如下：
[0104] 1)经结构生物学分析及相关实验研究后，选定3型解脲支原体MB蛋白（GenBank序 列号AAC41437.1)105-118位的14个氨基酸作为制备兔抗3型解脲支原体MB蛋白抗体的线性 抗原表位，该段氨基酸序为KLPREPKPNEQLTI，将此序列命名为MB3Linear;
[0105] 2)将步骤1)所述的氨基酸序列MB3Linear的C端添加一个半胱氨酸后，用多肽自动 合成仪合成多肽并纯化，纯化后的多肽与载体蛋白KLH偶联，形成MB3Linear-KLH复合蛋白；
[0106] 3)将步骤2)所合成的复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三 次，每次间隔7-10天；
[0107] 4)第三次注射10-12天后，收集、分离得到含有兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位 抗体的血清，ELI SA检测血清中兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的效价，所述抗体的 效价均在1:60000以上；
[0108] 5)将步骤2)合成并纯化的多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联，形成多肽亲和 层析柱；
[0109] 6)将步骤4)获得的含有兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的血清加入到步骤 5)制备的亲和层析柱中，并在4°C孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗3型解脲支原体MB蛋白单 表位抗体;经SDS-PAGE鉴定其纯度均在97 %以上，将这种纯化的抗体命名为AbMB3Linear。
[0110] 本实施例中步骤2)-6)皆是现有成熟技术，多家生物科技公司都可以提供程序化 的技术服务。本实施例中上述步骤中相关实验环节的具体实施，系委托南京金斯瑞生物科 技有限公司完成。
[0111] 本发明所述"抗体"应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性 结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功 能同等物和同源物。抗体的实例是免疫球蛋白亚型（如以6、以￡、以11、18〇和184)及其亚型亚 类;也可以是包含抗原结合结构域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1和双链抗体。
[0112] 实施例2抗MB蛋白多克隆抗体的制备：
[0113] 1)相关基因的克隆
[0114] 对3型解脲支原体MB蛋白（其NCBI蛋白质数据库中的accession number为 AAC41437.1)进行生物信息学分析，获取其N端胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽 段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码序列的5'端引入酶切位点Ndel、3'端 弓丨入终止信号TAA和酶切位点Xhol后分别化学合成全基因序列（全序列合成交由金斯瑞生 物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段均分别连于载体PUC57上），记为MB3,其 基因全序列如序列表所示。MB3基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB (accession number:AA(341437.1)的30-150aa。其蛋白质全序列如序列表所示。将含有该段 人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用Ndel及Xhol进行双酶切后按常规方法分别回收目 的片段，备用。同时采用Ndel及Xhol对载体pET-28a( + )进行双酶切，并按常规方法分别将经 双酶切后获得的MB3基因连入pET-28a( + )载体中，并转化大肠杆菌T0P10,构建pET-MB3表达 载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组MB3-His融合蛋白。
[0115] 2)重组MB3-His融合蛋白的表达与纯化
[0116] 将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21 (DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50yg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达 菌株。挑取PET-MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中， 于37°C培养过夜。取出菌液后，按1:100接种于100mL含有50yg/mL卡那霉素的LB培养基中， 于37°C培养至0D 6Q() = 0.6时，加入lmol/L IPTG至终浓度为lmmol/L，于37°C摇菌培养，诱导 融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸盐缓冲 液洗涤3次并用10mL上样缓冲液（20mM Na3P〇4,0.5M NaCl; 30mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超 声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心 15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组蛋白MB3-His以可溶性方式存在于菌 体中。
[0117] 重组MB3_His融合蛋白的纯化步骤如下：
[0118] 将上述获得的超声破碎上清液用0.45M1的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品），按照说明书用同样的方法进行纯化。具体方法如下：
[0119] a)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0120] b)用10mL上样缓冲液平衡，lmL/min流速。
[0121] c)将融合蛋白上样，lmL/min流速。
[0122] d)用10mL上样缓冲液，以lmL/min流速洗柱。
[0123] e)用 10mL洗脱缓冲液（20mM Na3P〇4,0.5M NaCl，300mM咪唑，pH7.4)，以lmL/min流 速洗脱，分管收集，每管lml，12%SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。经 bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL。
[0124] 3)抗MB蛋白多克隆抗体的制备
[0125] 用上述纯化的重组MB3-His融合蛋白按照200yg(200yg重组MB3-His融合蛋白的总 体积是lmL)与lmL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔（由湖北省疾病预防控 制中心提供），于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组 Pl-His融合蛋白按照200yg(200yg重组MB3-His融合蛋白的总体积是lmL)与lmL弗氏不完全 佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取 血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意（用间接ELISA 法测定抗体效价大于1 X 105)。若满意则心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱(GE healthcare公司产品），严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量 检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为lmg/mL，-20°C保藏备用，至此制得抗MB 蛋白多克隆抗体。
[0126] 实施例3基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒的制备及应用
[0127] 1 ?量子点标记抗体AbMB3Linear
[0128] 向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺(EDC)， 以MES缓冲液（10.66g/L MES，0.74g/L EDTA pH 7.4)定容为lml，不停地混合溶液，37°C反 应5min后，再加入0.34mg的实施例1所制备的抗体AbMB3Linear，避光反应2h，加入单端氨基 聚乙二醇(PEG2000-NH2)至终浓度为l%(m/v)，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应 lh。反应后的样品用超滤管离心（截留分子量100k)，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤 后样品转移至普通EP管内，离心除团聚（10000g，3min)。将上部清液加到分离柱(Superdex-200)上纯化，待其自然流入柱体中，然后用PBS冲洗(液体自然流下），用紫外光照射柱体随 时观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集lml后停止收集。将纯化后的 样品用超滤管（截留分子量l〇〇k)以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心 (10000g，3min)除团聚。获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4°C保存备用。至此制得含 有量子点标记抗体AbMB3Linear的溶液。
[0129] 2.结合垫的制备
[0130] 将聚酯纤维膜浸入步骤1所得到的含有量子点标记抗体AbMB3Linear的溶液中lh， 取出，25°C干燥后裁成后规格为4cmX 0.6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫。
[0131] 3.样品垫的制备
[0132] 取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内 37 °C通风干燥后，剪裁成规格为4cm X 2 ? 5cm/条后，即制得样品垫，25 °C密封保存。
[0133] 4.检测层的制备
[0134] 将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小;将实施例2制备得到的抗MB蛋白多克隆抗体 和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2. Omg/mL及1. Omg/mL;将稀释好的兔抗 重组Pl-His融合蛋白多克隆抗体IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置l.Oyl/cm的量喷于硝 酸纤维素膜上，形成检测线;将稀释好的抗兔IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1. Oiil/cm 的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为〇. 7cm;将喷好的硝酸纤维素 膜37 °C干燥2h，剪裁成4cm X 4cm的规格，4 °C密封干燥保存;至此制得检测层。
[0135] 5.检测卡的组装
[0136] 将底板裁剪成4cmX 7.3cm大小，备用。
[0137] 将吸水滤纸裁剪成4cm X 3cm大小，作为吸水垫，备用。
[0138] 组装工作于生物安全柜内操作，首先将底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4所述的 检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并小心抹平膜面。其次，将事 先裁好的吸水垫组装到底板上，使其左边与检测层右末端有〇. 2cm的重叠，其右边缘则与底 板的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将步骤2所述的结合垫按0.3cm重叠于检测层的左边缘 处，0.3cm粘于底板7上。最后将步骤3所述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘 处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁 成4.0_宽的检测卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0139] 6.基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒的组成
[0140] 基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒由步骤5所述的检测卡及样品处理液所组 成。
[0141] 7.基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒的使用方法
[0142] 按常规方法获得待检者的尿液样品500yl，将其加入到装有500yl样品处理液的塑 料管中，室温放置10分钟后取出120iiL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外分析仪下 (型号为WD-9403A，北京六一仪器厂生产，紫外激发波长365nm)观察检测结果。若尿液样品 中含有解脲支原体抗原，贝与结合垫中的量子点标记的抗体AbMB3Linear结合，通过层析作 用先与硝酸纤维素膜上的抗MB蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在检测线处会形成 肉眼可见的一条焚光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与羊抗兔IgG结合后在 紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线;若待检尿液样品中无相关抗原，则仅出 现一条焚光质控线。如果焚光质控线未出现，则该检测卡失效。
[0143] 8.基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒的应用效果举例
[0144] 本实施例中所指的基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒的使用方法参照步骤7 所述的操作步骤。
[0145] 1)特异性试验
[0146] 用致病性病原体如人肺炎支原体(ATCC15531)、嗜肺军团菌(ATCC 33152)、人III 型副流感病毒病毒(ATCC VR-93)、人流感嗜血杆菌(ATCC 53781)、肺炎衣原体(AR-39株， ATCC编号53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC编号VR-3)、人腺病毒7型(Gomen株，ATCC编号VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC编号VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC编号VR-790)、人呼吸 道合胞病毒(ATCC编号VR26)、肺炎链球菌(ATCC编号700670)等代替解脲支原体进行检测， 试剂盒检测含这些微生物的磷酸盐缓冲液稀释液都为阴性。
[0147] 2)临床测试例
[0148] 以解脲支原体检测"金标准培养法作为参照，取100例泌尿科尿道感染者的尿液 标本用步骤6所述的试剂盒进行检测，培养法阳性率为26%(26/100)，本试剂盒为25% (25/ 100)，2种方法的符合率为％ (95/100)。具体结果如表1所示。
[0149] 表1临床标本的检测结果
[0151 ]实施例3基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒的制备及应用 [0152] 1 ?胶体金标记抗体AbMB3Linear [0153] a.30nm胶体金的制备
[0154] 取一硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超纯水，将lml 1 % (m/v)HAuC14溶液加入其 中混匀，油浴加热并搅拌至沸腾。向其中快速加入2ml 1 % (m/v)柠檬酸三钠水溶液，溶液继 续沸腾l〇min(这个过程中溶液由蓝色转变为红色）。停止加热，让溶液自然冷却至室温，然 后向其中加入超纯水补齐至l〇〇ml。
[0155] b ?胶体金标记抗体AbMB3Linear
[0156] 1)取一硅化好的50ml三角瓶，加入10ml步骤a所制备的胶体金金液，向金液中加入 24〇1110.2111〇1/11(2〇)3调节?11至8.5;
[0157] 2)在电磁搅拌器搅拌下，将抗体AbMB3Linear加入胶体金溶液中，至抗体终浓度为 10ug/ml，加入抗体时应逐滴加入，加完后继续搅拌45min~60min;
[0158] 3)反应完成加入5%(m/v)牛血清白蛋白（BSA)至终浓度为l%(m/v)，搅拌15~30 分钟，4°C保存备用。
[0159] 4)将标记好的抗体AbMB3Linear取出后装入50ml离心管，2500g，4°C离心5分钟，得 到下层沉淀及上层清液，弃掉下层沉淀，上层清液转移至另一只50ml离心管，12000g，4°C离 心30分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉上层清液，将下层沉淀用10ml胶体金缓冲液重悬 沉淀，然后再12000g，4°C离心30分钟，再次得到下层沉淀及上层清液，将下层沉淀最后用 3ml胶体金缓冲液重悬，4°C保存备用，得到含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液；
[0160] 上述胶体金缓冲液中各组分含量分别是：10mM Tris、l%(m/V)BSA、l%(V/v) !'冊611-20、5%(111八)蔗糖以及3%。(111八)聚乙烯吡咯烷酮?￥?-10，所述胶体金缓冲液的口11为 10.5〇
[0161] 2.结合垫的制备
[0162] 将聚酯纤维膜浸入步骤1所得到的含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液中lh， 取出，25°C干燥后裁成后规格为4cmX 0.6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫。
[0163] 3.样品垫的制备
[0164] 取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少2h，再置于生物安全柜内 37 °C通风干燥后，剪裁成规格为4cm X 2 ? 5cm/条后，即制得样品垫，25 °C密封保存。
[0165] 4.检测层的制备
[0166] 将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小;将实施例2制备得到的抗MB蛋白多克隆抗体 和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2. Omg/mL及1. Omg/mL;将稀释好的兔抗 重组Pl-His融合蛋白多克隆抗体IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置l.Oyl/cm的量喷于硝 酸纤维素膜上，形成检测线;将稀释好的抗兔IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1. Oiil/cm 的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为〇. 7cm;将喷好的硝酸纤维素 膜37 °C干燥2h，剪裁成4cm X 4cm的规格，4 °C密封干燥保存;至此制得检测层。
[0167] 5.检测卡的组装
[0168] 将底板裁剪成4cm X 6cm大小，备用。
[0169] 将吸水滤纸裁剪成4cm X 2 ? 5cm大小，作为吸水垫，备用。
[0170] 组装工作于生物安全柜内操作，首先将底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4所述的 检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并小心抹平膜面。其次，将事 先裁好的吸水垫组装到底板上，使其左边与检测层右末端有〇. 2cm的重叠，其右边缘则与底 板的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将步骤2所述的结合垫按0.2cm重叠于检测层3的左边 缘处，0.4cm粘于底板上。最后将步骤3所述的样品垫则按一边0.2cm重叠于结合垫的左边缘 处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁 成4.0_宽的检测卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0171] 6.基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒的组成
[0172] 基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒由步骤5所述的检测卡及样品处理液所组 成。
[0173] 7.基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒的使用方法
[0174] 按常规方法获得待检者的尿液样本500yl，将其加入到装有500yl样品处理液的塑 料管中，50°C水浴20min后，后取出120yL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后肉眼观察检测结 果。若尿液样本中含有解脲支原体抗原，贝与结合垫中的胶体金标记的抗体AbMB3Linear结 合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的抗MB蛋白多克隆抗体结合后在在检测线处会形成 肉眼可见的一条红色检测线，未结合完的胶体金标记抗体继续层析与羊抗兔IgG结合后形 成肉眼可见的第二条红色质控线;若待检尿液样本中无相关抗原，则仅出现一条红色质控 线。如果红色质控线未出现，则该检测卡失效。
[0175] 8.基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒的应用效果举例
[0176] 本实施例中所指的基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒的使用方法参照步骤7 所述的操作步骤。
[0177] 1)特异性试验
[0178] 用常见病原体如嗜肺军团菌(ATCC 33152)、1型人副流感病毒(ATCC VR-94)、II型 人副流感病毒（ATCC VR-92)、III型人副流感病毒病毒（ATCC VR-93)、人流感嗜血杆菌 (ATCC 53781)、肺炎衣原体(AR-39株，ATCC编号53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC编号VR-3)、人腺病毒7型(Gomen株，ATCC编号VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC编号VR-1743)、人 乙型流感病毒(ATCC编号VR-790)、人呼吸道合胞病毒(ATCC编号VR26)、肺炎链球菌(ATCC编 号700670)等代替解脲支原体进行检测，试剂盒检测含这些微生物的磷酸盐缓冲液稀释液 都为阴性。
[0179] 2)临床测试例
[0180] 以解脲支原体检测"金标准培养法作为参照，取100例泌尿科尿道感染者的尿液 标本用步骤6所述的试剂盒进行检测，培养法阳性率为26% (26/100)，本试剂盒为24% (24/ 100)，2种方法的符合率为96% (96/100)。具体结果如表1所示。
[0181] 表1临床标本的检测结果
[0183]需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡 在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本发明的保护范围之 内。
【主权项】
1. 一种抗3型解脲支原体MB蛋白抗体，其特征在于:所述抗3型解脲支原体MB蛋白抗体 是识别3型解脲支原体MB蛋白105-118位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，所述3型解 脲支原体MB蛋白在GenBank序列号是AAC41437.1;所述3型解脲支原体MB蛋白105-118位的 14个氨基酸序列为KLPREPKPNEQLTI;将3型解脲支原体MB蛋白105-118位的14个氨基酸的序 列命名为MB3Linearar;所述抗解脲支原体3型MB蛋白抗体是AbMB3Linearar。2. -种基于如权利要求1所述的抗3型解脲支原体MB蛋白抗体所形成的免疫层析试剂 盒，其特征在于:所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记 技术的免疫层析试剂盒。3. 根据权利要求2所述的抗3型解脲支原体MB蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特 征在于:所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法 是： 1) 量子点标记抗体AbMB3Linearar: 向微量离心管中依次加入0.4 nmol羧基水溶性量子点和800 nmol碳二亚胺EDC，以MES 缓冲液定容为1 ml，混合溶液，37 °C反应5 min后，再加入0.34 mg的制备得到的抗体 AbMB3Linearar，避光反应2 h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为l%m/v，封闭 未反应的活化羧基位点，继续避光反应1 h;反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min， 至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀， 10000g条件下离心3min;将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流 入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时 开始收集，收集1 ml后停止收集;将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转 移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min;获取上清后以磷 酸盐保存液稀释200倍，4°C保存备用；至此制得含有量子点标记抗体AbMB3Linearar的溶 液； 所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA，所述MES缓 冲液的pH 7.4; 所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠、0.2 g 氯化钠、1 g牛血清白蛋白BSA以及0.1 gNaN3,溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH 调pH至7.3后用去离子水定容至100 ml; 2) 制备结合垫 将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有量子点标记抗体AbMB3Linearar的溶液中1 h， 取出，25°C干燥后裁成后规格为4cm X 0 · 6cm/条后，4 °C密封保存备用，至此制得结合垫； 3) 制备样品垫 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3 h，再置于生物安 全柜内37 °C通风干燥后，剪裁成规格为4cm X 2 · 5cm/条后，即制得样品垫，25 °C密封保存； 所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠、0.2 g 氯化钠、2 g牛血清白蛋白BSA、1 ml吐温-20、2 g蔗糖以及0.5 g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10， 溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100 ml; 4) 制备检测层 4.1)抗MB蛋白多克隆抗体的制备： 4.1.1) 相关基因的克隆 对3型解脲支原体MB蛋白进行生物信息学分析，获取3型解脲支原体MB蛋白N端胞外保 守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码 序列的5 '端引入酶切位点M/el、3 '端引入终止信号TAA和酶切位点处〇1后分别化学合成全 基因序列，记为細化?基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB的30-150aa;将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用是/61及处〇1进行双酶切后按常 规方法分别回收目的片段，备用；同时采用M/el及处 〇1对载体pET-28a( + )进行双酶切，并按 常规方法分别将经双酶切后获得的基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌 T0P10，构建pET-MB3表达载体;经酶切和序列测定证实表达载体构建无误;该载体表达重组 MB3-His融合蛋白； 4.1.2) 重组MB3-His融合蛋白的表达与纯化 将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态i coii BL21(DE3) 中，转化完成后将菌液涂布于含50 yg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株； 挑取PET-MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100 mL LB培养基中，于37 °C培养过夜；取出菌液后，按1:100接种于100 mL含有50 yg/mL卡那霉素的LB培养基中，于 37°C培养至0D6q()=0.6时，加入1 mol/L IPTG至终浓度为1 mmol/L，于37°C摇菌培养，诱导融 合蛋白表达;诱导4 h后于8000 r/min下离心10 min收集菌体;将此菌体用20 mL磷酸盐缓 冲液洗涤3次并用10 mL上样缓冲液重悬后进行超声破碎，操作条件为:50 HZ，200 W，超声3 S，间歇5 S，工作100次;超声完成后，12000 g离心15 min分别收集沉淀和上清后进行电泳 检测;发现重组蛋白MB3-His以可溶性方式存在于菌体中； 所述上样缓冲液中各组分含量分别是：20 mM Na3P〇4,0.5 M NaCl以及30 mM咪唑；所 述上样缓冲液的PH7.4; 重组MB3-His融合蛋白的纯化步骤如下： 将上述获得的超声破碎上清液用0.45 μπι的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns，按照说明书用同样的方法进行纯化;具体方法如下： a) 用5 mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1 mL/min流速洗柱； b) 用10 mL上样缓冲液平衡，1 mL/min流速； c) 将融合蛋白上样，1 mL/min流速； d) 用10 mL上样缓冲液，以1 mL/min流速洗柱； e) 用10 mL洗脱缓冲液，以1 mL/min流速洗脱，分管收集，每管1 ml，12% SDS-PAGE检 测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品;经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整 浓度为0.2 mg/mL; 所述洗脱缓冲液中各组分含量分别是:20 mM Na3P〇4,0.5 M NaCl以及300 mM咪唑，所 述洗脱缓冲液的PH7.4; 4.1.3) 抗MB蛋白多克隆抗体的制备 用上述纯化的重组MB3-His融合蛋白按照200 yg与lmL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫 雄性新西兰大白兔，于背部皮下多点注射，间隔7 d后再免疫一次，再过14 d后用上述纯化 的重组Pl-His融合蛋白按照200 yg与1 mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强 免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次;7 d后取血分析抗体滴度;直至抗体滴度用间 接ELISA法测定抗体效价大于1 X 105后心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱，严格 按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并 用磷酸盐缓冲液调整为1 mg/mL，-2(TC保藏备用，至此制得抗MB蛋白多克隆抗体； 4.2) 制备检测层 将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小;将步骤4.1)制备得到的抗MB蛋白多克隆抗体和羊 抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0 mg/mL及1.0 mg/mL;将稀释好的抗MB蛋 白多克隆抗体装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1.0 μL/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检 测线;将稀释好的抗兔IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1.0 μL/cm的量喷于硝酸纤维素 膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7 cm;将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2 h，剪 裁成4cm X 4cm的规格，4°C密封干燥保存;至此制得检测层； 所述磷酸盐缓冲液的制备方式是:称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠以及 0.2 g氯化钠，溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至 100 ml； 5)组装检测卡 5.1) 将底板裁剪成4cm X 7.3cm大小，备用； 5.2 )将吸水滤纸裁剪成4cm X 3cm大小，作为吸水垫，备用； 5.3) 将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即带有 质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面； 5.4) 将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有 0.2 cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平;再将步骤2)所述的结 合垫按0.3 cm重叠于检测层的左边缘处，0.3 cm粘于底板上； 5.5) 将步骤3)所述的样品垫则按一边0.3 cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板 的左边缘对齐，粘于底板上并抹平;将组装好的检测板于切条机下裁成4.0 mm宽的检测卡， 4 °C密封干燥避光保存。4.根据权利要求2所述的抗3型解脲支原体MB蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特 征在于:所述试剂盒是基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法 是： 1)胶体金标记抗体AbMB3Linearar: 1.1) 制备30 nm胶体金溶液： 取一个硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超纯水，将1 ml l%m/v HAuCl4溶液加入250ml 三角瓶中并与超纯水混匀，油浴加热并搅拌至沸腾；向250ml三角瓶中快速加入2ml l%m/v 柠檬酸三钠水溶液，溶液继续沸腾l〇min，待250ml三角瓶中的溶液由蓝色转变为红色时停 止加热，将250ml三角瓶中的溶液自然冷却至室温，然后向250ml三角瓶中加入超纯水补齐 至100ml; 1 · 2)胶体金标记抗体AbMB3Linear: 1.2.1) 取一个硅化好的50ml三角瓶，加入10 ml步骤1.1)所制备的胶体金溶液，向胶体 金液中加入240111 0.2 111〇1/11(2〇)3调节?!1至8.5; 1.2.2) 在电磁搅拌器搅拌下，将抗体AbMB3Linear加入胶体金溶液中，至抗体终浓度为 10 ug/ml，加入抗体时逐滴加入，加完后继续搅拌45 min~60 min; 1.2.3) 反应完成加入5%111八牛血清白蛋白85厶至终浓度为1%111八，搅拌15~30分钟，4 °C保存备用； 1.2.4) 将标记好的抗体AbMB3Linear取出后装入50ml离心管，2500g，4°C离心5分钟，得 到下层沉淀及上层清液，弃掉下层沉淀，上层清液转移至另一只50ml离心管，12000g，4°C离 心30分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉上层清液，将下层沉淀用10 ml胶体金缓冲液重 悬沉淀，然后再12000g，4°C离心30分钟，再次得到下层沉淀及上层清液，将下层沉淀最后用 3ml胶体金缓冲液重悬，4°C保存备用，得到含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液； 所述胶体金缓冲液中各组分含量分别是：10mM Tris、l%m/vBSA、l% v/v Tween-20、5% 111八蔗糖以及3%。111八聚乙烯吡咯烷酮?￥?-10，所述胶体金缓冲液的?!1为10.5; 2) 制备结合垫 将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液中1 h，取 出，25°C干燥后裁成后规格为4cm X 0 · 6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫； 3) 制备样品垫 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少2 h，再置于生物安 全柜内37 °C通风干燥后，剪裁成规格为4cm X 1 · 5cm/条后，即制得样品垫，25 °C密封保存； 所述样品垫处理液的制备方式是称取〇.242g Tris、lg牛血清白蛋白BSA、1 ml吐温-20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10,溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH 调pH至11后用去离子水定容至100 ml; 4) 制备检测层 4.1) 抗MB蛋白多克隆抗体的制备： 4.1.1) 相关基因的克隆 对3型解脲支原体MB蛋白进行生物信息学分析，获取3型解脲支原体MB蛋白N端胞外保 守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码 序列的5 '端引入酶切位点M/el、3 '端引入终止信号TAA和酶切位点处〇1后分别化学合成全 基因序列，记为細化?基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB的30-150aa;其蛋白质全序列如序列表所示;将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用 M/el及处〇1进行双酶切后按常规方法分别回收目的片段，备用；同时采用M/el及处〇1对载 体pET-28a( + )进行双酶切，并按常规方法分别将经双酶切后获得的燃3基因连入pET-28a (+ )载体中，并转化大肠杆菌T0P10,构建pET-MB3表达载体;经酶切和序列测定证实表达载 体构建无误;该载体表达重组MB3-His融合蛋白； 4.1.2) 重组MB3-His融合蛋白的表达与纯化 将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态i coii BL21(DE3) 中，转化完成后将菌液涂布于含50 yg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株； 挑取PET-MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100 mL LB培养基中，于37 °C培养过夜；取出菌液后，按1:100接种于100 mL含有50 yg/mL卡那霉素的LB培养基中，于 37°C培养至0D6q()=0.6时，加入1 mol/L IPTG至终浓度为1 mmol/L，于37°C摇菌培养，诱导融 合蛋白表达;诱导4 h后于8000 r/min下离心10 min收集菌体;将此菌体用20 mL磷酸盐缓 冲液洗涤3次并用10 mL上样缓冲液重悬后进行超声破碎，操作条件为:50 HZ，200 W，超声3 S，间歇5 S，工作100次;超声完成后，12000 g离心15 min分别收集沉淀和上清后进行电泳 检测;发现重组蛋白MB3-His以可溶性方式存在于菌体中； 所述上样缓冲液中各组分含量分别是：20 mM Na3P〇4,0.5 M NaCl以及30 mM咪唑；所 述上样缓冲液的PH7.4; 重组MB3-His融合蛋白的纯化步骤如下： 将上述获得的超声破碎上清液用0.45 μπι的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns，按照说明书用同样的方法进行纯化;具体方法如下： a) 用5 mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1 mL/min流速洗柱； b) 用10 mL上样缓冲液平衡，1 mL/min流速； c) 将融合蛋白上样，1 mL/min流速； d) 用10 mL上样缓冲液，以1 mL/min流速洗柱； e) 用10 mL洗脱缓冲液，以1 mL/min流速洗脱，分管收集，每管1 ml，12% SDS-PAGE检 测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品;经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整 浓度为0.2 mg/mL; 所述洗脱缓冲液中各组分含量分别是:20 mM Na3P〇4,0.5 M NaCl以及300 mM咪唑，所 述洗脱缓冲液的PH7.4; 4.1.3)抗MB蛋白多克隆抗体的制备 用上述纯化的重组MB3-His融合蛋白按照200 yg与lmL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫 雄性新西兰大白兔，于背部皮下多点注射，间隔7 d后再免疫一次，再过14 d后用上述纯化 的重组Pl-His融合蛋白按照200 yg与1 mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强 免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次;7 d后取血分析抗体滴度;直至抗体滴度用间 接ELISA法测定抗体效价大于1 X 105后心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱，严格 按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并 用磷酸盐缓冲液调整为1 mg/mL，-2(TC保藏备用，至此制得抗MB蛋白多克隆抗体； 4.2) 制备检测层 将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小;将步骤4.1)制备得到的抗MB蛋白多克隆抗体和羊 抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0 mg/mL及1.0 mg/mL;将稀释好的抗MB蛋 白多克隆抗体装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1.0 μL/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检 测线;将稀释好的抗兔IgG装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1.0 μL/cm的量喷于硝酸纤维素 膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7 cm;将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2 h，剪 裁成4cm X 4cm的规格，4°C密封干燥保存;至此制得检测层； 所述磷酸盐缓冲液的制备方式是:称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠以及 0.2 g氯化钠，溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至 100 ml； 5)组装检测卡 5.1)将底板裁剪成4cm X 6cm大小，备用； 5.2 )将吸水滤纸裁剪成4cm X 2.5cm大小，作为吸水垫，备用； 5.3) 将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即带有 质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面； 5.4) 将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有 0.2 cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平;再将步骤2)所述的结 合垫按0 · 2cm重叠于检测层的左边缘处，0 · 4 cm粘于底板上； 5.5) 将步骤3)所述的样品垫则按一边0.2 cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板 的左边缘对齐，粘于底板上并抹平;将组装好的检测板于切条机下裁成4.0 mm宽的检测卡， 4 °C密封干燥避光保存。
【文档编号】G01N33/569GK105968197SQ201610318423
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】胡征, 董俊, 杨波
【申请人】湖北工业大学, 湖北华龙生物制药有限公司