一种生物农药人工抗原合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物农药人工抗原合成方法，包括以下步骤：S1、直接对农药分子的原药进行衍生化；S2、利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原，或者从农药分子生产过程的中间产物中选取化合物合成半抗原；S3、由原料重新合成半抗原；S4、间隔臂的选择：选取中等尺度的间隔臂，即3~6碳原子；S5、半抗原与载体的偶联；S6、人工抗原的筛选、纯化和鉴定，本发明成功率高，易于确立最佳的偶联点和构建合理的间隔臂，使产生针对特征结构的抗体的可能性增大，载体可增加半抗原的免疫原性，容易合成，工作量较小，周期较短，成本较低。
【专利说明】
一种生物农药人工抗原合成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种生物农药人工抗原合成方法。
【背景技术】
[0002] 农药残留已成为近年来威胁百姓餐桌安全的"隐形杀手"，而且殃及农产品出口， 且有愈演愈烈之势。传统的农药残留分析方法包括气相色谱、液相色谱、质谱、薄层层析等， 这些方法需要复杂昂贵的仪器，而且需要经过繁琐的前处理，专门的操作人员，很难达到快 速、简便的现场检测要求。酶免疫分析是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作 用原理有机结合起来的一种免疫分析技术，是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，在现 场筛选和大量样本的快速监测中显示其独特的优势。大多数农药是小分子物质（分子质量 小于1000)，本身不具有诱导产生抗体的能力，必须设法先将农药小分子与载体蛋白质偶联 制备出农药人工完全抗原，这是农药酶免疫分析的关键所在，如合适中间体、活性官能团引 入位点的选择、半抗原产物的分离纯化、偶联臂的长短、半抗原与载体分子的偶联比等，因 此，农药人工抗原的分子设计、合成以及农药人工抗原的优选将直接影响能否制备出高质 量的抗体。
【发明内容】
[0003] 为解决【背景技术】中存在的技术问题，本发明提出一种生物农药人工抗原合成方 法，成功率高，易于确立最佳的偶联点和构建合理的间隔臂，使产生针对特征结构的抗体的 可能性增大。
[0004] 为此，本发明提供了一种生物农药人工抗原合成方法，包括以下步骤： 51、 直接对农药分子的原药进行衍生化:第一步，选定农药待测物后，利用待测物现有 结构，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团，第二步，对其分子进行改造 使分子内产生氨基基团； 52、 利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原，或者从农药分子生产过程的中间 产物中选取化合物合成半抗原； 53、 由原料重新合成半抗原:在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子 参与反应，从而合成出有反应功能团的半抗原分子； 54、 间隔臂的选择:选取中等尺度的间隔臂，即3~6碳原子； 55、 半抗原与载体的偶联:第一步，先选择偶联点，如果一个农药分子内有多个不同的 偶联点时，利用不同位点都合成出人工抗原，然后通过比较筛选出最好的人工抗原用于制 备抗体作为检测;第二步，偶联方法的选择，第三步，偶联比的选择。
[0005] S6、人工抗原的筛选、纯化和鉴定。
[0006] 优选的，所述S3中合成的半抗原的特征集团还需要进行保护，用对甲氧基苯丁酸 与48%氢溴酸反应生成4-羟基苯基丁酸，然后与叔丁基二甲基氯硅烷反应形成硅烷酯以保 护羧基，再与二乙基硫代磷酰氯发生酯化反应，最后加入适量盐酸，水解脱去保护基团即可 得到目标产物。
[0007] 优选的，所述载体为血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血 清白蛋白、多聚赖氨酸PLL其中的任意一种，其在在不同的pH和离子强度下均有较大的溶解 度，在含有有机溶剂的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态。
[0008] 优选的，所述步骤S5中，有的半抗原中含有较长的直链可直接与载体偶联，大多数 的半抗原是通过间隔臂与载体偶联。
[0009] 优选的，所述步骤S5第二步，偶联方法包括一下六种： (1) 通过羧基连接的混合酸酐法和碳二亚胺法； (2) 通过羟基连接的琥珀酸酐法； (3) 通过醛基连接的戊二醛法； (4) 通过酚基连接的重氮化法； (5) 通过氨基连接的Mannich反应和丙稀酸法； (6) 通过酮基连接的氨基氧乙酸法。
[0010] 优选的，所述步骤S5中第三步，偶联比的选择通过调节半抗原与载体的摩尔比、反 应的pH值、温度、离子强度来控制结合比，即偶联比。
[0011] 优选的，所述S6中筛选的方法为:在半抗原的设计中从不同位置引入不同性质、长 度的连接臂，所合成的半抗原与多种载体相结合，采用不同的投料比，控制反应条件，最终 得到不同性质、不同结合比的人工抗原，同时进行免疫试验，以达到优化筛选的目的。
[0012] 优选的，所述S6中纯化采用透析或凝胶层析的方法。
[0013]优选的，所述S6中对人工抗原进行鉴定，一方面定性判断半抗原与载体是否偶联 成功;另一方面定量测定结合比和蛋白质含量。
[0014] 本发明提出的一种生物农药人工抗原合成方法，成功率高，易于确立最佳的偶联 点和构建合理的间隔臂，使产生针对特征结构的抗体的可能性增大，载体可增加半抗原的 免疫原性，容易合成，工作量较小，周期较短，成本较低。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明具体实施例所述的一种生物农药人工抗原合成方法的流程图。
【具体实施方式】
[0016] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0017] 实施例： 一种生物农药人工抗原合成方法，包括以下步骤： 51、 直接对农药分子的原药进行衍生化:第一步，选定农药待测物后，利用待测物现有 结构，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团，第二步，对其分子进行改造 使分子内产生氨基基团； 52、 利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原，或者从农药分子生产过程的中间 产物中选取化合物合成半抗原； 53、 由原料重新合成半抗原:在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子 参与反应，从而合成出有反应功能团的半抗原分子;合成的半抗原的特征集团还需要进行 保护，用对甲氧基苯丁酸与48%氢溴酸反应生成4-羟基苯基丁酸，然后与叔丁基二甲基氯硅 烷反应形成硅烷酯以保护羧基，再与二乙基硫代磷酰氯发生酯化反应，最后加入适量盐酸， 水解脱去保护基团即可得到目标产物。
[0018] S4、间隔臂的选择:公认一定长度的间隔臂的引入可使半抗原突出于载体表面，易 为机体免疫系统识别，使产生针对半抗原的抗体的可能性增加，在选择间隔臂时应注意以 下几点：一是太长的间隔臂会因氢键或疏水作用导致半抗原分子发生折叠，反而使半抗原 与载体蛋白靠近，导致载体蛋白屏蔽其特征基团；而太短的间隔臂会因载体的空间位阻影 响，免疫系统对半抗原的识别，选取中等尺度的间隔臂，即3~6碳原子； 55、 半抗原与载体的偶联:有的半抗原中含有较长的直链可直接与载体偶联，大多数的 半抗原是通过间隔臂与载体偶联;所述载体为血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔 血清白蛋白、人血清白蛋白、多聚赖氨酸PLL其中的任意一种，其在在不同的pH和离子强度 下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保 持可溶状态； 第一步，先选择偶联点，如果一个农药分子内有多个不同的偶联点时，利用不同位点都 合成出人工抗原，然后通过比较筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测； 第二步，偶联方法的选择： 偶联方法包括一下六种： (1) 通过羧基连接的混合酸酐法和碳二亚胺法； (2) 通过羟基连接的琥珀酸酐法； (3) 通过醛基连接的戊二醛法； (4) 通过酚基连接的重氮化法； (5) 通过氨基连接的Mannich反应和丙稀酸法； (6) 通过酮基连接的氨基氧乙酸法。
[0019]第三步，偶联比的选择:偶联比（每分子载体上所连接半抗原的平均数目，又称为 结合比）对抗体的生成有一定的影响，不同待测物，不同载体其最佳结合比可能不同，适宜 的结合比有助于提高抗体的亲和力和选择性，偶联比的选择通过调节半抗原与载体的摩尔 比、反应的pH值、温度、离子强度来控制结合比，即偶联比； 56、 人工抗原的筛选、纯化和鉴定： 筛选的方法为:在半抗原的设计中从不同位置引入不同性质、长度的连接臂，所合成的 半抗原与多种载体相结合，采用不同的投料比，控制反应条件，最终得到不同性质、不同结 合比的人工抗原，同时进行免疫试验，以达到优化筛选的目的； 纯化采用透析或凝胶层析的方法，透析一般所需时间较长(通常需2 d以上），纯化较为 彻底、操作相对简单。凝胶层析所需时间较短，但操作相对复杂，需要对流出组分进行跟踪 分析，以确定目标组分。
[0020]对人工抗原进行鉴定，一方面定性判断半抗原与载体是否偶联成功；另一方面定 量测定结合比和蛋白质含量，判断是否偶联成功最常用的为紫外扫描法，如果人工抗原的 紫外吸收特征兼具有或不同于原半抗原和载体蛋白的紫外吸收特征，则可初步判断偶联成 功。结合比的测定可以采用紫外分光光度法、标记抗原示踪法、元素分析法和红外光谱法等 方法。常用农药人工抗原的分子设计、合成与优选归纳见表1。
[0021] 本发明提出的一种生物农药人工抗原合成方法，成功率高，易于确立最佳的偶联 点和构建合理的间隔臂，使产生针对特征结构的抗体的可能性增大，载体可增加半抗原的 免疫原性，容易合成，工作量较小，周期较短，成本较低。
[0022] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 直接对农药分子的原药进行衍生化:第一步，选定农药待测物后，利用待测物现有 结构，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团，第二步，对其分子进行改造 使分子内产生氨基基团； 52、 利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原，或者从农药分子生产过程的中间 产物中选取化合物合成半抗原； 53、 由原料重新合成半抗原:在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子 参与反应，从而合成出有反应功能团的半抗原分子； 54、 间隔臂的选择:选取中等尺度的间隔臂，即3~6碳原子； 55、 半抗原与载体的偶联:第一步，先选择偶联点，如果一个农药分子内有多个不同的 偶联点时，利用不同位点都合成出人工抗原，然后通过比较筛选出最好的人工抗原用于制 备抗体作为检测;第二步，偶联方法的选择，第三步，偶联比的选择； 56、 人工抗原的筛选、纯化和鉴定。2. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述S3中合成的 半抗原的特征集团还需要进行保护，用对甲氧基苯丁酸与48%氢溴酸反应生成4-羟基苯基 丁酸，然后与叔丁基二甲基氯硅烷反应形成硅烷酯以保护羧基，再与二乙基硫代磷酰氯发 生酯化反应，最后加入适量盐酸，水解脱去保护基团即可得到目标产物。3. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述载体为血清 白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、多聚赖氨酸PLL其中的 任意一种，其在在不同的pH和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂的情况下均 可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态。4. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述步骤S5中， 有的半抗原中含有较长的直链可直接与载体偶联，大多数的半抗原是通过间隔臂与载体偶 联。5. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述步骤S5第二 步，偶联方法包括一下六种： (1) 通过羧基连接的混合酸酐法和碳二亚胺法； (2) 通过羟基连接的琥珀酸酐法； (3) 通过醛基连接的戊二醛法； (4) 通过酚基连接的重氮化法； (5) 通过氨基连接的Mannich反应和丙稀酸法； (6) 通过酮基连接的氨基氧乙酸法。6. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述步骤S5中第 三步，偶联比的选择通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应的pH值、温度、离子强度来控制 结合比，即偶联比。7. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述S6中筛选的 方法为:在半抗原的设计中从不同位置引入不同性质、长度的连接臂，所合成的半抗原与多 种载体相结合，采用不同的投料比，控制反应条件，最终得到不同性质、不同结合比的人工 抗原，同时进行免疫试验，以达到优化筛选的目的。8. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述S6中纯化采 用透析或凝胶层析的方法。9. 如权利要求1所述的一种生物农药人工抗原合成方法，其特征在于，所述S6中对人工 抗原进行鉴定，一方面定性判断半抗原与载体是否偶联成功；另一方面定量测定结合比和 蛋白质含量。
【文档编号】C07K14/765GK105968192SQ201610423088
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】周启新
【申请人】周启新